一种基于固相分散萃取结合超高效液相色谱法同时检测何首乌中5种蒽醌类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种基于固相分散萃取（DSPE）结合超高效液相色谱-二极管阵列法同时检测何首乌中5种蒽醌类化合物（大黄素，大黄素甲醚，大黄酚，大黄酸和芦荟大黄素）的分析方法，属于分析技术领域。

背景技术

何首乌是一种传统的补益良药，具有生发和黑发、脂质调节、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗衰老、神经保护、心脏保护、肝保护、免疫调节作用等活性，长期以来在世界范围特别是亚洲国家内广泛使用。蒽醌类化合物是何首乌中一类主要天然药物成分，主要由大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸和芦荟大黄素组成。

随着我国中草药临床用量的增加以及中药成分的的研发生产使用，人们对中草药的安全性也给予了更多的关注。近年来不断出现关于何首乌及成药制剂使用的不良反应甚至毒性反应的报道，而蒽醌及其衍生物被认为是引起毒性的主要原因。因此建立何首乌中蒽醌类物质快速、简便、灵敏、准确的分析技术对何首乌安全评估及质量监控有重要意义。

目前文献中关于何首乌中蒽醌类化合物的测定，通常是利用溶剂回流或超声提取，然后将提取液直接采用液相色谱-紫外或质谱进行测定。样品前处理过程仅有提取过程，而没有净化过程，虽然简单快速，但由于中草药基质复杂，共提物给测定带来的干扰以及对色谱柱的损伤不可忽视。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、方便、灵敏的超高效液相色谱-二极管阵列法以同时检测何首乌中5种蒽醌类化合物（大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸与芦荟大黄素）。

本发明的技术方案：一种基于分散固相萃取（DSPE）方法，结合超高效液相色谱-二极管阵列法实现何首乌中5种蒽醌类内源性物质（大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、大黄酸与芦荟大黄素）的分析方法。何首乌中5种蒽醌类内源性物质用70%甲醇超声提取，将提取液用水稀释至甲醇含量50%，采用C

本发明主要包括以下几个步骤：超高效液相色谱条件；5种蒽醌类物质的同时检测；样品的前处理；样品的检测。

一种基于分散固相萃取（DSPE）结合超高效液相色谱-二极管阵列法同时检测何首乌中5种蒽醌类化合物的分析方法，其特征在于：主要包括以下几个步骤：

（1）液相色谱条件

本发明中所使用的仪器是Acquity UPLC H-Class Plus超高效液相色谱仪（美国waters公司），配有Acquity四元梯度泵、Acquity FTN自动进样器、Acquity柱温箱和Acquity FDA二极管阵列检测器。色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC ® HSS T3分析柱（2.1mm×100 mm×1.8 μm）；柱温：35℃；进样体积：5μL；流动相：A相为水（含0.1%甲酸），B相为乙腈（含0.1%甲酸）；梯度洗脱程序：0~1 min，45% B；1~10min，70% B；10~13min，90% B；13.1 min，45%B；15min，45%B；流速：0.4 mL/min；检测波长：254 nm。

（2）5种蒽醌类化合物的同时检测

配制一系列质量浓度的5种蒽醌类化合物混合标准溶液，在上述液相色谱条件下进行测定，以各组分峰面积Y对质量浓度X进行线性回归，得到线性回归方程。大黄素（0.5-100 mg/L）、大黄素甲醚（0.5-40 mg/L）、大黄酚（0.1-20 mg/L）、大黄酸（0.1-20 mg/L）、芦荟大黄素（0.1-20 mg/L）线性关系良好（R

（3）样品前处理

称取0.5 g（精确至0.001 g）的何首乌样品，加入30 mL的70%甲醇，超声提取30min，5000 rpm离心5 min，取上层清液，加水稀释使甲醇含量为50%。取5mL上述提取液，加入0.6 g C

（4）样品检测

取0.5 g样品，分别添加高、中、低三个不同水平的蒽醌类化合物混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UPLC-DAD分析，计算样品加标回收率。

本发明的有益效果：本发明设计了一种基于固相分散萃取（DSPE）结合超高效液相色谱-二极管阵列同时检测何首乌中5种蒽醌类化合物的方法，可简便、快速、灵敏、准确地检测何首乌中5种蒽醌类化合物，为何首乌药材的质量控制及安全评估提供技术手段。

附图说明

图1为5种蒽醌类化合物的色谱分离图

1.芦荟大黄素（10 mg/L）；2.大黄酸（10 mg/L）；3.大黄素（20 mg/L）；4.大黄酚（10mg/L）5.大黄素甲醚（20 mg/L）。

具体实施方式

实施例1：

采用Acquity UPLC H-Class Plus超高效液相色谱仪（美国waters公司），配有Acquity四元梯度泵、Acquity FTN自动进样器、Acquity柱温箱和Acquity FDA二极管阵列检测器。色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC ® HSS T3分析柱（2.1mm×100 mm×1.8 μm）；柱温：35℃；进样体积：5μL；流动相：A相为水（含0.1%甲酸），B相为乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脱程序见表1；流速：0.4 mL/min；检测波长：254 nm。

表1 梯度洗脱程序

实施例2：

配制一系列质量浓度的5种蒽醌类化合物混合标准溶液，在上述色谱条件下进行测定，以各组分峰面积Y对质量浓度X绘制标准曲线（见表2），5种目标化合物在线性范围内吴良好的线性关系（R

表2 5种蒽醌类化合物的线性方程、检出限及定量限

实施例3：

样品的前处理：称取0.5 g（精确至0.001 g）的何首乌样品，加入30 mL的70%甲醇，超声提取30min，5000 rpm离心5 min，取上层清液，加水稀释使甲醇含量为50%。取5mL上述提取液，加入0.6 g C

实施例4：

取0.5 g样品，分别添加高、中、低三个不同水平的蒽醌类化合物混合标准溶液，按上述样品前处理方法对样品进行处理后，进行UPLC-DAD分析，计算样品加标回收率和精密度，结果见表3。

表3 加标回收率和精密度（n=6）

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，作出相应改变和替代，而且性能或用途相同，都应当视为本发明的保护范围。