一种川乌总乌头原碱提取物及其医药应用

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种川乌总乌头原碱提取物及其医药应用。

背景技术

川乌是我国乌头属中分布最广的种，被我国劳动人民利用的历史也较悠久，《神农本草经》中将乌头列为下品。据有关文献记载，在四川彰明、江油等地川乌栽培已有近千年的历史。川乌Aconitum carmichaeli Debx.是乌头属于毛茛科乌头属植物，李时珍说：“初中为乌头，像乌鸦的头；附着乌头而生的是附子，像子附母”，川乌植物的母根加工后的中药称为“川乌”，也可称为“乌头”，子根加工后则称为“附子”。生川乌毒性更强，属于“有大毒”中药，列入《医疗用毒性药品管理办法》进行管理，而生附片为“有毒”中药，它们一般均炮制成“制川乌”“制附片”临床使用。

川乌具有祛风除湿、温经止痛的功能，主治风寒湿痹，关节疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛及麻醉作用；附子具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛等功能，主治亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足，胸痹心痛，虚寒吐泻，脘腹冷痛，肾阳虚衰，阳痿宫冷，阴寒水肿，阳虚外感，寒湿痹痛。因此川乌止痛作用更强，甚至作麻醉剂使用；附子作用相对较弱，以温阳通脉、散寒止痛为主。

川乌与附子生物碱成分基本一致，主要含双酯型乌头碱如新乌头碱、次乌头碱和乌头碱，一般情况下川乌含双酯型乌头碱更高，药典规定按干燥品计算，含乌头碱(C

川乌的毒成分为双酯型乌头碱，口服0.2毫克即能使人中毒；口服3～5毫克即可致死，因吸收快，故中毒极为迅速，可于数分钟内出现中毒症状。因此，川乌或附子一般通过炮制加工使双酯型乌头碱生成单酯型生物碱后入药，以降低毒性。

构效研究表明，双酯型乌头碱，毒性最大，而水解产物单酯型乌头碱，毒性大幅度降低，不含酯键的乌头原碱型生物碱的毒性最低。此外降低乌头碱的亲水生，如乙酰乌头碱的药用安全性也可大幅度提高。乌头碱类结构改造中，水解甲氧基以及将其中部分羟基定向还原反应的结构改造研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种川乌总乌头原碱提取物，该提取物特征为主要成分为二个新化合物命名为爱可宁(Aconiol)与15-羟基爱可宁，其含量和大于总碱的50％；该提取物通过川乌饮片，碱水加热回流，使乌头碱在双酯水解的同时又水解1-位甲氧基并还原乌头碱结构中3、13、15位羟基，生成以新化合物爱可宁与15-羟基爱可宁为主的乌头原碱类成分，经大孔树脂精制，制得总碱。

通过1-甲氧基水解及羟基还原，得到的新化合物，可有效地降低药物毒性，保持抗炎、镇痛活性，该转化方法产物得率高，反应在水相中进行、方法简单、成本低，产物毒性低、药效强，利用此水解与羟基还原反应。

本发明所采取的技术方案是：

一种川乌总乌头原碱提取物，提取物中包含新成分爱可宁、15-羟基爱可宁，已知成分塔拉乌头胺和宋果宁。

一种川乌总乌头原碱提取物，提取物中主成分爱可宁、15-羟基爱可宁为新化合物，化学结构为：

一种川乌总乌头原碱提取物，提取物含新成分爱可宁与15-羟基爱可宁的总含量占总乌头原碱提取物的50-70％，已知成分塔拉乌头胺与宋果宁总含量占总乌头原碱提取物的8％以上。

一种川乌总乌头原碱提取物，乌头碱与苯甲酰乌头原碱含量和占总乌头原碱提取物的0.01％以下。

一种川乌总乌头原碱提取物，制备方法包括以下步骤：(1)川乌干品1份或鲜川乌3份，第一次回流提取时，加入8-12份重量的水、0.02-0.08份的无机碱，100-105℃加热回流，回流时间为0.5-4小时，回流过程中药液呈碱性pH 9-12，过滤，得滤液；第二次回流提取时，加水6-10份，回流时间为0.5-2小时，回流液过滤，混合煎液，静置2-12小时，冷却至60℃以下，上清液过滤；(2)滤液流经预处理好的非极性大孔树脂层析柱，树脂型号为AB-8、D101、PHD-400中的1-2种，树脂用量为0.5-2份，流速为0.1-1倍树脂体积/min，待完全流过吸附后，去离子水洗脱树脂柱，洗脱体积为树脂体积4-10倍；(3)再以10-20％乙醇洗脱树脂柱去除杂质，乙醇液洗脱体积为树脂体积2-10倍，流速为0.1-1倍树脂体积/min；(4)以有机酸水溶液洗脱树脂柱去除杂质，甲酸或乙酸的浓度为0.1-0.5％，酸水洗脱体积为树脂量的2-10倍，流速为0.1-0.5倍树脂体积/min；(5)再用甲酸或乙酸浓度为0.1-0.5％，乙醇浓度为10-20％洗脱树脂，洗脱体积为树脂量3-8倍，流速为0.1-0.5倍树脂体积/min；(6)收集步骤(5)洗脱液，回收、浓缩得清膏，喷雾干燥或减压干燥，得干膏川乌还原总碱提取物。

一种川乌总乌头原碱提取物，制备方法包括以下步骤：(1)鲜川乌3份，切片，第一次回流提取时，加入10份重量的水、0.05份的氢氧化钙，100℃加热回流，回流时间为1小时，回流过程中药液呈碱性pH 9以上，过滤，得滤液；第二次回流提取时，加水8份，回流时间为0.5小时，回流液过滤，混合煎液，静置2小时，冷却至50℃，上清液过滤；(2)滤液流经预处理好的非极性大孔树脂层析柱，树脂型号为AB-8，树脂用量为1份，流速为0.2倍树脂体积/min，待完全流过吸附后，去离子水洗脱树脂柱，洗脱体积为树脂体积6倍；(3)再以15％乙醇洗脱树脂柱去除杂质，乙醇液洗脱体积为树脂体积5倍，流速为0.2倍树脂体积/min；(4)以有机酸水溶液洗脱树脂柱去除杂质，甲酸或乙酸的浓度为0.2％，酸水洗脱体积为树脂量的5倍，流速为0.2倍树脂体积/min；(5)再甲酸或乙酸浓度为0.1％，乙醇浓度为15％洗脱树脂，洗脱体积为树脂量4倍，流速为0.2倍树脂体积/min；(6)收集步骤(5)洗脱液，回收、浓缩得清膏，喷雾干燥或减压干燥，得干膏川乌还原总碱提取物。

一种川乌总乌头原碱提取物，在制备消炎止痛药物中的应用。

一种川乌总乌头原碱提取物，其在药剂学上可接受的辅料，制备成片剂、胶囊剂、注射剂、软膏剂或透皮控释贴剂。

本发明的有益效果是：

川乌总乌头原碱提取物以转化的新化合物为主，爱可宁与15-羟基爱可宁的含量和占提取物50％以上，HPLC-ELSD法难以检出乌头碱、去乙酰乌头碱，乌头碱与苯甲酰乌头原碱含量和占总乌头原碱提取物的0.01％以下。

本发明的1-甲氧基水解及3、13、15-羟基还原反应，在水相发生，反应物质无机碱易获取、成本低，方法简单，便于大生产应用，加工的饮片或精制的提取物，毒性低，保留了抗炎镇痛的药效。本发明用碱水回流乌头碱在酯键水解的同时进行1-甲氧基水解及羟基还原的反应为研究中首次发现。

附图说明

图1为乌头总乌头原碱中成分液相色谱图。

图2为尼奥宁氢谱图。

图3为爱可宁氢谱图。

图4为附子宁氢谱图。

图5为15-羟基爱可宁氢谱。

图6为总乌头原碱提取物组成色谱图及各成分色谱图。

具体实施方式

实施例1

取鲜川乌的切片15kg,加氢氧化钙250g，置于煎煮锅内，加水40L，加热煎煮60min，滤出药液；锅内药渣再加水35L，再加热煎煮30min，滤出药液，合并滤液，静置6小时，冷却至40-50℃，上清液过滤；取2.5L已预处理AB-8大孔径树脂，装入层析柱，水洗去除气泡，药液上树脂柱，药液流速250ml/min，待药液流尽后用去离子水25L洗脱去除无机物，以15％乙醇10L洗脱；再用0.1％甲酸水溶液10L洗脱，进而用含0.1％甲酸的15％乙醇溶液10L洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，得乌头总乌头原碱，主成分为新化合物爱可宁、15-羟基爱可宁。

实施例2

取附子饮片5kg,加碳酸钠250g，置于煎煮锅内，加水50L，加热煎煮60min，滤出药液；锅内药渣再加水35L，再加热煎煮60min，滤出药液，合并滤液，静置6小时，冷却至40-50℃，上清液过滤，取2.5L已预处理D101大孔径树脂，装入层析柱，水洗去除气泡，药液上树脂柱，药液流速125ml/min，待药液流尽后用去离子水20L洗脱去除无机物，以15％乙醇10L洗脱；再用0.1％甲酸水液10L洗脱，进而用含0.1％甲酸的15％乙醇液10L洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，喷雾干燥，得附子总乌头原碱，主成分为新化合物爱可宁、15-羟基爱可宁。

实施例3

取实施例1中的乌头总乌头原碱、实施例2中的附子总乌头原碱，分别配置成浓度为含乌头总乌头原碱7mg/ml、附子总乌头原碱7.5mg/ml的溶液，另配成含乌头碱0.01mg/ml的溶液；取30只20g体重的小鼠，分成三组，每组10只，各组分别腹腔注射给药上述乌头总乌头原碱、附子总乌头原碱、乌头碱溶液各1ml/只，观察动物死亡数，实验结果见表1。结果表明，乌头总乌头原碱的毒性与附子总乌头原碱相近，相比乌头碱毒性下降了700倍以上。

表1

实施例4抗炎实验

以盐酸青藤碱为阳性，设模型组、阳性组、实施例1中乌头总乌头原碱低、中、高剂量组、实施例2中附子总乌头原碱高剂量组，每组小鼠10只，以二甲苯致小鼠耳廓肿胀，造模后一定时间，仪器检测耳廓厚度。给药方式：灌胃给药；前一天给药一次，当天上午给药一次，下午造模前1小时给药，给药剂量：盐酸青藤碱50mg/kg；总碱小、大剂量分别为3.75mg/kg、11.25mg/kg；二甲苯涂耳造模后30min、60min、90min检测耳廓肿胀度，与未造模耳对照计算肿胀度。实验结果见表2。

表2

注：*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；

结果表明，试验样品乌头总乌头原碱在低、中、高剂量组30、60、90min时，均有显著效果，从数据分析大剂量组相比阳性药，数据的趋势上作用更强、时间更久。附子总乌头原碱高剂量组有极显著效果。

实施例5镇痛实验

以盐酸青藤碱为阳性，设模型组、阳性组、实施例1中乌头总乌头原碱低、高剂量组、实施例2中附子总乌头原碱高剂量组，每组小鼠10只，腹腔注射10％醋酸溶液30ul/只，造成疼痛模型后，观察各组动物扭体数量。给药方式：灌胃给药；前一天给药一次，当天上午给药一次，造模前1小时给药；给药剂量：盐酸青藤碱50mg/kg，总碱11.25mg/kg。实验结果见表3。

表3

注：*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；

镇痛实验结果表明，实施例1中乌头总乌头原碱低、高剂量组、实施例2中附子总乌头原碱高剂量组的镇痛效果较好。从原数据分析，模型组扭体次数在20-40之间，而高剂量组均有多只小鼠零扭体，显示非常强的镇痛效果。

实施例6提取物中主成分制备

取实施例1的乌头总乌头原碱，80％乙醇溶解，经制备液相制备，色谱条件C18填料，250mm*10mm柱，流速5ml/min，ELSD检测器(气流量2.8mL/min、漂移管温度110℃)，色谱梯度如表4，色谱图如图1，收集15-羟基爱可宁峰(峰1)、爱可宁峰(峰2)，收集液回收溶剂至少量，冷冻干燥，分别得15-羟基爱可宁峰(82mg)、爱可宁(75mg)。

表4

实施例7爱可宁结构鉴定

爱可宁(2号峰)结构鉴定如下：HLPC-MS：[M+H]

H-H COSY、HMBC和NOESY相关信息如表5。

表5爱可宁结构主要H-H COSY,HMBC和NOESY相关信息表

立体结构鉴定：爱可宁与尼奥宁的结构区别为1-位羟基的手性差异，尼奥宁氢谱见图2，爱可宁氢谱见图3，二者差异较为明显。

由于1-位羟基的立体构型影响，从而使A环以及与A环连接碳上的质子位移发生变化，其特征如表6。

表6 1-羟基立体异构的氢谱特征

实施例7 15-羟基爱可宁结构鉴定

15-羟基爱可宁(1号峰)结构鉴定如下：HLPC-MS：[M+H]

15-羟基爱可宁与附子宁的结构区别为1-位羟基的手性差异，附子宁氢谱见图4，15-羟基爱可宁氢谱见图5，二者差异较为明显。

15-羟基爱可宁与附子宁碳谱、氢谱对照如表7。

表7

由于1-位羟基的立体构型影响，从而使A环以及与A环连接碳上的质子位移发生变化，其特征如表8。

表8 1-羟基立体异构的氢谱特征

实施例8含量测定

取实施例2的附子总乌头原碱适量，80％乙醇溶解制备样品，高效液相色谱仪分析，色谱条件C18填料，250mm*0.45mm柱，流速1ml/min，ELSD检测器(气流量2.8mL/min、漂移管温度110℃)，色谱梯度如表9，色谱图如图6，采用标准曲线法进行定量检测，得到提取物组成及各成分含量为：5-羟基爱可宁29.6％，爱可宁27.1％，塔拉乌头胺8.3％，宋果宁为4.2％，未检出乌头碱、苯甲酰乌头原碱。

表9