一种虾青素透明质酸酯、胶束的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种虾青素透明质酸酯、胶束的制备方法及其应用。

背景技术

虾青素又名虾黄素、虾黄质，因其分子中含有很长的共轭双键链和不饱和的α-羟基酮而具有极强的抗氧化性能，是目前为止发现的抗氧化能力最强的物质，其抗氧化能力可达天然VE的100倍以上。虾青素能有效的清除自由基、硫化物、二硫化物，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤，提高机体免疫力，保护视网膜等功效，可应用于保健食品、高档化妆品、药品等领域中。但虾青素属非极性物质，不溶于水，难以均匀添加到水相体系中，且虾青素长的共轭不饱和双键结构非常不稳定，易受光、热、氧化物的破坏而失去活性，这大大限制了虾青素在日化产品中的应用。目前公开较多的技术资料以及研究报告中将虾青素制成微囊、微乳、超分子水溶液等新型制剂，使得虾青素的稳定性与生物利用度得到提高且水溶性得到改善，但是溶剂残留风险、对生产设备要求高、初始投资大等缺点也限制了其发展。

透明质酸是一种酸性粘多糖，广泛存在于结缔组织、上皮组织和神经组织中，为当今公认的最佳保湿成分，所以目前被广泛应用于化妆品中。研究证明，透明质酸功能与其分子量大小密切相关，大分子的透明质酸具有较好的皮肤水合作用，小分子透明质酸透皮作用更优异。除此之外，透明质酸分子链上有着丰富的基团可用于合成各种不同功能的衍生物。目前有不少研究尝试将透明质酸与虾青素结合，以期改善虾青素生物利用度低、不稳定的问题、拓宽透明质酸应用领域使其不再仅仅局限于化妆品中等，如专利CN201410282237.3公开了一种透明质酸功能化虾青素纳米乳制剂，将虾青素油与油相混合形成混合油相，加入表面活性剂，再加入透明质酸水溶液，搅拌即得；专利CN202111562607.5公开了一种透明质酸-虾青素纳米复合物，是通过将透明质酸与乙二胺交联，再与虾青素混合得到。但同时存在溶剂残留风险、水溶性、皮肤渗透性、抗氧化效果差等问题，因此，仍需寻找一种新的虾青素产品制备工艺。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种简单有效的虾青素透明质酸组合物的制备方法，制备得到的产物水溶性好、稳定性高、皮肤渗透作用强、抗氧化效果好，且具有两亲性，该组合物本身及基于其制备成的胶束具有巨大的应用潜力。

本发明的第一个目的是提供一种虾青素透明质酸酯的制备方法，包括以下步骤：

将虾青素溶解于油性溶剂中，与第一透明质酸水溶液混合，酶解，酶解结束后取水相，得到所述虾青素透明质酸酯；

其中，所述第一透明质酸的分子量为2～50kd，酶解所用的酶为具有催化酯键合成功能的酶。

虾青素不溶于水，本发明中，发明人意外发现，虾青素与一定分子量范围的透明质酸在具有催化酯键合成功能的酶作用下，能够催化合成稳定的虾青素透明质酸酯，该物质含有亲水基团与亲油基团，具有两亲性。

进一步地，上述制备方法还包括在所述水相中加入第二透明质酸，所述第二透明质酸的分子量为100kd～3000kd，优选为150kd～1000kd。在以上虾青素透明质酸酯的基础上，发明人将其与另一分子量的透明质酸混合后，具有良好的水溶性和稳定性的同时，还具有更优异的抗氧化效果和更高的透皮吸收效果。

进一步地，所述油性溶剂优选为对机体无害的天然溶剂，更优选为植物油，如山茶油、橄榄油、牡丹籽油、霍霍巴油中的一种或几种的组合，其中，本发明的实施例中选择无异味、不饱和脂肪酸含量较高的山茶油和橄榄油。

进一步地，所述第一透明质酸的分子量优选为5～30kd，更优选的，分子量为5～10kd。

进一步地，所述具有催化酯键合成功能的酶为脂肪酶。

进一步地，酶解温度和pH根据所选择的酶来确定，当选择的酶为脂肪酶时，酶解温度为30～60℃，优选为35～50℃，酶解pH为4～8，优选为6.5～7.5。

进一步地，酶的添加量为体系的0.5％～1.5％。

进一步地，所述虾青素与油性溶剂的质量体积比为0.1～1g:100mL。

进一步地，第一透明质酸水溶液中，第一透明质酸与水的质量体积比为0.1～1g:100mL。

进一步地，将溶解于油性溶剂中的虾青素与第一透明质酸水溶液混合时，两者体积比为10:1～1:10。

进一步地，第二透明质酸与水相的质量体积比为0.03～0.3g：100mL。

本发明的第二个目的是提供上述制备方法制备得到的虾青素透明质酸酯。

本发明的第三个目的是提供一种虾青素透明质酸胶束，所述虾青素透明质酸胶束是由上述虾青素透明质酸酯因具备两亲性特性，于水中经分子自组装形成，胶束中亲油性基团向内，亲水性基团向外。

进一步地，在递送物质时，将待递送物质和虾青素透明质酸酯分别溶解，将两种溶液混合使虾青素透明质酸酯对待递送物质进行包裹，随后向混合液中加水，透析除去未被包裹的递送物质，得到装载待递送物质的虾青素透明质酸胶束。

进一步地，待递送物质可为各类药物，如蛋白质药物、核酸药物、细胞药物等。

进一步地，形成的胶束溶液可应用于食品、化妆品领域，如水、乳、膏、霜等。

本发明的第四个目的是提供上述虾青素透明质酸酯或虾青素透明质酸胶束在食品、化妆品或生物领域中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了一种将虾青素和透明质酸结合的新方法，制备出了一种虾青素透明质酸酯，并基于该两亲性物质制备得到纳米胶束。本发明工艺制得的虾青素透明质酸组合物，克服了虾青素不稳定且不溶于水的问题，且透皮易吸收，有优异的缓释效果。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为虾青素透明质酸酯原料粉；

图2为虾青素、透明质酸和水的物理混合溶液；

图3为虾青素透明质酸酯胶束溶液。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

S1：取虾青素(云南爱尔发生物技术股份有限公司)，溶解于橄榄油中，虾青素与橄榄油的质量体积比为0.1g：100mL。

S2：取分子量2kd透明质酸溶解于水中，透明质酸与水的质量体积比为1g：100mL。

S3：将S1与S2溶液按照体积比例1:10混合，加入脂肪酶Lipozyme435(诺维信)，35℃，pH值7.0条件下，酶添加量为1％，酶解，酶解结束后过滤，静置分层，取水相，冷冻干燥。

实施例2

S1：取虾青素(云南爱尔发生物技术股份有限公司)，溶解于山茶油中，虾青素与山茶油的质量体积比为1g：100mL。

S2：取分子量50kd透明质酸溶解于水中，透明质酸与水的质量体积比为0.1g：100mL。

S3：将S1与S2溶液按照体积比例10:1混合，加入脂肪酶Lipozyme435(诺维信)，50℃，pH值5.0条件下，酶添加量为0.5％，酶解，酶解结束后过滤，静置分层，取水相，冷冻干燥。

实施例3

S1：取虾青素(云南爱尔发生物技术股份有限公司)，溶解于橄榄油中，虾青素与橄榄油的质量体积比为0.1g：100mL。

S2：取分子量2kd透明质酸溶解于水中，透明质酸与水的质量体积比为1g：100mL。

S3：将S1与S2溶液按照体积比例1:10混合，加入脂肪酶Lipozyme435(诺维信)，35℃，pH值7.0条件下，酶添加量为1％，酶解，酶解结束后过滤，静置分层，取水相。

S4：取分子量100kd透明质酸按照重量体积比例0.3g：100mL溶解于S3的水相溶液，冷冻干燥。

实施例4

步骤和具体参数同实施例3，区别在于S2中，第一透明质酸分子量为50kd。

实施例5

步骤和具体参数同实施例3，区别在于S2中，第一透明质酸分子量为25kd。

实施例6

步骤和具体参数同实施例3，区别在于S4中，二号透明质酸分子量为1000kd。

实施例7

步骤和具体参数同实施例3，区别在于S4中，二号透明质酸分子量为3000kd。

实施例8

步骤和具体参数同实施例3，区别在于，步骤S1中，虾青素与橄榄油的质量体积比为1g:100ml。

实施例9

步骤和具体参数同实施例3，区别在于S3中，S1与S2溶液中体积比例为10:1。

实施例10

步骤和具体参数同实施例3，区别在于S4中，二号透明质酸按照重量体积比例0.03g:100ml。

实施例11胶束的制备

取实施例3制备的0.1g的虾青素透明质酸酯原料溶于100ml水溶液中，涡旋5min，磁力搅拌，即可得到胶束溶液。

对比例1一号透明质酸分子量的选择不同

步骤和具体参数同实施例3，区别在于，S2中，一号透明质酸的分子量为100kd。

对比例2无脂肪酶处理

步骤和具体参数同实施例3，区别在于，S3中，将S1与S2溶液按照1:10混合，35℃，pH值7.0条件下孵育，结束后过滤，静置分层，取水相。

对比例3二号透明质酸分子量的选择不同

步骤和具体参数同实施例3，区别在于，S4中，取分子量1kd透明质酸按照重量体积比0.3g：100mL溶解于S3的水相溶液，冷冻干燥。

对比例4二号透明质酸分子量的选择不同

步骤和具体参数同实施例3，区别在于，S4中，取分子量4000kd透明质酸按照重量体积比0.3g：100mL溶解于S3的水相溶液，冷冻干燥。

测试例1胶束表征

通过实施例11得到的胶束溶液呈浅红色、乳光、透明的胶体溶液，见图3。粒径是衡量微粒大小的一个重要指标。将溶液加入适量水稀释，激光粒度测定仪测定粒径大小和PDI。粒径为(60.5±2.1)nm，PDI为0.11±0.03，说明虾青素透明质酸酯胶束的粒度分布小且均匀。

测试例2水溶性测试

将实施例1～10以及对比例1～4制得的产物0.5g加至水中，搅拌，观察是否能与水完全互溶。结果见下表。

图2为虾青素、透明质酸和水的物理混合溶液，图3为本发明制备的虾青素透明质酸酯与水混合后形成的胶束溶液。可见，将虾青素、透明质酸与水混合后，虾青素暗红色油滴浮在透明质酸水溶液表面，三者不能完全相容，而虾青素透明质酸酯可以溶于水并形成稳定的胶束溶液。

测试例3稳定性测试

(1)热稳定性测试

将实施例1～10以及对比例1～4制备的产物置于60℃环境30天后，测定其含量，考察其稳定性。检测方法为高效液相色谱法，色谱柱为C18，柱温30℃，检测器为紫外检测器，检测波长为476nm，进样量20ul，流动相：甲醇，流速为1ml/min。以初始含量为100％进行计算损失率。

经过检测发现，实施例1～10的损失率在10％以内，而对比例1～4损失率在50％以上。

(2)光稳定性测试

将实施例1～10以及对比例1～4制备的产物暴露在强光照射30天，测定其含量，考察其稳定性。检测方法同上。

检测发现实施例1～10的损失率在5％以内，而对比例1～4损失率在30％以上。

测试例4皮肤渗透作用测试

采用经典的透皮扩散实验考察实施例1～10以及对比例1～4所得产物的透皮扩散能力。小鼠处死后，腹部再用剃须刀脱毛，剪取腹部皮肤，剔除皮下脂肪和粘连物，用生理盐水冲洗干净，剪成适当大小固定在供给池与接受池之间，皮肤表层向上，供给池中加入1mL0.02％不同组虾青素组合物溶液，接收池中加满1％吐温80的生理盐水，使得液面与皮肤完全接触，设置搅拌转速400r/min，模拟体表温度(32±0.5)℃，于4、8、12、24h取出各自三组组织，用生理盐水清洗表面残留物5次，剪取有效渗透皮肤，加入4ml提取溶剂，组织研磨粉碎萃取后，离心取上清，液相检测皮肤滞留虾青素含量。计算公式为Qn(单位ug/cm

其中：ρ由标准曲线计算得到的浓度；V：提取液体积；S：实验皮肤的面积。

各组皮肤虾青素滞留量实验结果如下表所示：

根据现有报道，在虾青素0.02％浓度下，在有促渗剂的体系24h透皮吸收实验的虾青素滞留量一般在0.5-1.6ug/cm

测试例5抗氧化人体试验效果评价

将实施例3和对比例3添加到润肤霜基质中，制备成润肤霜，招募15名30-50岁平时有润肤霜习惯的女性消费者进行评价测试，受试者半脸测试，左边用添加实施例3的润肤霜样品，右边用对比例3的润肤霜样品，坚持早晚使用，每天使用两次，连续使用30天后对产品进行评价，对志愿者左右边脸部的弹性、光亮度、水分含量进行测试，结果见下表。

结果证明，添加了实施例3组皮肤整体情况要优于对比例3组。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。