一种具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1及其包埋小球与应用

技术领域

本发明涉及脱氮净化的技术领域，具体涉及一种具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1及其包埋小球与应用。

背景技术

我国目前虽然很多城市富营养化景观水体已远远超过地表水五类水的标准，但是由于其TN和COD的含量仍然相较于生活污水仍然较低，因此处理手段很有限。目前城市富营养化景观水体的处理方法包括物理法、物化法、生化法和生物修复法，物理法的净化过程主要原理为转移和稀释，水体中氮本身的结构与性质并没有发生变化；物化处理法包括混凝与气浮等；生化处理法则主要包括生物接触氧化等；生物修复法则包括微生物修复法与构建人工湿地，其中微生物修复法有两种，一种是利用环境中原有的微生物，通过外加营养物质等净化水体，第二种则是投加额外的微生物进行水体净化；人工湿地法则是通过吸附、滞留、过滤、氧化还原、沉淀、微生物分解、转化、植物遮蔽、残留物积累、蒸腾水分和养分吸收及各类动物的作用来达到净化水体的目的。

综上所述，生物法由于成本低、操作简单、不易产生二次污染，成为比物理法和化学法更具前景的方法。但现阶段的生物处理工艺存在明显缺陷，如传统脱氮过程中的硝化与反硝化需要分别在好氧与缺氧环境下进行，城市富营养化景观水体作为一个整体，无法实现同时存在两种不同氧气环境；另外，城市富营养化景观水体中化学需氧量与氮含量较低，微生物难以得到足够的营养存活；同时城市富营养化景观水体面积较大，微生物在水体中易流失，难以形成优势菌种，导致水体中氮的降解效率较低；因此需要一种经济有效且能在相同氧气环境下利用生物强化工艺净化城市富营养化景观水体中氮的微生物及系统方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述背景技术的不足，提供一种具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1及其包埋小球与应用，该假单胞菌Y1包埋小球可以通过硝化和反硝化的方式将水中氮素转化为氮气，从而彻底去除水体中的氮素。

为实现上述目的，本发明所提供的一种具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1，分类命名为假单胞菌Y1(Pseudomonas sp.Y1)，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉大学，保藏日期：2021年09月01日，保藏编号为：CCTCC NO：M20211119。

本发明还提供一种具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球，含有上述的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1。

本发明还提供一种具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球的制备方法，包括如下步骤：

1)将具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1接种至异养硝化好氧反硝化培养基中，在温度为24-32℃、转速为130-160rpm的条件下振荡培养48-72h；

2)贫营养驯化：在驯化过程中间歇曝气，溶解氧控制在4-6mg/L，驯化富集持续1-2个月，得到驯化后具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1；

3)包埋固定化：将步骤2)得到的驯化后具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1接种至培养基中，当细菌生长密度OD600为0.7的对数生长期时取菌液经离心处理后进行包埋固定化。

进一步地，培养基按重量份数计包括如下组分：硫酸铵0.24-0.4份、丁二酸钠4.052-6份、磷酸氢二钾0.25-1份、氯化钠0.125-0.5份、七水合硫酸镁0.125-0.5份、四水合硫酸锰0.0025-0.01份。

进一步地，所述步骤3)中，包埋固定化的具体方法为：将聚乙烯醇与海藻酸钠、壳聚糖与环糊精溶于水中，搅拌加热溶解后经超声处理形成混合液，再经灭菌处理取出冷却后加入菌液，随后用造粒装置打入加入了无水氯化钙的饱和硼酸溶液中，使其形成小球，最后在4-6℃温度下交联24-48h后滤出，经洗涤后即可。

进一步地，所述聚乙烯醇、海藻酸钠、壳聚糖、环糊精的重量份数之比为9:1:1:(1-2)；所述无水氯化钙与饱和硼酸溶液的固液比为4-6:100(g/ml)；所述灭菌处理为在温度为121-130℃的条件下灭菌20-40min。

本发明还提供一种上述的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球在城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统中的应用，该城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统包括人工湿地反应池体和跌水充氧装置，所述人工湿地反应池体的底部铺设有砾石填料，所述人工湿地反应池体的上方设置有生态浮床；所述人工湿地反应池体的一侧下方设置有进水管，所述人工湿地反应池体的另一侧上方设置有出水管；

所述人工湿地反应池体内的水流通过出水管由上而下跌水至跌水充氧装置的形式充氧，所述跌水充氧装置内部设有若干连续凹凸曲折阶梯型的挡板，所述跌水充氧装置的下端设有排水管，所述排水管通过回流管与进水管连通，所述排水管上还设有分支出管；

所述生态浮床由泡沫板围合而成，所述生态浮床的周壁上设置有若干个流通孔，所述生态浮床的上方种植有挺水植物，所述挺水植物的根茎部固定有网状袋，所述网状袋内包裹有如上述的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球。

进一步地，所述进水管和出水管上均设置有控制阀门；所述进水管的安装高度高于砾石填料的高度；所述出水管的安装高度高于进水管的安装高度；

所述挺水植物超过三分之二的高度在水面以上；所述挡板的斜率≥±0.3；所述人工湿地反应池体内的溶解氧浓度≥8mg/L。

再进一步地，所述挺水植物种植前采用快速缓苗液进行预培养14-20d，再将其种植在生态浮床上；所述快速缓苗液的配方如下：四水合硝酸钙0.945-1g/L、硝酸钾0.506-08g/L、硝酸铵0.08-0.1g/L、磷酸二氢钾0.136-0.2g/L、七水合硫酸镁0.493-0.6g/L、铁盐溶液2.5-4mL/L、微量元素液5-8mL/L；

其中，所述铁盐溶液由七水合硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠与水按照重量份数比为(2.78-4)：(3.73-5)：500混合而成；

所述微量元素液由碘化钾0.831-9mg/L、硼酸8.1-9mg/L、一水合硫酸锰19.7-20mg/L、七水合硫酸锌7.9-9mg/L、二水合钼酸钠0.23-0.4mg/L、五水合硫酸铜0.025-0.04mg/L、氯化钴0.025-0.04mg/L混合而成。

更进一步地，所述砾石填料由如下方法制备而成：

1)将凹凸棒土研磨至细颗粒，过100-300目筛，经700-900℃煅烧热解2-5h，得到一次改性的凹凸棒土；

2)将步骤1)中制得的一次改性的凹凸棒土加入至0.4-0.8mol/L氯化镧溶液中浸泡，并调整pH至10-11，然后以200-500r/min的转速在25-35℃的温度下反应2-5h，取出并静置，用水冲洗至pH为中性，倒出上层液体；

3)将步骤2)处理后的凹凸棒土在100-150℃的温度下烘干2-5h，取出冷却，用水清洗数次，直至上清液体中不含Cl

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

其一，本发明的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋前经过驯化后传代，在24-32℃、130-160rpm的摇床中振荡培养48-72h，期间测定细菌生长密度OD

其二，本发明的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统含有具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球，由于生态浮床中挺水植物和根系微生物对氧的传递释放，可以通过吸收、富集和转化的作用有效去除水体中污染物质，最后通过收割挺水植物的方式彻底去除水中的污染物，同时高效异养硝化好氧反硝化菌Y1包埋小球可以通过硝化和反硝化的方式将水中氮素转化为氮气，从而彻底去除水体中的氮素。

其三，本发明将从污水厂曝气池活性污泥中筛选出来的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1通过贫营养驯化并经过包埋固定化，联合挺水植物的方法，可以有效处理贫营养低化学需氧量的微污染水体，由于微生物被包埋固定化，所以没有剩余污泥产生，大大减少处理成本，由于处理部分为生态浮床，是模块化系统，因此植物与微生物包埋小球更换很方便。本发明可以在低化学需氧量与不使用物化方法以及活性污泥的条件下脱除景观水体中的氮，达到地表水Ⅳ类及以上水体的标准。

其四，本发明的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统克服了传统生物脱氮过程中需要两种氧气环境的限制，将硝化反硝化过程控制在同一个反应器内。

其五，本发明的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统成本低廉，工艺简单，挺水植物为水生经济作物，来源广，种植范围大，较易获得；充氧方式为跌水充氧不另外消耗电能。

其六，本发明的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统克服了高效异养硝化好氧反硝化菌在景观水体中易流失，难以形成优势菌种的桎梏，高效异养硝化好氧反硝化菌包埋小球在景观水体中仍能发挥高效脱氮功能。

其七，本发明的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统净化效率高。水生植物净化能力强，对于城市富营养化景观水体15天氮磷去除率均高于70％，而高效异养硝化好氧反硝化菌包埋小球对于氮磷去除率也高于95％，两者结合对于氮磷去除率可达到99％。

附图说明

图1为一种基于具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统的主视结构示意图；

图2为一种基于具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统的侧视结构示意图；

图3为生态浮床的俯视结构示意图；

图4为具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1的系统发育树；

图5为实施例4中不同温度系统对氨氮去除率图；

图6为实施例4中不同温度系统对硝氮去除率图；

图7为实施例4中不同温度系统对总氮去除率图；

图8为具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球。

图中：人工湿地反应池体1、跌水充氧装置2、砾石填料3、生态浮床4、进水管5、出水管6、挡板7、排水管8、回流管9、分支出管10、流通孔11、挺水植物12、网状袋13。

具体实施方式

下面结合实施案例详细说明本发明的实施情况，但它们并不构成对本发明的限定，仅作举例而已。同时通过说明本发明的优点将变得更加清楚和容易理解。

实施例1

本实施的一种具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1，分类命名为假单胞菌Y1(Pseudomonas sp.Y1)，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国武汉大学，保藏日期：2021年09月01日，保藏编号为：CCTCC NO：M20211119。

菌种筛选：取活性污泥10g接种至装有100mL已灭菌蒸馏水的250mL三角烧瓶中，三角烧瓶中添加若干玻璃珠打散泥样，后置于30℃、170rpm摇床振荡20min。后采用间歇性曝气法富集微生物，频繁的间歇性曝气法能够淘汰完全好氧菌和厌氧菌，使好氧反硝化菌成为优势菌群。后各取2mL液体添加到已灭菌的异养硝化富集培养基中，培养3d后取2mL菌悬液添加至已灭菌的新鲜培养基中，重复上述操作3次，初次富集过程完成。

取完成异养硝化选择性富集的菌液1mL用蒸馏水做梯度稀释，从10

挑取已纯化的菌株分别接种至已经灭菌的异养硝化富集培养基中，在30℃、170rpm条件下的摇床培养，每隔1d取1mL菌悬液到已灭菌的试管中，向装有菌悬液的试管各滴加格里斯试剂A液和B液一滴，观察试管中是否出现红色或者褐色，已灭菌但不接种菌株的空白培养基作对照。若观察到试管中出现红色或者褐色，说明存在亚硝态氮。若未出现红色或者褐色，则在3min后往试管中添加少量的锌粉，观察颜色的变化，若试管中出现红色，则说明有硝态氮的存在。上述两种现象出现任何一种均可表明菌株具备硝化作用，可初步认定该菌株为异养硝化菌株。

从异养硝化菌株中挑取若干菌株于已灭菌的异养硝化富集培养基中进行活化培养，培养基变浑浊后取菌悬液用无菌水进行梯度稀释，选取合适的梯度涂布于BTB培养基平板上，在恒温培养箱中倒置培养24h后观察BTB培养基的颜色，若菌株的周围出现蓝色晕圈，可认为筛选的异养硝化好氧反硝化菌株。

筛选出的菌株在异养硝化好氧反硝化培养基中培养，并每隔12h测一次总氮、氨氮、硝氮以及亚硝氮的含量，在其参数不变之后，将混合液置于超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，在400W功率下，每个样品进行70个周期(一周期包括5秒脉冲、5秒暂停)粉碎菌体，使菌株内部氮释放出来后再进行测定。为测定菌体内部氮以及溶解态有机氮，样品在8000r/min下离心10分钟，上清液用0.22μm有机过滤膜过滤，滤液用于分析最后剩余的溶解态总氮、氨氮、硝氮及亚硝氮的含量，若无明显差别，可知此筛选出来的菌种对于水体中的氨氮的去除为非简单吸收，而是发生同化或异化反应。同时收集培养期间产生的气态氮(一氧化氮、一氧化二氮和氮气等)，最后进行氮平衡计算。

式中：N

N

N

N

N

菌种鉴定：将送检的样品经粗提出基因组DNA后，选择相应引物扩增特异片段，送测序，将测序结果在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行BLAST比对分析，鉴定送检样品的种属。一般将在NCBI上比对得到的同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为送检样品的种属。认定此高效异养硝化好氧反硝化菌种为Pseudomonas sp.。

实施例2

本实施例的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球的制备方法，包括如下步骤：

1)将具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1接种至异养硝化好氧反硝化培养基中，所述培养基配方为硫酸铵0.24g，丁二酸钠4.052g，磷酸氢二钾0.25g，氯化钠0.125g，七水合硫酸镁0.125g，四水合硫酸锰0.0025g，在24-32℃，摇床转速130-160rpm振荡培养48-72h。

2)随后培养液中硫酸铵与丁二酸钠浓度每3天按初始浓度的20％递减，直至第15d各营养物浓度仅为初始浓度的20％左右时，不再改变营养物浓度，同时在驯化过程中间歇曝气，确保溶解氧控制4-6mg/L，保证在好氧条件下培养。在这种贫营养及好氧环境条件下对目的菌群进行长期驯化，整个驯化富集过程持续1个月左右，此为驯化后具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1。

3)将2)所述Y1菌接种至培养基中，在72h时测定细菌生长密度OD

4)取菌液30mL，经5000r/min，5min离心后再取10mL与含100mL最佳固定化混合溶液冷却后搅拌均匀，得到的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球如图8所示。其中，最佳固定化混合溶液的包埋固定化方法为：称取9.0g聚乙烯醇(PVA)与1.0g海藻酸钠(SA)、1.0g壳聚糖与2.0g环糊精溶于100mL蒸馏水中，于90℃水浴搅拌加热2个小时使其部分溶解，形成混合液，并置于超声波清洗仪中用最大功率进行超声处理，使其完全彻底溶解，并于121℃下灭菌20分钟，取出冷却后加入菌液，随后将混合液用造粒装置打入加入了4g无水氯化钙的100mL饱和硼酸溶液中(加入氯化钙前用氢氧化钠滴定使pH达到7)，使其形成小球，在4℃冰箱中交联24h后滤出，经生理盐水洗涤3次后即可。

实施例3

如图1-图3所示，一种基于具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球的城市富营养化景观水体脱氮深度处理系统，包括人工湿地反应池体1和跌水充氧装置2，人工湿地反应池体1的深度为0.5-0.6m，人工湿地反应池体1内的溶解氧浓度≥8mg/L。人工湿地反应池体1的底部铺设有砾石填料3，砾石填料3的粒径为0.15-0.20mm，砾石填料3铺设厚度为120mm。人工湿地反应池体1的上方设置有生态浮床4；人工湿地反应池体1的一侧下方设置有进水管5，人工湿地反应池体1的另一侧上方设置有出水管6；进水管5和出水管6上均设置有控制阀门14；通过操纵控制阀门5的启闭来实现进、出水流量的控制。进水管5的安装高度高于砾石填料3的高度；出水管6的安装高度高于进水管5的安装高度。

人工湿地反应池体1内的水流通过出水管6由上而下跌水至跌水充氧装置2的形式充氧，跌水充氧装置2内部设有若干连续凹凸曲折阶梯型的挡板7，挡板7的斜率≥±0.3，当挡板7的斜率达到0.3时，可以使充氧效率达到最高。跌水充氧装置2的下端设有排水管8，排水管8通过回流管9与进水管5连通，排水管8上还设有分支出管10；

生态浮床4由5面泡沫板围成，每间隔一定距离打一小孔，形成生态浮床4的周壁上的若干个流通孔11。生态浮床4的上方为聚苯乙烯泡沫板，生态浮床4上方的聚苯乙烯泡沫板上种植有挺水植物12，挺水植物在聚苯乙烯泡沫板上的种植密度为24株/㎡到30株/㎡。挺水植物12挺水植物根部及茎下部少许没于水下，挺水植物12超过三分之二的高度在水面以上。本实施例中挺水植物为千屈菜。挺水植物12的根茎部固定有网状袋13，固定于聚苯乙烯泡沫板上，网状袋13内包裹有如上述的具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球。整套系统采用连续流进水方式，回流比设置为50％，水力停留时间为24h，采用跌水充氧方式保证人工湿地反应池体1中溶解氧浓度不低于8mg/L。整个生态浮床固定在池体中间。生态浮床中挺水植物和根系微生物对氧的传递释放，可以通过吸收、富集和转化的作用有效去除水体中污染物质，最后通过收割挺水植物的方式彻底去除水中的污染物，同时具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1包埋小球可以通过硝化和反硝化的方式将水中氮素转化为氮气，从而彻底去除水体中的氮素。

挺水植物在种植前用快速缓苗液进行预培养，后将其种植在生态浮床上，所述快速缓苗液配方为：四水合硝酸钙0.945g/L、硝酸钾0.506g/L、硝酸铵0.08g/L、磷酸二氢钾0.136g/L、七水合硫酸镁0.493g/L；铁盐溶液2.5mL/L(其中，七水合硫酸亚铁2.78g、乙二胺四乙酸二钠3.73g、超纯水500ml，pH＝5.5)；微量元素液5mL/L(其中，碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、一水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L，pH＝6.0)。

砾石填料由如下方法制备而成，包括如下步骤：

1)将凹凸棒土研磨至细，过100目筛，在马弗炉中经700℃，2h煅烧热解，得到一次改性的凹凸棒土。

2)将步骤1)中制得的一次改性的凹凸棒土加入至0.4mol/L氯化镧溶液中浸泡并用1mol/L的NaOH溶液调整pH至10，然后放入空气浴恒温振荡器摇床中以200r/min的转速在25℃的温度下反应2h，取出并静置一段时间，用超纯水冲洗至pH为中性，倒出上层液体。

3)将步骤2)中制得的改性凹凸棒土在100℃的温度下烘干2h，取出冷却，用超纯水清洗数次，直至上清液中不含Cl

实施例4

(1)模拟城市富营养化景观水体：向经过除氯处理后的自来水中投加丁二酸钠0.148g/L、氯化铵0.0075g/L、硝酸钾0.036g/L，碳酸氢钠0.150g/L、氯化钠0.01g/L、氯化钾0.0066g/L、磷酸氢二钾0.0023g/L、七水合硫酸镁0.1025g/L、无水氯化钙0.039g/L；微量元素溶液(mL/L)：硼酸0.170mg/L、一水合硫酸锰0.093mg/L、七水合硫酸锌0.132mg/L、二水合钼酸钠0.005mg/L、五水合硫酸铜0.040mg/L。铁盐溶液，七水合硫酸亚铁0.015g、乙二胺四乙酸二钠0.02mg/L(两者先完全溶于25mL超纯水中后加入模拟水中)，保持水体pH为7.5，总COD为60mg/L，TN为10mg/L，氨氮为3mg/L，硝氮为7mg/L，亚硝氮为0mg/L，此为模拟城市富营养化景观水体；

(2)实验装置：方形反应器壁厚5mm，填料层厚度为120mm，由粒径0.15-0.20mm，砾石组成，实验装置如图1所示。微污染水从反应器底部进入，出水经跌水充氧后，一部分在蠕动泵的作用下，流回反应器，剩余部分排出，如此反复进行；

(3)实验设备仪器、材料和试剂：仪器设备：加热棒，温度控制器，蠕动泵，分光光度计、离心机、高压蒸汽灭菌锅、超声波清洗仪和造粒装置等。试剂：纳氏试剂、亚硝氮显色剂，盐酸，酒石酸钾钠溶液，氨基磺酸等；

(4)主要影响因素：异养硝化好氧反硝化菌包埋小球结合挺水植物处理微污染水体的生物强化人工湿地反应器对污水的处理影响因素有多种，比如温度、pH、包埋小球的用量、进出水流速等。

选取控制变量法进行探究，保持其他参数不变。一个温度条件实验完毕后，更换原水尽可能保证原始变量相同，达到稳定后再开始测定出水结果。实验过程中未注明条件时的实验参数均为：HRT:24h,进水pH:7.50±0.4，溶解氧：10.1mg/L；

(5)分析方法：NO

实验结果如下：温度是影响微污染水脱氮效果的一个重要因素。脱氮速率一般随温度的升高而加快。具有高效异养硝化好氧反硝化功能的假单胞菌Y1生长的最适温度24-32℃。但实际应用中很难保证菌株在适宜温度下生长，因此本试验温度控制在7-9℃、14-18℃、19-23℃三个区间内。在此温度下探究反应器的处理效果从而找到能够取得较好的处理效果的温度。

由图5-7所示，可以明显的看出随着温度的增加系统中各项指标的去除效率明显增加，在最适宜温度生长时可以在短时间内完全净化微污染水体，而在春秋季节时仍能在10天内完全净化微污染水体，即使在冬季低温环境下，该装置仍能起到一定的水体净化效果，去除率可以达到60％以上。

以上，仅为本发明的具体实施方式，应当指出，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，其余未详细说明的为现有技术。