一种具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的组合物及其应用

技术领域

本发明属于药品、保健品和食品技术领域。更具体地，涉及一种具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的组合物及其应用。

背景技术

高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)是一种常见的代谢性疾病，尿酸是尿液中的含氮成分，是人体蛋白质和嘌呤代谢的难溶的最终产物，由嘌呤代谢失调引起，导致血液中尿酸生成增加，通常以血清尿酸水平升高为特征。尿酸是氨基酸代谢的副产物，氨基酸的分解在肝脏中产生尿酸。此外，嘌呤的分解会释放出少量的尿酸。高尿酸血症难以完全治愈，需要长期服药，且人尿液和血液中的尿酸可形成尖锐的晶体，还会增加痛风的风险。

黄嘌呤氧化酶(XOD)被认为是是导致体内尿酸升高的一种关键酶，可以持续性地氧化黄嘌呤和次黄嘌呤转化为尿酸，从而导致体内尿酸升高。药物若是能够通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，则能够达到降尿酸的作用，进而起到治疗高尿酸血症的作用。痛风、高尿酸血症等病症就是由于人体内代谢的终产物尿酸没有被分解，在体内累积所引起的，所以寻找黄嘌呤氧化酶抑制剂对此类疾病的临床治疗有重要的意义。

然而，因目前的黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物如别嘌呤醇和非布司他等化学药存在较大的毒副作用，可能造成肝肾功能损伤等严重疾病，且成本较高，在应用时会受到一定限制。因此寻找新的黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物十分必要。中成药相较于化学药具有较高的安全性，其疗效稳定、毒副作用小，且我国有着悠久的中草药应用历史；因此，为了能够实现治疗或预防高尿酸血症及相关的疾病，亟需开发更多副作用小且疗效较好的黄嘌呤氧化酶抑制剂药物。如现有技术中公开了一种用于降尿酸的天然组合物及其用途及黄嘌呤氧化酶抑制剂，采用肉桂、甘草和番石榴干等能够抑制黄嘌呤氧化酶，但其抑制效果还有待提高；而其他能够抑制黄嘌呤氧化酶的中药组合物都采用了四种以上的不同中药组分进行复配得到，需要合理配伍各中药组分之间的药性和药效，其制备方法复杂，且组成的复方中功效太过于宽泛，其抑制效果也有待提高。因此，研发更多效果稳定、毒副作用较小、价格相对便宜的具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的纯天然中药组合物，用于抑制黄嘌呤氧化酶，降低尿酸具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物的毒副作用较大、疗效不稳定、成本较高的缺陷和不足，提供一种由纯天然植物提取物制备得到的能够抑制黄嘌呤氧化酶的组合物及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的组合物。

本发明第二个目的是提供所述组合物的应用。

本发明第四个目的是提供一种黄嘌呤氧化酶抑制剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的组合物，由桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物组成。本研究显示，将桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物这四种中草药提取物复配得到的组合物具有显著的黄嘌呤氧化酶抑制作用，从而减少黄嘌呤和次黄嘌呤转化为尿酸，降尿酸效果好，药效明显优于各组分单独使用或不同组分配合使用的简单叠加，具有显著的协同增效作用。本发明提供的组合物均提取自四种纯天然植物中药，其毒副作用较低，能减少对人体的伤害，容易获取，价格便宜。

优选地，所述桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物的质量比为(1～3)∶(1～3)∶(1～3)：(1～3)。

更优选地，所述桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物的质量比为(2～3)∶(2～3)∶(2～3)：(1～2)。

进一步优选地，所述桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物的质量比为2∶2∶2：1。

优选地，所述桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物均为醇提物。

本发明提供所述组合物的制备方法，分别取桑叶、车前草、积雪草、益智粉碎后，加入醇溶剂浸泡、回流、减压过滤，通过减压蒸馏回收醇溶剂，得到湿浸膏，再进行冷冻干燥，分别得到桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物，将这四种提物按比例进行混合后即得。

优选地，所述醇溶剂采用8～12倍量的30～65％乙醇。所述8～12倍量指溶剂体积与原料质量的比值，例如1g粉碎后的中药原料加入8～12mL醇溶剂。

更优选地，将粉碎后的桑叶、车前草、积雪草、益智依次分别加入10倍量的30％乙醇，40％乙醇，45％乙醇，60％乙醇中分别进行浸泡、回流、减压过滤。

本发明提供所述组合物在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂和在制备降尿酸药物中的应用。

本发明提供一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，含上述具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的组合物。

本发明提供还所述抑制剂在制备高尿酸血症或痛风治疗药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究显示将桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物复配得到的组合物具有良好黄嘌呤氧化酶抑制作用，降尿酸效果好，药效明显优于各组分单独使用或不同组分配合使用的简单叠加，抑制率可达88.94％，具有显著的协同增效作用。本发明组合物中的四种提取物均提取自纯天然植物中药，毒副作用较低，能减少对人体的伤害，而且，价格相对便宜，能够克服现有黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物的毒副作用较大、疗效不稳定、成本较高的缺陷和不足，具有较大的应用前景。

具体实施方式

以下结合说明书具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明用于乙醇提取的四种植物：桑叶、车前草、积雪草，益智均购自北京同仁堂，洗干净晒干备用。

桑叶(Folium Mori)，来自于桑科植物桑，是其干燥全叶，是一种药用植物，主要成分有黄酮、桑叶生物碱、多糖、氨基酸和微量元素等。桑叶具有抗肿瘤、抗低血压、抗炎、抗糖尿病、降血糖、降脂、有调节肠道菌群的功效。

车前草(Plantago asiatica L.)，又名当道、凤眼车前、车轮菜等，为车前科车前属植物。车前草的主要成分有黄酮苷、酚类、苯乙醇苷类、四萜、甾体类、生物碱、多糖等。车前草能够抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、利尿等作用。

积雪草(Centella Asiatica(L.)Urban)，是伞形科植物积雪草的干燥全草。积雪草的主要成分有四萜类、挥发油类、黄酮类、甾醇类、生物碱、木质素类、多糖、槲皮素等。积雪草具有护肝、保护胰岛、抗溃疡、抗癌等作用。

益智(Alpinia oxyphylla Miq)，姜科，山姜属多年生草本植物。具有温脾止泻摄涎，暖肾缩尿固精之功效。常用于脾胃虚寒，呕吐，泄泻，腹中冷痛，口多唾涎，肾虚遗尿，尿频，遗精，白浊。

本发明采用的乙醇、甲醇、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、二甲亚砜、别嘌呤醇、氢氧化钠、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸和磷酸二氢钾均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，甲醇为分析纯，试验用的所有水均为超纯水

实施例1组合物的制备

分别取桑叶、车前草、积雪草，益智于粉碎机中粉碎备用，再取桑粉、车前草粉、积雪草粉，益智粉分别依次加入10倍量30％乙醇，40％乙醇，45％乙醇，60％乙醇浸泡24h，回流3次，减压过滤，减压蒸馏回收乙醇，得到湿浸膏，将湿浸膏放于冷冻干燥机24h干燥得乙醇提取物冻干粉备用。

本实施例提供的组合物，按照质量比2∶2∶2：1，分别取以上步骤制备得到的桑叶提取物200g、车前草提取物200g、积雪草提取物200g和益智提取物100g，将四种提物进行混合后即得。

实施例2组合物的制备

分别取桑叶、车前草、积雪草于粉碎机中粉碎备用，再取桑粉、车前草粉、积雪草粉，益智粉分别依次加入8倍量30％乙醇，40％乙醇，45％乙醇，60％乙醇浸泡24h，回流3次，减压过滤，减压蒸馏回收乙醇，得到湿浸膏，将湿浸膏放于冷冻干燥机24h干燥得乙醇提取物冻干粉备用。

本实施例提供的组合物，按照质量比2∶2∶2：1，分别取以上步骤制备得到的桑叶提取物200g、车前草提取物200g、积雪草提取物200g和益智提取物100g，将四种提物进行混合后即得。

实施例3组合物的制备

分别取桑叶、车前草、积雪草于粉碎机中粉碎备用，再取桑粉、车前草粉、积雪草粉，益智粉分别依次加入12倍量30％乙醇，40％乙醇，45％乙醇，60％乙醇浸泡24h，回流3次，减压过滤，减压蒸馏回收乙醇，得到湿浸膏，将湿浸膏放于冷冻干燥机24h干燥得乙醇提取物冻干粉备用。

本实施例提供的组合物，按照质量比2∶2∶2：1，分别取以上步骤制备得到的桑叶提取物200g、车前草提取物200g、积雪草提取物200g和益智提取物100g，将四种提物进行混合后即得。

实施例4组合物的制备

本实施例同时制备了多组不同成分的组合物，其组合物成分如下表1所示，对桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取和益智提取物的制备方法同实施例1。

表1不同成分的组合物的制备

实施例5组合物对黄嘌呤氧化酶的抑制活性

1、溶液配置

(1)磷酸盐缓冲溶液：精密称取28.2mg EDTA、6.94g K

(2)黄嘌呤氧化酶溶液：取2mL 100U/mL黄嘌呤氧化酶溶液置于6℃冰箱备用，使用前加入磷酸缓冲溶液稀释至0.10U/mL。

(3)黄嘌呤溶液：称取7.96mg黄嘌呤，加入50mL容量瓶中，加入600μL1mol/L的NaOH溶液，超声促溶至溶液澄清，使用磷酸盐缓冲液定容，超声30min，得到黄嘌呤溶液备用。

(4)样品溶液：分别取实施例1～4中制备的组合物溶解于磷酸盐缓冲溶解中，使其样本溶液的终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL备用。

2、试验方法

分别设置酶反应组、空白组、酶抑制组、对照组，每个组别具体设置以及剂量件见表2，设置3个平行测定复孔，使用生化分析仪检测，取平均值。

表2试验分组及剂量

各组首先加入黄嘌呤氧化酶和磷酸盐缓冲液或乙醇提取物，孵化5min后，加入黄嘌呤启动反应。本试验同时设置别嘌呤醇阳性对照组。

式子中A1、A2、A3、A4分别对应酶反应组、空白组、酶抑制组、对照组在295nm中的吸光度。

3、试验结果

不同组合物对黄嘌呤氧化酶的抑制结果如下表3所示，其中实施例1～3为不同制备方法得到的组合物，对比例1～14为不同成分的组合物，别嘌呤醇组为阳性对照，是目前常用的黄嘌呤氧化酶抑制剂。

表3不同组合物对黄嘌呤氧化酶的抑制率

经测定表明实施例1～3及对比例1～14的组合物对黄嘌呤氧化酶的抑制能力存在显著差异。在实施例1～3中，醇溶剂的用量会影响组合物的抑制率，只有实施例1中采用10倍用量醇溶剂制备得到的组合物抑制效果最佳。在对比例1～4中，只含有一种组分的组合物在低浓度下(≦200μg/mL时)对黄嘌呤氧化酶几乎没有抑制效果，随着浓度的升高其抑制率提升幅度较小。而对比例5～10的两种提取物任意组合的组合物以及对比例11～14的三种提取物任意组合得到的组合物虽然对黄嘌呤氧化酶的抑制效果在逐步上升，但还是显著低于实施例1～3四种提取物组合之后的抑制效果。表明本发明将桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物复配得到的组合物具有较好的黄嘌呤氧化酶抑制作用，能够降尿酸，药效明显优于各组分单独使用或不同组分配合使用的简单叠加，具有显著的协同增效作用。

实施例6具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的组合物的优化

本实施例对组合物的质量比例进行优化，制备方法同实施例1，区别在于制备的桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物的质量比不同，具体设置见下表4所示，测定黄嘌呤氧化酶抑制的方法同实施例5。

表4不同提取物的质量比

我们同时测定了不同组分比例的组合物对黄嘌呤氧化酶抑制的作用，结果如表5所示，在各组合物用量相同的前提下，调节组合物中各提取物的质量比例，会改变对黄嘌呤氧化酶的抑制效果。在组合物中采用的桑叶提取物、车前草提取物、积雪草提取物和益智提取物的质量比例为2：2：2：1时，对黄嘌呤氧化酶抑制效果最好，最接近阳性对照别嘌呤醇组。

表5不同组分比例的组合物对黄嘌呤氧化酶抑制结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。