一种调控玉米雄穗分枝数的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控玉米雄穗分枝数的方法。

背景技术

玉米是世界三大粮食作物之一，也是食品、化工、燃料、医药等行业的重要原料。目前玉米已成为我国种植面积最广、单产最高的第一大作物。为了促进国家粮食安全，保障人民生活质量，应对全球人口增长以及全球环境和气候变化带来的压力，提高玉米产量一直是国家发展的重中之重，而提高单位面积玉米产量是优选途径之一。

大量研究表明，提高大田种植密度是提高玉米单产的关键。例如，作为玉米种植和生产大国的美国，其玉米种植密度从上世纪中叶翻了两倍，达到当代的62000-104000株/公顷；同时，单产也从1287公斤/公顷提高到9595公斤/公顷。

为了提高玉米品种的耐密植性，选择合适的雄穗分枝数和大小、雌穗穗位、株高、最佳的生育期和叶夹角等是获得理想株型、产量和生物量的关键指标，也是培育适应机械化作业品种的基础。雄穗大小主要包括雄穗分枝数、小穗数目、分枝夹角和长度，是玉米驯化和遗传改良的重要目标性状。过大的雄穗影响株型的冠层结构，降低植株整体光能利用率，遮挡了本来能达到雌穗的光照。而且玉米花序的发育大致处于同一个时期，雄穗抢夺了雌穗发育需要的光合作用产物和其它营养物质。在密植条件下，较小的雄穗或较少量的雄穗(去雄技术)就能产生足够的花粉供应雌穗授粉而不影响结实率，因此，适度减小的雄穗是一个重要的玉米育种目标。

玉米雄穗分枝数目是典型数量性状，其分化发育过程受到激素、遗传和环境条件的协同调控。目前已鉴定出多条途径参与调控玉米雄穗发育，包括CLV/WUS途径、生长素途径、RAMOSA途径和SPL途径等。由于雄穗分枝是一个数量性状调控的表型，因此需要深入挖掘更多的调控因子。

发明内容

本发明实施例提供一种调控玉米雄穗分枝数的方法。

一种调控玉米雄穗分枝数的方法，包括：

利用T-DNA插入转基因技术构建了两个串联重复的发卡结构的miR529过表达载体；

通过农杆菌EHA105株系将miR529过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；

对多个转基因事件分别通过PCR分子进行验证，并通过Northern blotting的方法挑选miR529在雄穗中表达量升高的独立事件。

具体地，发卡结构的miR529过表达载体包括：使用玉米泛素基因UBI驱动的人工miRNA结构和使用增强CaMV 35S启动子驱动的BAR基因结构。

具体地，所述利用T-DNA插入转基因技术构建了两个串联重复的发卡结构的miR529过表达载体，包括：

在pOT2-Polycis-UN载体中，将两个串联重复的具有发卡结构的miR529克隆到玉米泛素基因UBI启动子下游主干中。

具体地，还包括：

对发卡结构的miR529过表达载体进行测序验证，并将所得的pOT2-Polycis-UN载体经PacI和MluI限制性内切酶进行双重消化；

将消化后回收的UBI-miR529-NOS片段克隆到pZZ00026-PM的二元载体中；

将经sanger测序验证的二元载体导入农杆菌菌株EHA105。

具体地，在构建miR529过表达载体时采用的引物为：OE529-f和OE529-r。

具体地，OE529-f的结构为：GTCGACTCTAGAGGATCCAAGCT。

具体地，OE529-r的结构为：AGAGAGCGTACAGCCTCCAATCC。

本发明实施例的有益效果是：本发明利用过表达转基因技术提高miR529的表达量，在玉米密植群体中，减小了雄穗分枝数，最终提高了单位面积产量。该研究结果对玉米耐密植条件下雄穗形态构成的遗传改良提供了理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的实施例提供的过表达miR529的载体构建和雄穗表型鉴定图。

图2为本发明的实施例提供的过表达miR529的雌穗表型统计图。

图3为本发明的实施例提供的过表达miR529株系的大田密度种植实验图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本发明实施例提供一种调控玉米雄穗分枝数的方法，包括：

步骤一、利用T-DNA插入转基因技术构建了两个串联重复的发卡结构的miR529过表达载体；

步骤二、通过农杆菌EHA105株系将miR529过表达载体转入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多个转基因事件；

步骤三、对多个转基因事件分别通过PCR分子鉴定进行验证，并通过Northernblotting的方法挑选miR529在雄穗中表达量升高的独立事件。

具体地，发卡结构的miR529过表达载体包括：使用玉米泛素基因UBI驱动的人工miRNA结构和使用增强CaMV 35S启动子驱动的BAR基因结构。其中，利用T-DNA插入转基因技术构建了两个串联重复的发卡结构的miR529过表达载体，包括：在pOT2-Polycis-UN载体中，将两个串联重复的具有发卡结构的miR529克隆到玉米泛素基因UBI启动子下游主干中。

本发明实施例还包括：对发卡结构的miR529过表达载体进行测序验证，并将所得的pOT2-Polycis-UN载体经PacI和MluI限制性内切酶进行双重消化；将消化后回收的UBI-miR529-NOS片段克隆到pZZ00026-PM的二元载体中；将经sanger测序验证的二元载体导入农杆菌菌株EHA105。

本发明实施例提供了玉米过表达miR529载体的构建方法：通过整合T-DNA插入实现过表达miR529，使用玉米泛素基因Ubiquitin(UBI)驱动的人工miRNA结构和增强CaMV35S启动子驱动的BAR(吸水链霉菌磷化酶乙酰转移酶)基因，如图1中的A为本发明利用T-DNA插入转基因技术构建了两个串联重复的发卡结构miR529过表达载体的结构。在pOT2-Polycis-UN载体中，将两个串联重复的miR529发卡结构克隆到UBI启动子下游主干中。测序验证后，所得的pOT2-Polycis-UN载体经PacI和MluI限制性内切酶双重消化。然后将回收的UBI-miR529-NOS片段克隆到pZZ00026-PM的二元载体中。将经sanger测序验证的二元载体导入农杆菌菌株EHA105，并将其转化到玉米自交系C01的未成熟胚基因组中。通过PCR鉴定成功的转基因事件，并通过Northern blotting进一步定量miR529表达水平。其中，用于载体构建(miR529-OE-p26)和基因分型(OE529-f/r)的引物如下：

>OE529-f

GTCGACTCTAGAGGATCCAAGCT

>OE529-r

AGAGAGCGTACAGCCTCCAATCC

本发明实施例得到的产物大小为488bp。

本发明实施例中，玉米miRNA529过量表达的表型很突出，对玉米形态建成的影响集中在雄穗，而不影响雌穗或分蘖等其他农艺性状。相比较于以往发现控制雄穗分枝数量的基因，比如unbranched2(ub2)和unbranched3(ub3)，单个的基因对雄穗分枝数量的控制不明显，需要先通过遗传改良获得双突纯合体，或者与TasselSheath4(tsh4)这个基因结合创造三突纯合体。并且，这三个基因的突变体都有较多的分蘖，整体株型不适合农业生产，雌穗也变得相对较小，不利于提高最终的产量。因此，重要性状的单个主要控制遗传因子，如miR529调控雄穗形态建成，具有非常重要的遗传育种和分子改良价值。

为了挖掘调控玉米雄穗形态的遗传因子，之前的研究主要是集中在探索未知的基因上，而microRNA之类小分子RNA较少受到重视。本发明的创新之处在于，明确揭示了一个microRNA(microRNA529)能对玉米雄穗大小起到决定性作用，并通过进一步的大田试验证实了microRNA529可有效提高密植条件下玉米的单位面积产量。

如图1所示为过表达miR529的载体构建和雄穗表型鉴定结果。其中A为过表达miR529的载体；B为Northern blotting鉴定出两个过表达miR529的有效事件；C为过表达miR529的雄穗表型；D为过表达miR529的雄穗表型统计，包括一级分枝数、二级分枝数、小穗对数目。OE529：过表达miR529植株；wt：wild type野生型植株。如图1B所示，通过农杆菌EHA105株系转入玉米自交系C01的不成熟胚中，成功获得20个以上转基因事件，通过PCR分子验证，从这些事件中通过Northern blotting的方法挑选了miR529在雄穗中表达量升高的两个独立事件。结果如C和D所示，过表达miR529玉米植株的雄穗一级分枝数、二级分枝数、小穗对数目都减少，雄穗干穗重量减少。如图2所示，为过表达miR529的雌穗表型统计图，包括穗行数、行粒数和穗粒重。OE529：过表达miR529植株；wt：wild type野生型植株。植株的雌穗无明显表型差异，包括穗行数、行粒数和雌穗粒重。如图3所示，为过表达miR529株系的大田密度种植结果统计。密度种植实验雌穗表型统计，以及不同密度条件下的单位面积产量。OE529：过表达miR529植株；wt：wild type野生型植株。通过在东北铁岭和海南三亚的大田密植实验显示，当种植密度在大于112500株每公顷时，过表达miR529的单位面积产量远远高于野生型，这种高产并不是因为雌穗的性状包括穗行数、行粒数、穗粒重和百粒重带来的。

本发明实施例中，miR529过表达载体为miR529-OE-p26，其全长序列为：

>pZZ00026-UN-dModuZmamiR529(miR529-OE-p26全长序列)

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。