一种在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用。

背景技术

燃料乙醇指以生物质为原料通过生物发酵等途径获得的可作为燃料用的乙醇。第一代燃料乙醇以糖质和淀粉质作物为原料进行生产，存在“与人争粮”的弊端，生产规模和发展受到限制。第二代燃料乙醇则是以可再生的木质纤维素生物质为原料，符合可持续发展的理念，是发展的趋势。然而目前以农业废弃物如秸秆等为原料生产第二代燃料乙醇，由于存在生产成本高的难题，影响了规模化生产。因此，开发新的纤维原料来源，对促进燃料乙醇的发展有重要意义。

目前，我国燃料乙醇的生产中，玉米原料的占比较高，据统计，玉米淀粉乙醇约占我国总燃料乙醇产量的50％。传统的以玉米为原料生产乙醇的工艺，是先将玉米干法粉碎或湿法碾碎后，利用液化酶和糖化酶将原料进行液化和糖化制备成糖化醪液，再经酵母发酵、蒸馏等步骤得到乙醇产品。但这种传统生产工艺，主要是利用了玉米中的淀粉，而其中的玉米纤维并未被有效利用，一般将其作为副产物被加工成DDGS，作为饲料进行出售，造成了原料的浪费，也降低了单位玉米的乙醇产率。

由于玉米纤维中残留淀粉、纤维素和半纤维素的含量约占总干重的70％，因此，如能有效利用玉米纤维中的纤维素、半纤维素和残余淀粉，将其转化成乙醇，则不仅可以实现资源的有效利用，还可以增加单位原料的终产品产量，具有重要意义。据预估，在传统玉米淀粉乙醇生产中，如果将玉米纤维酶解糖化发酵转化成乙醇，可以提高玉米乙醇总产量的10％以上。

利用糖化醪液中的玉米纤维生产乙醇，关键步骤是利用酶将玉米纤维中的纤维素和半纤维素水解生成可发酵糖。由于玉米纤维中除纤维素组分以外，还富含半纤维素且半纤维素糖的组成和结构较为复杂，包含阿拉伯糖、半乳糖、阿魏酸、葡萄糖醛酸等取代基，因此，若要将其彻底水解，需要一个由纤维素酶和半纤维素酶组成的复合酶系，依靠多种酶类的共同作用才能实现，且相对而言，对酶系中半纤维素酶组分的要求更高。如美国ICM公司，采用纤维分离技术，将分离的玉米纤维经过稀酸处理，再经过商品酶水解和酵母发酵转化成乙醇，使得乙醇总产量提高了5％左右；如Syngenta公司则是将α-淀粉酶、葡萄糖糖化酶、木聚糖酶和植酸酶等酶基因直接表达在玉米胚乳中，减少了商品酶制剂用量；如Edeniq公司主要采用胶体磨技术将玉米纤维打碎，再添加淀粉酶和纤维素酶进行同步糖化发酵，DDGS蛋白质含量明显提高；但这些公司都没有研发出一种专门用于玉米纤维水解的酶制剂，而是采用了普通的商品酶制剂，专一性不强，对玉米纤维水解效率不高。如专利CN201811277689.7将含有阿魏酸酯酶的黑曲霉发酵液与里氏木霉发酵液按照一定体积比复配获得复合纤维素酶系，在同步糖化发酵中添加这种酶系可将玉米纤维中残余的纤维素和淀粉进一步水解，但其半纤维素酶种类匮乏，对于玉米纤维中半纤维素的利用率很低。如专利201911209469.5利用超声辅助盐酸水解玉米纤维，经微生物水解后通过浓缩和蒸汽处理得到玉米纤维水解液，与未预处理的玉米纤维相比水解液中总糖浓度有一定提升，但在此过程中耗能较高，同时会产生抑制物影响后续反应。

检索发现：目前市场上还缺乏可以有效水解玉米糖化醪液中玉米纤维用的专用酶产品，已报道的所用的纤维素酶，对玉米纤维的酶解转化产糖的效率仍然较低，鲜见对玉米纤维水解专用酶系或适用于在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系及其应用。

本发明所述在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系，其特征在于：所述纤维素酶系是以草酸青霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶制得的复合纤维素酶系；或者是在该复合纤维素酶系基础上进一步添加α-半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶中的一种或两种制得的复合纤维素酶系；其中，所述复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:150-300:15-30:0-20:0-15配制。

进一步的，所述纤维素酶系优选是以草酸青霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶制得的复合纤维素酶系；其特征在于：该复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为10-15FPU/mL，木聚糖酶活力为1000-1500U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为1-3U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶按照体积比1000:200-300:15-30配制。

或者，另一优选的实施方式是：所述纤维素酶系是以草酸青霉酶系为主酶系，添加木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶以及阿魏酸酯酶制得的复合纤维素酶系；其特征在于：该复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为5-15FPU/mL，木聚糖酶活力为750-1500U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为1-3U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力为1-5U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.1-0.4U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:150-300:15-30:5-20:5-15配制。

其中：所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力优选为10-15FPU/mL，木聚糖酶活力优选为1000-1500U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力优选为2-3U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力优选为3-5U/mL，阿魏酸酯酶活力优选为0.2-0.4U/mL；该复合纤维素酶系优选由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:200-300:20-30:10-20:10-15配制。

其中，再进一步优选的实施方式是：所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为13-15FPU/mL，木聚糖酶活力为1250-1500U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为2.5-3U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力为3.5-5U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.2-0.4U/mL；该复合纤维素酶系由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:250-300:25-30:10-15:10-15配制。

上述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系最优选的实施方式是：所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1250U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为2.5U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力为4U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.3U/mL。

上述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系中：所述草酸青霉酶系、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶以及阿魏酸酯酶均为市售产品或以公知方法自行制备获得；其中，所述草酸青霉酶系的制备是由草酸青霉(Penicilliumoxalicum)CGMCC No.5302菌株经过液体发酵方式实现。

本发明所述的纤维素酶系在有效提高糖化醪液中玉米纤维糖转化率中的应用。

其中，所述应用方法是：

(1)按照传统的玉米淀粉生产乙醇工艺，将玉米经过粉碎、预处理、加入α-淀粉酶液化，制得液化醪液；

(2)调节制得的液化醪液pH值至5±0.2，在液化醪液中加入糖化酶和上述的纤维素酶系，糖化酶添加量为100-200U/L，纤维素酶酶活力在液化醪液中达到100-250FPU/L，然后在温度28℃-32℃，转速180-220rpm条件下糖化6h-8h，得到玉米纤维转化率提高的糖化醪液。

进一步的，在糖化醪液加入活化后的酵母，同时加入尿素1.3mg/g底物，糖化发酵48-72h，将糖转化成乙醇，再经过蒸馏，即获得燃料乙醇。

上述应用中，优选的应用方法是：

(1)按照传统的玉米淀粉生产乙醇工艺，将玉米经过粉碎、预处理、加入α-淀粉酶液化，制得液化醪液；

(2)调节制得的液化醪液pH值至5±0.2，在液化醪液中加入糖化酶和上述的纤维素酶系，糖化酶添加量为150-200U/L，纤维素酶酶活力在液化醪液中达到200-250FPU/L，然后在温度30℃-32℃，转速200-220rpm条件下糖化6h-7h，得到玉米纤维转化率提高的糖化醪液。

进一步的，在糖化醪液加入活化后的酵母，同时加入尿素1.3mg/g底物，糖化发酵48-72h，将糖转化成乙醇，再经过蒸馏，即获得燃料乙醇。

上述应用中，最优选的应用方法是：

(1)按照传统的玉米淀粉生产乙醇工艺，将玉米经过粉碎、预处理、加入α-淀粉酶液化，制得液化醪液；

(2)调节制得的液化醪液pH值至5，在液化醪液中加入糖化酶和上述的纤维素酶系，糖化酶添加量为200U/L，纤维素酶酶活力在液化醪液中达到250FPU/L，然后在温度30℃，转速200rpm条件下糖化6h，得到玉米纤维转化率提高的糖化醪液。

进一步的，在糖化醪液加入活化后的酵母，同时加入尿素1.3mg/g底物，糖化发酵48-72h，将糖转化成乙醇，再经过蒸馏，即获得燃料乙醇。

上述技术方案中，涉及的各种酶的活力测定方法是：

(1)滤纸酶活力：将1条滤纸条(Whatman，50±1mg)，折叠放入试管底部，加入1.5mLpH 4.8的0.2M醋酸钠缓冲液和0.5mL稀释酶液混匀，50℃反应60min；DNS法测定还原糖的生成量：加入3mL DNS终止反应，混匀后沸水浴10min，再加入20mL蒸馏水终止反应；混匀后在OD

(2)木聚糖酶活力：加入1.5mL 1％(m/v)桦木木聚糖(使用pH4.8的0.2M醋酸钠缓冲液配制)和0.5mL稀释酶液混匀，50℃反应30min；DNS法测定还原糖的生成量：加入3mLDNS终止反应，混匀后沸水浴10min，再加入20mL蒸馏水终止反应；混匀后在OD

(3)阿拉伯呋喃糖苷酶活力：向50μL 1mg/mL对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(pNPA，sigma，pH4.8的0.2M醋酸钠缓冲液配制)中加100μL稀释酶液，50℃反应30min后，加入150μL 10％(m/v)Na

(4)α-半乳糖苷酶活力：向50μL 1mg/mL对硝基苯基-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNPGal，sigma，pH4.8的0.2M醋酸钠缓冲液配制)中加100μL稀释酶液，50℃反应30min后，加入150μL 10％(m/v)Na

(5)阿魏酸酯酶活力：将500μL稀释酶液和0.05g去淀粉麦麸混合，40℃反应30min，煮沸10min使酶失活。加入2.5mL无水乙醇,4C,1000rpm离心10min，取上清于OD

(6)淀粉酶活力：加入1.5mL 1％(w/v)可溶性淀粉(pH4.8的0.2M醋酸钠缓冲液配制)和0.5mL稀释酶液混匀，40℃反应10min，DNS法测定还原糖的生成量：加DNS 3mL终止反应，混匀，沸水浴10min，再加20mL蒸馏水终止反应；混匀后在OD

利用本发明既可以利用玉米原料糖化发酵生产燃料乙醇，也可用于发酵制备柠檬酸、苏氨酸等产品。

本发明提供的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系具有以下显著效果：

1.本发明通过多酶复配获得了适于高效降解玉米糖化醪液中玉米纤维的复合纤维素酶系，使其酶系具有恰当的酶种类，实现了酶系中多种酶的合理混合。

2.本发明的复合纤维素酶系，由于强化了对玉米纤维半纤维素降解的酶组分，促进了玉米纤维半纤维素侧链取代基团的“脱枝”效果，可实现糖化醪液中玉米纤维的纤维素和半纤维素组分的更有效降解，提高糖化醪液中玉米纤维的转化率。与已有商业纤维素酶相比，这种复合纤维素酶系的酶组成更适合于半纤维素含量丰富且结构复杂的玉米纤维，且具有酶系可控、水解效率高、用酶成本低、制备过程简单、半纤维素糖的单糖产率高等优点。

3.与出发酶系草酸青霉酶系相比，本发明复配的复合纤维素酶系更适合用于玉米糖化醪液中玉米纤维的降解，使用所述复合纤维素酶系并配合糖化酶，糖化发酵生产乙醇浓度更高，且蒸馏固液分离后得到的酒糟蛋白质含量更高，适于制备高品质饲料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。

下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、酶制剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，实施例中所用的试剂均购自于国药集团化学试剂有限公司；木聚糖酶购自于北京索莱宝科技有限公司；阿拉伯呋喃糖苷酶、α-半乳糖苷酶和阿魏酸酯酶购自于爱尔兰Megazyme公司；α-淀粉酶购自于上海麦克林生化科技有限公司；草酸青霉(Penicilliumoxalicum)CGMCC No.5302菌株已于2011年9月28日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏编号为CGMCC No.5302，该菌株是申请人先前申请专利时保藏的菌株，其已多次在公开的文献中记载。

实施例1本发明所述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制

所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶按照体积比1000:250:20配制而成。

所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1250U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为2U/mL。

实施例2本发明所述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制

所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶按照体积比1000:250:20:10配制而成。

所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1250U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为2U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力为2U/mL。

实施例3本发明所述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制

所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:250:20:10配制而成。

所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1250U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为2U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.2U/mL。

实施例4本发明所述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制

所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:250:25:15:12配制而成。

所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1250U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为2.5U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力为4U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.3U/mL。

实施例5本发明所述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制

所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:300:30:20:15配制而成。

所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为15FPU/mL，木聚糖酶活力为1500U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为3U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力为5U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.4U/mL。

实施例6本发明所述的在玉米糖化醪液制备中能提高玉米纤维糖转化率的纤维素酶系的配制

所述复合纤维素酶系是由滤纸酶活力不低于5FPU/mL的草酸青霉酶系、酶活力不低于500U/mL的木聚糖酶、酶活力不低于50U/mL的阿拉伯呋喃糖苷酶、酶活力不低于100U/mL的α-半乳糖苷酶、酶活力不低于5U/mL的阿魏酸酯酶按照体积比1000:150:15:5:5配制而成。

所述复合纤维素酶系中，草酸青霉酶系滤纸酶活力为5FPU/mL，木聚糖酶活力为750U/mL，阿拉伯呋喃糖苷酶活力为1U/mL，α-半乳糖苷酶酶活力为1U/mL，阿魏酸酯酶活力为0.1U/mL。

实施例7草酸青霉酶系的制备

将草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株CGMCC No.5302经活化后获得种子液，无菌条件下，以重量百分比计，将菌丝按照1％的比例加入发酵培养基中，在30℃，200rpm培养7天，或发酵罐培养7天；之后以10000rpm离心10min获得上清液，即得到含草酸青霉酶系的发酵液，其滤纸酶活力不低于5FPU/mL。

其中：

种子培养基配方是：20g/L葡萄糖，Vogel’s盐。

发酵培养基配方是：10g/L麸皮，10g/L微晶纤维素，3g/L KH

上述Vogel’s盐的配方已记载在中国专利CN201410160118.0中并公示。

实施例8玉米半同步糖化发酵

(1)按照传统的玉米淀粉生产乙醇工艺，将玉米经过粉碎、预处理、加入α-淀粉酶液化，制得液化醪液；

(2)调节制得的液化醪液pH值至5±0.2，在液化醪液中加入糖化酶和上述的纤维素酶系，糖化酶添加量为200U/L，液化醪液中纤维素酶酶活力达到250FPU/L，在温度30℃，转速200rpm条件下糖化6h，得到糖化醪液。

(3)在得到糖化醪液中加入活化后的酵母，同时加入尿素1.3mg/g底物，糖化发酵72h，将糖转化成乙醇，再经过蒸馏，获得燃料乙醇。

实施例9玉米半同步糖化发酵

(1)利用传统的玉米淀粉生产乙醇工艺，将玉米经过粉碎、预处理、加入α-淀粉酶液化，制得液化醪液；

(2)调节制得的液化醪液pH值至5±0.2，在液化醪液中加入糖化酶和上述的纤维素酶系，糖化酶添加量为50U/L，液化醪液中纤维素酶酶活力达到100FPU/L，在温度30℃，转速200rpm条件下糖化6h，得到糖化醪液。

(3)在得到糖化醪液中加入活化后的酵母，同时加入尿素1.3mg/g底物，糖化发酵60h，将糖转化成乙醇，再经过蒸馏，获得燃料乙醇。

实施例10玉米半同步糖化发酵

(1)利用传统的玉米淀粉生产乙醇工艺，将玉米经过粉碎、预处理、加入α-淀粉酶液化，制得液化醪液；

(2)调节制得的液化醪液pH值至5±0.2，在液化醪液中加入糖化酶和上述的纤维素酶系，糖化酶添加量为150U/L，液化醪液中纤维素酶酶活力达到200FPU/L，在温度30℃，转速200rpm条件下糖化6h，得到糖化醪液。

(3)加入活化后的酵母，同时加入尿素1.3mg/g底物，糖化发酵48h，将糖转化成乙醇，再经过蒸馏，获得燃料乙醇。

实施例11不同糖化醪液的对比

按照实施例4所述条件下得到复合纤维素酶系，按照实施例7所述条件下得到草酸青霉酶系。

按照实施例8所述条件，使用复合纤维素酶系得到糖化醪液1，使用草酸青霉酶系得到糖化醪液2，不添加纤维素酶，只添加糖化酶获得糖化醪液3。

糖化醪液中游离单糖浓度对比，具体检测结果见表1。

表1：糖化醪液中游离单糖浓度对比

结果显示：使用出发草酸青霉酶系制备的糖化醪液游离糖浓度都明显低于为使用本发明所述复合纤维素酶系制备的糖化醪液。

实施例12燃料乙醇的制备

按照实施例8中的条件对实施例11中得到的糖化醪液1、2、3进行发酵。

检测乙醇产量、糖化醪液中剩余的总糖以及酒糟中的蛋白质含量，具体检测结果见表2和表3。

表2：乙醇产量、糖化醪液中剩余的总糖检测结果

表3：酒糟中蛋白质含量检测结果

结果显示：不使用纤维素酶系或使用出发草酸青霉酶系制备的糖化醪液发酵后得到的乙醇浓度都明显低于本发明使用复合纤维素酶系制备的糖化醪液发酵后得到的乙醇浓度；同时，使用本发明所述复合纤维素酶系制备糖化醪液发酵后剩余的酒糟的蛋白质含量也最高。