TRMT6/TRMT61A抑制剂在肝癌治疗中的应用

技术领域

本发明提供了TRMT6/TRMT61A抑制剂抑制肝癌干细胞的应用。

背景技术

原发性肝癌是全球五大常见恶性肿瘤之一，中国占了全球新发和死亡病例的一半以上，位居世界之首。原发性肝癌包括肝细胞癌、胆管癌及混合型癌。肝细胞癌是原发性肝癌的主要病理亚型，约占80％。目前，外科手术治疗和肝脏移植是主要的治疗肝细胞癌的方法，但绝大多数患者伴随着肝硬化和严重的肝功能缺陷，且大部分肝癌患者发现较晚，所以只有少数的患者适于外科治疗，且复发率极高。化疗药物毒副作用大，极易产生耐药，不能有效延长生存期。因此，阐明肝细胞癌的发生机制是有效治疗肝癌的迫切需要。

对于多数恶性肿瘤患者而言，现有的治疗方法无法从根本上治愈肿瘤。近年来，肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell，CSC)学说受到越来越多人的高度关注。在肿瘤组织中，只有极少量的致瘤性细胞亚群具有无限增生的潜能，具有自我更新能力(self-renewal)和可塑性(plasticity)，能产生异质性肿瘤细胞，且对化疗药物和靶向性药物有耐药性，在启始肿瘤形成和发展中起着重要作用，这可能是导致多种肿瘤复发、转移和耐药的主要原因。现有的治疗措施尚无法针对肿瘤干细胞发挥清除作用，这可能是导致临床治疗失败、肿瘤复发的主要原因。因此，若要彻底治愈肿瘤，必须清除这类细胞。肿瘤干细胞的发现为恶性肿瘤治疗的理念带来了革命性的突破，为从根本上治愈恶性肿瘤提供了理论依据。目前已经验证的肝癌干细胞生物标记物包括CD13、CD133、CD90、钙离子通道α2δ1亚基、上皮细胞黏附分子(EpCAM)等细胞表面分子。虽然目前关于肝癌干细胞的研究已取得较大进展，但是肝癌干细胞的自我更新机制仍有待进一步阐明。

RNA修饰可以在转录后水平上影响基因表达。N1-甲基腺嘌呤(m1A)修饰发生在Waston-Crick界面，产生1个带正电荷的碱基，因此能显著影响蛋白-RNA相互作用以及RNA的二级结构。编码基因发生m1A修饰的位置靠近翻译起始位点以及第1个剪接位点，一般与翻译的上调相关。这种修饰能被ALKBH1酶去除。m1A阻断Waston-Crick碱基配对，促进反转录。在mRNA上，m1A主要发生在5’UTR区，表明这种修饰可以改变RNA的二级结构。在环状结构区，这个正电荷可以稳定与RNA上的磷酸骨架结合。转录本上m1A甲基化与翻译的增加相关，也许是因为翻译起始或延伸因子易于进入或能直接被富集到。这种修饰产生的正电荷产生了特异的蛋白-RNA相互作用，以及独特的RNA相互作用，这种生物学功能还是未知的。

二硫化四甲基秋兰姆(英文化学名：Thiram或Tetramethylthiuram disulfide，CAS#：137-26-8，分子式：C

发明内容

本发明的发明人在对肝癌干细胞自我更新及肝癌肿瘤发生的相关研究中发现：m1A信号及其修饰酶TRMT6/TRMT61A在人正常肝细胞中低表达，而在肝癌肿瘤中高表达，并随肿瘤演进过程表达不断升高。m1A信号高表达的病人肝癌预后差。例如，在人中，TRMT6/TRMT61A蛋白复合物催化RNA上的m1A修饰，TRMT6/TRMT61A在人正常肝细胞低表达，而在肝癌肿瘤高表达，其表达量与肝癌预后负相关。TRMT6/TRMT61A敲低的肝癌细胞体外成球和体内皮下成瘤能力显著降低。在二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)诱导的小鼠肝癌模型中，m1A信号在肿瘤组织中显著增强。

Trmt6/Trmt61A在肝脏的组织特异性敲除小鼠形成肿瘤的数量显著降低，小鼠生存率提高。小分子化合物二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞和醋酸苯汞在体外高通量筛选系统中可以显著抑制TRMT6/TRMT61A的相互作用，抑制肝癌干细胞形成。将临床病人肿瘤样本来源的细胞注入NSG小鼠肝内诱导PDC模型，腹腔注射小分子化合物二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞后发现小分子化合物的使用能有效抑制肿瘤的生长。对PDC肿瘤标本进行进一步的免疫组化染色分析，发现小分子化合物抑制了增殖相关标志物分子PCNA及PPAR信号通路分子的表达。

本发明的第一个方面提供了m1A信号及其修饰酶TRMT6/TRMT61A在促进肝癌演进及肝癌干细胞自我更新中的作用，其特征在于，m1A信号及其修饰酶TRMT6/TRMT61A在肝癌组织和干细胞中高表达并与预后相关，TRMT6/TRMT61A能够促进肝癌发生及肝癌干细胞自我更新。例如，m1A信号及其修饰酶TRMT6/TRMT61A在肝癌晚期标本高表达并与预后相关。

在本发明的一些实施方案中，TRMT6/TRMT61A在人正常肝细胞中低表达，而在肝癌肿瘤中高表达，并随肿瘤演进过程表达不断升高。TRMT6/TRMT61A高表达病人肝癌预后差。

在本发明的一些实施方案中，TRMT6/TRMT61A敲低的肝癌细胞体外成球和体内皮下成瘤能力显著降低。

在本发明的另一些实施方案中，在化学诱变剂二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)诱导的小鼠肝癌模型中，Trmt6/Trmt61A在肝脏的组织特异性敲除小鼠形成肿瘤的数量显著降低，小鼠生存率提高。

本发明的第二个方面提供了一种在肝癌干细胞中抑制m1A信号或抑制TRMT6/TRMT61A功能的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的TRMT6/TRMT61A的抑制剂如二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞及药物盐形式，或其他的修饰形式接触。并提供了一种在需要其的患者中治疗由肝癌干细胞自我更新导致的肝癌的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的TRMT6/TRMT61A的抑制剂如二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞及其可能的每一种活性修饰产物。

在本发明的一些实施方案中，在通过建立二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞体外高通量筛选体系中验证小分子化合物二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞在体外抑制TRMT6/TRMT61A并抑制肝癌干细胞的形成。

在本发明的一些实施方案中，TRMT6/TRMT61A抑制剂如二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞抑制Myc

在本发明的另一些实施方案中，TRMT6/TRMT61A抑制剂如二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞腹腔或瘤内注射抑制肝癌PDC模型肿瘤的生长，抑制体外干细胞小球形成及RNA上的m1A修饰。

在第三方面中，在以上第一和第二方面中任一项的方法是，TRMT6/TRMT61A的抑制剂是如下的化合物及其可能的每一种活性修饰产物：

在第四方面中，本发明涉及抑制TRMT6/TRMT61A酶的每一种的化合物或其药用盐，其用于抑制肝癌干细胞自我更新。

在第五方面中，本发明涉及抑制TRMT6/TRMT61A酶的每一种的化合物或其药用盐，其用于治疗由肝癌干细胞自我更新所致肝癌。

在前述方面中的任一项中，TRMT6/TRMT61A酶的每一种的抑制剂可以是相同化合物或不同的化合物。

在第六方面中，本发明涉及一种筛选用于治疗肝癌的药物的方法，所述方法包括：将候选药物添加到肝癌干细胞培养体系中，并且检测候选药物对肝癌干细胞的小球形成和/或m1A信号的抑制。例如，该方法可以包括将候选药物添加到肝癌干细胞培养基中，并且检测候选药物对肝癌干细胞的小球形成和/或m1A信号的抑制。如果相比于未添加药物的肝癌干细胞所检测的小球形成和/或m1A信号得到抑制，则该候选药物具有抗癌潜力。

本发明的二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞的有效剂量可以随给药的模式和待治疗疾病的严重程度等进行相应的调整。优选的有效量的可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所述因素包括但不限于：二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞或其类似物的药代动力学参数、受治疗患者的健康状况、体重、给药途径等。

附图简述

图1示出了m1A信号在肝癌干细胞中表达增强且与肝癌预后相关。图1A示出了m1A信号表达。图1B和1D示出了点杂交和质谱实验结果。图1C示出了肝癌组织中的点杂交实验结果。图1E示出了在人肝癌组织芯片上观察到的结果。图1F示出了m1A信号强的病人预后较差。

图2示出了TRMT6/TRMT61A能够促进肝癌发干细胞自我更新。图2A示出了细胞内TRMT6/TRMT61A蛋白表达。图2B和2C示出了点杂交和质谱结果。图2D示出了肿瘤干细胞体外成球能力。图2E和2F示出了细胞体内皮下成瘤能力。图2G示出了通过CRISPR-Cas9方法构建Trmt6和Trmt61a条件基因敲除小鼠。图2H和2I示出了Trmt6敲除和Trmt61a敲除后抑制小鼠自发肝癌的形成。

图3示出了TRMT6/TRMT61A抑制剂对由肝癌干细胞自我更新导致的肝癌有抑制效果。图3A示出了小分子化合物在体外培养体系中抑制肝癌细胞生长。图3B示出了小分子化合物抑制总RNA和tRNA上的m1A修饰比例。图3C示出了小分子化合物显著抑制肝癌干细胞形成的比例。图3D示出了小分子化合物抑制皮下肿瘤的生长。图3E示出了小分子化合物抑制肝肿瘤的生长。图3F示出了TRMT6/TRMT61A抑制剂治疗小鼠肝原位移植的肝癌后能显著延长小鼠生存期。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下为本发明实施例所用材料和一般性方法：

抗体和试剂

抗小鼠及人m1A抗体(D345-3)购自MBL(JAPAN)。抗TMRT6(PA5-61409)抗体购自Thermo Fisher Scientific(USA)。抗TMRT61A(SAB2700607)抗体购自Sigma(USA)。抗小鼠PCNA(ab29)抗体购自Abcam(Cambridge，USA)。二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞和醋酸苯汞购自TargetMol公司(Boston，USA)。

统计分析

在本发明中使用未配对的学生t检验作为统计分析。使用Microsoft Excel或SPSS13进行统计学计算。当P<0.05时，P值显著。

实施例

实施例1：证明m1A信号在肝癌干细胞中表达增强，且与肝癌预后相关。

利用干细胞培养体系，培养临床人肝癌样本(样本来自中国人民解放军总医院(301医院)知情的肝癌患者手术切下来的组织)组织消化分离出肝细胞形成的干细胞小球，用抗m1A抗体染色后，使用免疫荧光染色方法在激光共聚焦显微镜下观察到m1A信号高表达，如图1A所示。将临床人肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)样本(样本来自中国人民解放军总医院(301医院)知情的肝癌患者手术切下来的组织)组织消化分离出肝细胞，用CD13和CD133蛋白分选出干细胞(CD13

实施例2：证明TRMT6/TRMT61A能够促进肝癌干细胞自我更新。

TRMT6/TRMT61A敲低HCC肝癌样本细胞(样本来自中国人民解放军总医院(301医院)知情的肝癌患者手术切下来的组织))及PLC/PRF/5,Huh7细胞系由实验室自行筛选。在该实施例中使用了以下RNA：

shTRMT6(5’-GGTTCTACCTGGATAACGT-3’)，

shSCR(5’-CCTAAGGTTAAGTCGCCCT-3’)

shTRMT61A(5’-GGCACTCAGTTGACCTTAT-3’)。

TRMT6 mut：把第377位的精氨酸(Arg)突变为亮氨酸(Leu)。

TRMT61A mut：把第181位的天冬氨酸(Asp)突变为丙氨酸(Ala)。

如图2A所示，TRMT6和TRMT61A低表达(shTRMT6/TRMT61A)能抑制细胞内TRMT6/TRMT61A蛋白表达。在TRMT6和TRMT61A低表达的细胞中回转野生型(WT)和突变型TRMT6/TRMT61A都能恢复TRMT6和TRMT61A的表达。我们从图2A中转染不同载体的肝癌细胞中分选干细胞和非干细胞，分别提取其中的RNA。用总RNA进行m1A点杂交实验发现，TRMT6/TRMT61A敲低后细胞中m1A信号显著下降，只有回转了野生型(WT)TRMT6/TRMT61A的细胞才能恢复m1A信号，如图2B所示。从转染不同载体的肝癌干细胞中提取出总RNA、转运RNA后做质谱分析，结果显示TRMT6/TRMT61A敲低后细胞中m1A信号显著下降，只有回转了野生型(WT)TRMT6/TRMT61A的细胞才能恢复总RNA和转运RNA m1A的比值，如图2C所示。如图2D所示，TRMT6/TRMT61A敲低后肿瘤干细胞体外成球能力受到抑制，只有回转了野生型(WT)TRMT6/TRMT61A的细胞才能恢复小球形成能力。TRMT6/TRMT61A敲低后，细胞体内皮下连续成瘤能力显著降低，如图2E所示。只有回转了野生型(WT)TRMT6/TRMT61A的细胞才能恢复小鼠皮下连续成瘤能力，如图2F所示。通过CRISPR-Cas9方法构建Trmt6和Trmt61a条件基因敲除小鼠(Trmt6

实施例3：证明TRMT6/TRMT61A抑制剂对由肝癌干细胞自我更新导致的肝癌有抑制效果。

药物二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞在体外蛋白质相互作用体系中显著抑制TRMT6/TRMT61A的相互作用。在体外培养体系中，将这些药物分别添加到细胞培养基中后能显著抑制肝癌细胞生长，IC50如图3A所示。从处理后的干细胞中提取出总RNA和转运RNA后做质谱分析，结果显示二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞抑制总RNA和tRNA上的m1A修饰比例，如图3B所示。在IC50的浓度作用下，二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞显著抑制肝癌干细胞形成的比例，如图3C所示。二硫化四甲基秋兰姆、硫柳汞或醋酸苯汞抑制肝癌细胞移植后在小鼠皮下肿瘤的生长，如图3D所示。临床病人肿瘤样本来源的细胞(肝癌手术样本来源于解放军301医院)注入NSG(NOD-Prkdcscid Il2rgtm1/Bcgen，购自百奥赛图公司)小鼠肝内诱导PDC(patient-derived cells)模型，发现二硫化四甲基秋兰姆等抑制剂在腹腔内的使用也能有效抑制临床样本来源的肝肿瘤的生长，如图3E所示。TRMT6/TRMT61A抑制剂治疗小鼠肝原位移植的肝癌后能显著延长小鼠生存期，如图3F所示。