具有组织修复和消炎功效的纳米组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，特别涉及一种具有组织修复和消炎功效的纳米组合物及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤是人体面积最大的器官，在抵御外来化学物质及病原微生物、体温调节、维持内环境稳定、避免体内水分流失等方面发挥着十分重要的作用，但手术、感染、辐射、外压、烧烫伤、病理因素(糖尿病或其他血管疾病)等会造成皮肤创伤。皮肤创伤是皮肤受外界的致伤因素或人体内部因素所造成的缺损或伤害，伴随着皮肤屏障完整性的破坏和功能性的受损，易引发多种皮肤疾病，如湿疹、银屑病、接触性皮炎和特异性皮炎等。

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，因其良好的物理化学性质被广泛应用于生物材料领域。另外，胶原蛋白还具有很好的凝血作用，且对缺损组织的修复、再生及重建有着显著促进作用。胶原蛋白免疫原低、生物相容性好且易加工成型，目前在组织修复方面的应用主要是以胶原蛋白为基质原料，制成多种不同类型和形状的材料。如利用静电纺丝技术，将胶原蛋白制备医用敷料，用于皮肤组织修复；又或基于胶原蛋白制备成蛋白海绵，作为皮肤轻度创面伤口修复敷料。然而，上述胶原蛋白在皮肤修复中的应用，主要在皮肤外层起作用，其难以穿透皮肤角质层。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

本发明另一目的在于提供上述具有组织修复和消炎功效的纳米组合物的制备方法。

本发明再一目的在于提供上述具有组织修复和消炎功效的纳米组合物的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种具有组织修复和消炎功效的纳米组合物，所述纳米组合物由阳离子聚合物包载胶原蛋白和溶菌酶形成，所述阳离子聚合物的分子链段含亲水嵌段和疏水嵌段。

在一些实施方式中，所述阳离子聚合物的分子量为Mn＝17820-29631，优选为23726。

在一些实施方式中，所述阳离子聚合物的疏水嵌段为聚甲基丙烯酸酯类，其包括聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)、聚甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(PDEAEMA)、聚甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(PDIPAEMA)、聚甲基丙烯酸-2-叔丁基氨基乙酯(PTBAEMA)中的一种或多种。

优选的，所述阳离子聚合物的疏水嵌段包括聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)，其由甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)，通过原子转移自由基聚合反应(ATRP)得到，聚合度为20-40，所述聚甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯的分子量为3100-6300。

优选的，所述阳离子聚合物的疏水嵌段包括聚甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯，其由甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAEMA)，通过ATRP反应得到，聚合度为20-40，所述聚甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯的分子量为3700-9300。

优选的，所述阳离子聚合物的疏水嵌段包括聚甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯，其由甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯(DIPAEMA)，通过ATRP反应得到，聚合度为20-40，所述聚甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯的分子量为4200-8600。

优选的，所述阳离子聚合物的疏水嵌段包括聚甲基丙烯酸-2-叔丁基氨基乙酯(PTBAEMA)，由甲基丙烯酸-2-叔丁基氨基乙酯(TBAEMA)，通过ATRP反应得到，聚合度为20-40，所述甲基丙烯酸-2-叔丁基氨基乙酯的分子量为3700-7500。

在一些实施方式中，所述聚合物的亲水嵌段为聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(PMPC)。

优选的，所述聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，通过ATRP反应得到，聚合度为20-40，所述聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的分子量为11800-23600。

在一些实施方式中，所述阳离子聚合物的制备方法包括以下步骤：

将所述阳离子聚合物的疏水嵌段对应的聚合单体甲基丙烯酸酯类、双[2-(2’-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物和N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺溶于有机溶剂中，在惰性气体保护下加入催化剂，在40-80℃条件下反应12-48h；再加入阳离子聚合物的亲水嵌段的聚合单体(MPC)，在40-80℃条件下继续反应12-48h；制备得到所述阳离子聚合物。

在一些实施方式中，所述有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中至少一种；优选为四氢呋喃。

在一些实施方式中，所述的催化剂包括CuBr、CuCl、CuI中的至少一种，优选为CuBr。

在一些实施方式中，双[2-(2’-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物和所述疏水嵌段的聚合单体甲基丙烯酸酯类的摩尔比为1:10～50；所述双[2-(2’-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物和所述亲水嵌段的聚合单体MPC的摩尔比为1:40～80。

在一些实施方式中，所述双[2-(2’-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物和N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺的摩尔比为1：4～8；所述双[2-(2’-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物和催化剂的摩尔比为1：4～8。

在一些实施方式中，在所述ATRP反应结束后，还包括纯化步骤：

将反应混合物通过中性氧化铝柱洗脱除去催化剂，洗脱液经旋蒸浓缩后，将浓缩液滴入正己烷中沉淀，收集固体产物，在40-60℃条件下干燥12-48h，得到所述阳离子聚合物。

优选的，在所述反应产物通过中性氧化铝柱的步骤中，洗脱液为四氢呋喃溶液。

优选的，所述旋蒸浓缩的温度为30-60℃，转速为100-450rpm。

一种上述的具有组织修复和消炎功效的纳米组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)把阳离子聚合物溶于溶剂中，加热搅拌，待所述聚合物溶解后，获得聚合物溶液；

(2)将胶原蛋白和溶菌酶加入至水中，加热搅拌，待胶原蛋白和溶菌酶溶解后，获得水相溶液；

(3)将所述聚合物溶液加入到所述水相溶液中，搅拌，获得混合溶液；

(4)混合溶液经高速剪切分散处理和高压微射流均质处理，获得具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

在一些实施方式中，步骤(1)所述的阳离子聚合物在所述纳米组合物的质量百分比为1-7％，优选为3-7％；

在一些实施方式中，步骤(1)所述的溶剂包括二氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇、甘油、丁二醇、戊二醇、己二醇、乙二醇、季戊四醇、双丙甘醇、缩二乙二醇中的至少一种；所述溶剂的用量满足在所述纳米组合物中溶剂的质量百分比为20-40％；

在一些实施方式中，步骤(1)和步骤(2)中所述的加热温度均相互独立的为40-65℃；搅拌速度均相互独立的为30-300rpm；搅拌时间均相互独立的为10-60min；

在一些实施方式中，步骤(2)中所述胶原蛋白在所述纳米组合物的质量百分数为1-10％，优选为1-7％；

在一些实施方式中，步骤(2)中所述溶菌酶在所述纳米组合物的质量百分数为0.1-2％；

在一些实施方式中，步骤(2)中所述胶原蛋白和所述溶菌酶的质量比为1:0.05-0.2；

在一些实施方式中，步骤(2)中所述水的用量满足其在所述纳米组合物中质量百分数为41.0-77.9％；

在一些实施方式中，步骤(3)中所述聚合物溶液的加入速度为0.5-20mL/min，优选为0.5-3.0mL/min。

在一些实施方式中，步骤(3)中，所述的搅拌速度为30-300rpm；搅拌时间为10-60min；

在一些实施方式中，步骤(4)中所述的高速剪切分散处理为采用高剪切均质乳化机进行剪切均质，其中高剪切均质乳化机转速为5000-9000rpm，剪切分散时间为3-15min。

在一些实施方式中，步骤(4)中所述的高压微射流均质处理为采用微射流均质机，其中均质压力为50-120Mpa，均质循环次数为1-6次。

可选的，在本发明的一些实施方式中，步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中的搅拌方式为磁力搅拌。

上述的具有组织修复和消炎功效的纳米组合物在化妆品领域、医药领域中的应用，尤其是在制备化妆品以及制备具有组织修复和消炎功效的药物中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明制备得到的两亲性阳离子聚合物，对胶原蛋白和溶菌酶进行包裹，得到一种组织修复和消炎的纳米组合物，与胶原蛋白和溶菌酶相比，本发明的纳米组合物表现出更好的修护(促进细胞增殖和细胞迁移)和消炎效果。

附图说明

图1是使用实施例1-4、对比例6、对比例7、胶原蛋白(5％的溶液)、溶菌酶(0.5％的溶液)、溶菌酶+胶原蛋白(5％+0.5％的溶液)后TNFα的含量。

图2是使用实施例1-4、对比例6、对比例7、胶原蛋白(5％的溶液)、溶菌酶(0.5％的溶液)、溶菌酶+胶原蛋白(5％+0.5％的溶液)后TNFα的抑制率。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的实施例中，ATRP反应聚合单体DMAEMA、DEAEMA、DIPAEMA、DTBAEMA、MPC均可直接从市场购买得到。

实施例中给药浓度是指实施例或对比例中制备得到的纳米组合物用去离子水稀释后的浓度，为质量百分比浓度整个申请文件中，除特殊说明外，均是指质量百分比。

实施例1

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将制得的阳离子聚合物PMPC

实施例2-4(聚丙烯酸酯种类不同)

实施例2

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例3

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例4

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例5-6(疏水嵌段PDEAEMA的聚合度不同)

实施例5

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例6

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例7-8(亲水嵌段PMPC的聚合度不同)

实施例7

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例8

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例9-10(聚合物投料比)

实施例9

将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例10

将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

实施例11-13(胶原蛋白投料比)

实施例11

将实施例1中的质量百分比为5％的胶原蛋白更改为质量百分比为1％的胶原蛋白，去离子水的质量百分比适当调整至65.5％，以使总质量百分比为100％，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

实施例12

将实施例1中的质量百分比为5％的胶原蛋白更改为质量百分比为3％的胶原蛋白，去离子水的质量百分比适当调整至63.5％，以使总质量百分比为100％，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

实施例13

将实施例1中的质量百分比为5％的胶原蛋白更改为质量百分比为7％的胶原蛋白，去离子水的质量百分比适当调整至59.5％，以使总质量百分比为100％，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

实施例14(工艺)

PMPC

将制得的阳离子聚合物PMPC

实施例15

PMPC

将制得的阳离子聚合物PMPC

实施例16-19(制备纳米组合物时溶剂的种类及配比)

实施例16

将实施例1中“20％甘油、5％1,3-丙二醇和5％1,4-丁二醇”改为30％甘油，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

实施例17

将实施例1中“20％甘油、5％1,3-丙二醇和5％1,4-丁二醇”改为30％1,3-丙二醇，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

实施例18

将实施例1中“20％甘油、5％1,3-丙二醇和5％1,4-丁二醇”改为30％1,4-丁二醇，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

实施例19

将实施例1中“20％甘油、5％1,3-丙二醇和5％1,4-丁二醇”改为10％甘油、10％1,3-丙二醇、10％1,4-丁二醇，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

对比例1(未包裹)

将质量百分比为20％的甘油、5％的1,3-丙二醇和5％1,4-丁二醇混合均匀，制得混合醇溶液，将质量百分数为5％的胶原蛋白和质量百分数为0.5％的溶酶菌加入至质量百分数为64.5％的去离子水中，在40℃下保持搅拌(转速为450rpm)1h，待胶原蛋白和溶菌酶充分溶解，获得水相溶液；在40℃和搅拌的条件下(转速为300rpm)，将水相以1ml/min的滴加速率，均速滴加至混合醇溶液中，滴加完成后，继续搅拌(450rpm)1h；然后经高速剪切(8000rpm)分散10min；再经高压微射流处理，均质压力为80MPa，均质次数为3次，获得组织修复和消炎组合物。此步骤中的百分数均是指各组分占纳米组合物的质量百分数。

对比例1和实施例1的区别在于，对比例1中未采用阳离子聚合物对胶原蛋白和溶菌酶进行包裹。

对比例2(PDEAEMA的聚合度为10)

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

对比例3(PDEAEMA的聚合度为50)

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

对比例4(PMPC的聚合度为10)

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

对比例5(PMPC的聚合度为50)

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

对比例6(HO-PLA-HO替换PDEAEMA)

(1)阳离子聚合物PMPC

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

对比例7(MPEG替换MPC)

(1)阳离子聚合物PMPEG

(2)将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

对比例8(聚合物1％)

将实施例1中的质量百分比为3％的阳离子聚合物PMPC

对比例9(胶原蛋白10％)

将实施例1中的质量百分比为5％的胶原蛋白更改为质量百分比为10％的胶原蛋白，去离子水的质量百分比适当调整至56.5％，以使总质量百分比为100％，其余不变，制备得到具有组织修复和消炎功效的纳米组合物。

测试例1-粒径测定

采用马尔文Nano-ZS90动态光散射粒度分析仪表征上述实施例1-19和对比例1-9样品的粒径和粒径分布系数，测试角为90°，测试温度为25℃，每组实验均进行三次平行实验，实验结果取其算术平均值。

测试例2-包封率测定

对实施例1-19和对比例1-9样品进行胶原蛋白的包封率测定：取200μL具有组织修复和消炎功效的纳米组合物，经超滤离心(9000rpm，30min)，取5μL滤液经高效液相色谱仪(HPLC，日本岛津)测定滤液中胶原蛋白的含量，即得具有组织修复和消炎功效的纳米组合物中未被包裹的胶原蛋白的含量。另取上述具有组织修复和消炎功效的纳米组合物，加入去离子水，按样品：去离子水＝1:9(v/v)超声破乳30min，0.45μm有机滤膜过滤后，取5μL样品溶液经高效液相色谱仪(HPLC，日本岛津)测定胶原蛋白的含量，即得具有组织修复和消炎功效的纳米组合物中胶原蛋白的总含量。根据公式(1)计算具有组织修复和消炎功效的纳米组合物中胶原蛋白的包封率(EE)。HPLC系统所用分析柱为非极性C18柱，流动相为乙腈，流速为1.0mL/min，色谱柱柱温为30℃，每组实验均进行三次平行实验，实验结果取其算术平均值。

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实施例1-19和对比例1-9的粒径表征和包封率测试结果如表1所示。

表1实施例1-19和对比例1-9样品的粒径和包封率结果

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对比实施例1-4可知，阳离子聚合物中，疏水嵌段聚丙烯酸酯的种类不同，最终制备得到的具有组织修复和消炎功效的纳米组合物的粒径和包封率不同。实施例1-4中，疏水嵌段聚丙烯酸酯分别为PDEAEMA、PDMAEMA、PDIPAEMA、PDTBAEMA，结果表明，实施例1样品的粒径最小，为82.6nm，且包封率最高，为77.8％。在本发明中，聚合物疏水嵌段选用聚丙烯酸酯PDEAEMA，聚合物对胶原蛋白的包封效果最好。

对比实施例1、实施例5、实施例6、对比例2和对比例3可知，疏水嵌段PDEAEMA的聚合度会影响最终产品的粒径和包封率。随着聚丙烯酸酯嵌段的聚合度增加，产品的粒径逐渐增加，当聚丙烯酸酯嵌段的聚合度达到50时，产品的粒径突然增大至121.3nm。随着聚丙烯酸酯嵌段的聚合度增加，产品的包封率则先增加后下降，当聚丙烯酸酯嵌段的聚合度为10和50时，产品的包封率均较低，因此，本申请选择聚丙烯酸酯嵌段的聚合度为20-40，其中优选为30(实施例1)。

对比实施例1、实施例7、实施例8、对比例4和对比例5可知，阳离子嵌段PMPC的聚合度最终影响产品的粒径和包封率。随着PMPC的聚合度增加，产品的粒径先降低后增加，包封率则先增加后降低。当阳离子嵌段PMPC的聚合度为10和50时，产品的包封率均较低，因此，本申请选择阳离子嵌段PMPC的聚合度为20-40，优选为30(实施例1)。

对比实施例1、对比例6、7可知，阳离子聚合物中亲水嵌段和疏水嵌段的种类影响最终影响产品的粒径和包封率。相比聚酯(PCL)和聚乙二醇酯(MPEG)，采用聚丙烯酸酯(PDEAEMA)为疏水嵌段；采用阳离子PMPC为亲水嵌段，合成的聚合物对胶原蛋白和溶菌酶进行包裹，得到的最终产品粒径更小，包封率更高。

对比实施例1、实施例9、实施例10和对比例8可知，随着阳离子聚合物的质量百分比增加，样品的粒径逐渐增大；包封率则先增加后下降，当阳离子聚合物的质量百分比为3％时，样品的包封率最高，为77.8％，此时样品的粒径为82.6nm。

对比实施例1、实施例11-13和对比例9可知，随着胶原蛋白的质量百分比增加，样品的粒径逐渐增加，包封率则先增加后下降。当胶原蛋白的质量百分比为5％时，样品的包封率最高，为77.8％，此时样品的粒径为82.6nm。

对比实施例1，实施例16-19可知，制备纳米组合物的溶剂的种类及配比影响最终产品的粒径和包封率，在本发明中，选用甘油、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇的混合溶剂制备得到的纳米组合物的粒径更小，包封率更高；其中甘油、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇的最优配比为20:5:5。

测试例3-透皮吸收(促渗)测试

使用透皮吸收(促渗)试验评价实施例1-8和对比例1-9对胶原蛋白的透皮吸收(促渗)能力的影响。具体方法如下：

体外透皮实验选用垂直式扩散池，以裸鼠皮肤为模型(腹部皮肤，去除皮下脂肪层和血管)。接收液为PBS溶液。将皮片固定在供给池与接收池之间，皮肤层向上，平衡20min。各样品取液加入供给池，在1h、2h、6h、8h和24h后取接收液。接收液用去离子水超声破乳，然后通过高效液相色谱(HPLC，日本岛津)测定胶原蛋白的含量，并以此计算单位面积累计透过量。每组实验均进行三次平行实验，实验结果取其算术平均值。皮片上单位面积累计透过量的计算公式如公式(2)：

其中，Q

表2实施例1-8和对比例1-9样品中的胶原蛋白单位面积透过量

实施例1-8和对比例1-9样品的胶原蛋白透皮吸收表征结果如表2所示。从表中的结果可看出，疏水嵌段聚丙烯酸酯的种类、聚丙烯酸酯的聚合度、亲水嵌段阳离子聚合物PMPC的聚合度均会影响胶原蛋白的透皮吸收效果。

实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于实施例2-4，说明疏水嵌段聚丙烯酸酯的种类影响胶原蛋白的透皮吸收效果。本发明中，当聚丙烯酸酯为PDEAEMA时，其经阳离子MPC接枝聚合后的聚合物，包裹胶原蛋白，得到的产品具有更好的透皮吸收效果。

实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于实施例5-6和对比例2-3，说明疏水嵌段聚丙烯酸酯的聚合度影响胶原蛋白的透皮吸收效果。本发明中，当聚丙烯酸酯的聚合度为30时，最终产品具有更好的透皮吸收效果。

实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于实施例7-8和对比例4-5，说明亲水嵌段PMPC的聚合度影响胶原蛋白的透皮吸收效果。本发明中，当亲水嵌段PMPC的聚合度为30时，最终产品具有更好的透皮吸收效果。

实施例1在1h、4h、8h和24h的透皮吸收效果均优于对比例6、对比例7，说明相比聚酯(PCL)和聚乙二醇酯(MPEG)，采用聚丙烯酸酯(PDEAEMA)为疏水嵌段；采用阳离子PMPC为亲水嵌段，合成的聚合物对胶原蛋白进行包裹，得到的产品具有更好的透皮吸收效果。

测试例4-抗炎测试—TNFα含量测定

本次抗炎测试对象为实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、胶原蛋白(5％的水溶液)、溶菌酶(0.5％的水溶液)、胶原蛋白和溶菌酶的混合水溶液(胶原蛋白和溶菌酶的浓度分别为5％以及0.5)，抗炎测试分为细胞毒性测试和TNFα含量测定两个步骤。

测试步骤1：细胞毒性测试

试验材料

细胞系：小鼠巨噬细胞Raw 264.7。培养液：含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。培养条件：37℃，5％ CO

试验步骤

细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每孔细胞数为3×10

暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同浓度的测试样品(实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白水溶液、0.5％溶菌酶水溶液和5％胶原蛋白+0.5％溶菌酶水溶液混合样品的给药浓度均依次为1.25wt％、2.5wt％、5wt％、10wt％，以及阴性对照(阴性对照即加入100μL的培养液，即正常状态下培养的细胞)。培养箱孵育24h。倒置显微镜下观察细胞形态和特性。

MTT测试

每孔加入100μL 0.1mg/mL MTT溶液，培养箱孵育4h。去除孔中液体，每孔加入150μL DMSO，置于振荡器振荡15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值。

数据分析

各组数据以均值±标准差表示，以阴性对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(Viability)，在本次抗炎测试中，选择细胞活性≥90％的浓度作为巨噬细胞的最高安全浓度，抗炎测试浓度选择范围不应超过此最高安全浓度。

表3实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白水溶液、0.5％溶菌酶水溶液和5％胶原蛋白+0.5％溶菌酶水溶液混合样品的细胞毒性测试结果

实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白水溶液、0.5％溶菌酶水溶液和5％胶原蛋白+0.5％溶菌酶水溶液混合样品的细胞毒性的测定结果如表3所示。从表中的结果可以看出，上述实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白水溶液、0.5％溶菌酶水溶液和5％胶原蛋白+0.5％溶菌酶水溶液混合样品在5％浓度(给药浓度)范围内，细胞存活率均大于90％，细胞无明显细胞毒性。因此样品浓度选择3％，将上述测试样品配制成3％的溶液进行TNFα含量测定。

测试步骤2：TNFα含量的测定

实验原理：巨噬细胞是免疫效应细胞，具有多种免疫调节功能，因此常被作为一种理想的模型来评价一些生物活性物质的免疫调节性能。当机体中存在过量的细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)时，会诱导巨噬细胞释放TNFα、NO、ILs等炎症介质，进而引发机体的炎症反应。其中，TNFα可以促进T细胞产生各种炎症因子促进炎症反应，是重要的炎症因子之一。通过LPS体外刺激巨噬细胞建立炎症模型，是研究活性组分的抗炎功效的经典细胞模型。

TNFα含量的测定采用酶联免疫方法(ELISA)，具体原理为：TNFα与包被在酶标板上的TNFα抗体特异性结合后，与带有底物标记的抗TNFα抗体结合，底物被酶催化后，生成有色产物，TNFα含量与有色产物颜色的深浅呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定光密度值(OD)，计算TNFα含量。

(2)试验步骤

细胞培养：将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔细胞数为3×10

暴露：弃去孔中原培养液，样品组各孔加入3％的样品溶液，阴性对照组与建模组补加完全培养基，预处理2h，建模组和样品组加10ng/mL的脂多糖，培养24h。建模组中仅加入100μL 10ng/mL的脂多糖，目的是刺激刺激巨噬细胞产生TNFα，从而实验“炎症”的反应。阴性对照组即正常培养的细胞。

ELISA测试：吸取培养基，离心取上清，测试上清液中TNFα的含量。

实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白溶液、0.5％溶菌酶溶液、胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液(混合溶液中胶原蛋白含量为5％，溶菌酶为0.5％)样品的抗炎测试结果如图1和图2所示。使用实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白溶液、0.5％溶菌酶溶液、胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液样品后，TNFα的含量分别为9.841ng/mL(实施例1)、12.647ng/mL(实施例2)、13.154ng/mL(实施例3)、13.664ng/mL(实施例4)、14.754ng/mL(对比例1)、17.110ng/mL(对比例6)、16.684ng/mL(实施例7)、26.654ng/mL(5％胶原蛋白溶液)、15.648ng/mL(0.5％溶菌酶溶液)、15.101ng/mL(胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液)。与LPS组(即建模组，35.516ng/mL)相比，实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白溶液、0.5％溶菌酶溶液、以及胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液样品对炎症因子TNFα生产的抑制率分别为72.3％、64.4％、62.9％、61.5％、58.4％、51.8％、53.0％、24.9％、55.9％和57.5％。上述结果可说明实施例1的具有组织修复和消炎功效的纳米组合物的抗炎效果最优，优于实施例2-4、对比例6、对比例7、5％胶原蛋白溶液、0.5％溶菌酶溶液、以及胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液样品。

测试例5-组织修复

促细胞生长实验

将复苏好的人成纤维细胞或表皮细胞制成单细胞悬浮液并统计数量，使细胞密度为10

(2)细胞迁移实验

①细胞铺板：以记号笔均匀地分割6孔板，中间间隔0.5-1cm，每个孔至少横穿3条线，每孔中大约加入5×10

②划痕实验：第2天使用移液枪吸头垂直于横线进行划痕，用PBS清洗细胞3次，洗脱被划下的细胞，加入至含有RHC的无血清培养基中，作为对照组；加入至含有测试样品的培养基中，作为实验组，最终浓度为3％(给药浓度)。在37℃，5％ CO

③数据处理：根据公式(2)计算不同时间段之间细胞整体迁移的距离。

S

其中，S

表4实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液、溶菌酶水溶液和胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液对细胞增殖的影响

表5实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液、溶菌酶水溶液、以及胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液的细胞迁移实验结果

实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液、溶菌酶水溶液以及胶原蛋白和溶菌酶的混合溶液样品对成纤维细胞和表皮细胞增殖实验结果如表4所示。从表中结果可看出，溶菌酶溶液的结果与空白组的结果相似，溶菌酶溶液不能促进成纤维细胞和表皮细胞增殖。相比空白组，上述实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液以及胶原蛋白+溶菌酶的混合溶液样品均可促进成纤维细胞和表皮细胞增殖，且实施例1的具有组织修复和消炎功效的纳米组合物的促进成纤维细胞和表皮细胞增殖效果最优，优于实施例2-4、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液以及胶原蛋白+溶菌酶的混合溶液样品。

实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液、溶菌酶水溶液、以及胶原蛋白+溶菌酶的混合溶液样品对成纤维细胞和表皮细胞的细胞迁移实验结果如表5所示。从表中结果可看出，溶菌酶溶液不能促进成纤维细胞和表皮细胞的细胞迁移，其没有促进组织修护的能力。相比空白组，上述实施例1-4、对比例1、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液、溶菌酶水溶液、以及胶原蛋白+溶菌酶的混合溶液样品均促进成纤维细胞和表皮细胞迁移，且实施例1的具有组织修复和消炎功效的纳米组合物的促进成纤维细胞和表皮细胞迁移效果最优，优于实施例2-4、对比例6、对比例7、胶原蛋白水溶液、溶菌酶水溶液、以及胶原蛋白+溶菌酶的混合溶液样品。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。