取代修饰的融合前RSV F蛋白及其用途

本申请是2017年3月29日提交的题为“取代修饰的融合前RSV F蛋白及其用途”的中国专利申请201780021719.5的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年3月29日提交的美国临时申请第62/314,946号的优先权，其通过引用整体并入本说明书中。

技术领域

本公开涉及多肽、多核苷酸、组合物及其用于引发和检测对呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫应答的方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒属(Pneumovirus)中的包膜的非节段负链RNA病毒。这是儿童在他们生命的第一年毛细支气管炎和肺炎的最常见原因。RSV还引起反复感染，包括严重的下呼吸道疾病，这可能发生在任何年龄，特别是老年人或心脏、肺部或免疫系统受损的人。被动免疫目前用于预防由RSV感染引起的严重疾病，特别是在早产、具有支气管肺发育不良或先天性心脏病的婴儿中。

RSV的包膜蛋白RSV F最初表达为单一多肽前体，命名为F

已经鉴定出在融合前构象中稳定的RSV F蛋白在动物模型中产生比用在融合后构象中的RSV F蛋白观察到的更强的中和免疫应答。例如，先前显示包含“DS-Cav1”取代(155C、290C、190F和207L)的重组RSV F胞外域在动物模型中引发中和免疫应答，其比针对基于融合后的RSV F免疫原所观察到的免疫应答大许多倍。尽管DS-Cav1免疫原对于引发对RSV的免疫应答是有效的，但是可以引发甚至更大免疫应答的新RSV免疫原是感兴趣的，特别是用于预防或减少由RSV和母体免疫方案引起的最严重疾病。

发明内容

本文公开了免疫原的实施方案，包括使用基于结构设计的迭代循环开发的重组RSV F蛋白，其惊人地将RSV保护性滴度提高至比先前基于RSV F的免疫原(例如“DS-Cav1”)提供的滴度高出约4倍。除了增强的免疫原性之外，本文公开的新型RSV F免疫原提供了优越的属性，例如不需要弗林蛋白酶切割和对热失活的抗原稳定性增加，其中几个实施方案比DS-Cav1在60℃时更稳定10倍以上。

在一些实施方案中，提供了重组RSV F胞外域三聚体，其包含三个重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体的重组F

在另外的实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体的重组F

在另外的实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体可以包括在蛋白质纳米颗粒(例如铁蛋白蛋白质纳米颗粒)上。还提供了编码所公开的重组RSV F胞外域三聚体的核酸分子，以及包括所述核酸分子的载体和产生所公开的RSV F胞外域的方法。

还提供了包括适合施用于对象的重组RSV F胞外域三聚体的免疫原性组合物，并且还可以包含在单位剂型中。所述组合物可进一步包括佐剂。重组RSV F胞外域也可以与运载体缀合以有助于呈递给免疫系统。

公开了在对象中诱导免疫应答的方法，以及通过向对象施用有效量的公开的重组RSV F胞外域三聚体、核酸分子或载体来治疗、抑制或预防对象中RSV感染的方法。在一些实施方案中，提供了用于抑制或预防婴儿中RSV感染的方法。在一些这样的实施方案中，所述方法可以包括向妊娠对象施用治疗有效量的如本文公开的重组RSV F胞外域三聚体以诱导针对RSV的免疫应答，其为生自妊娠对象的婴儿提供对RSV感染的被动免疫。

通过参考附图进行的若干实施方案的以下详细描述，本公开的前述和其它特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1A-1E显示了一组图解和表格，其说明了以融合前形式稳定的单链RSV F糖蛋白的设计和特性。(A)RSV F DS-Cav1结构以带状形式显示，其中F2结构域以深灰色着色并且F1结构域以浅灰色着色。显示了单个原聚体的切割位点的近视图，其中显示了融合肽。(B)通过用来自残基97至151或来自残基105至145的可变长度接头替换弗林蛋白酶切割位点(R109/E110和R136/F137)和融合肽来设计单链RSV F(sc)构建体。DS-Cav1突变(DS：残基155和290之间的二硫键；Cav1：残基190处的Ser至Phe突变和残基207处的Val至Leu)被并入所有设计中，其它突变被标记并由垂直黑线指示。(C)在融合前状态下稳定的单链RSV F糖蛋白变体的抗原特征。基于尺寸排阻色谱法指示观察到的变体的寡聚状态。显示了1L Expi细胞的蛋白质产量，并显示了六种抗体对抗原位点

图2A-2D显示了一组图解和图形，其说明了单链RSV F糖蛋白的设计循环1的结构、免疫原性和信息学。(A)RSV F sc9 DS-Cav1结构以带状形式显示。(B)F2和F1之间的亚基间接头的细节(以1s显示的电子密度(2F

图3A-3D显示了一组图解和表格，其说明了具有改变的F2-F1接头的单链RSV F的设计和特性。(A)改变的F2-F1接头的循环2设计。显示的序列包括MQSTPATNNGSG(SEQ IDNO：87的残基1-12)和NSALSATGSG(SEQ ID NO：88)、TGG和TGSG(SEQ ID NO：89)。(B)具有改变的接头的单链RSV F糖蛋白变体的代表性动态光散射谱和凝胶过滤色谱图。sc9-10 DS-Cav1表现出与DS-Cav1相似的洗脱谱特征。(C)在融合前状态下稳定的单链RSV F糖蛋白变体的抗原特征和物理特征。显示了sc变体的氨基酸序列。基于尺寸排阻色谱法指示观察到的变体的寡聚状态。给出来自1L Expi细胞的蛋白质产量，并显示六种抗体的抗体亲和力。显示的序列包括MQSTPATNNGSG(SEQ ID NO：87的残基1-12)、MQSTPATG(SEQ ID NO：90)、MQSTPATGSG(SEQ ID NO：91)、MQSTPATGGSGGSGG(SEQ ID NO：92)、NSALSATGSG(SEQ ID NO：88)、MQSTGG(SEQ ID NO：93)、AQSTGG(SEQ ID NO：94)和MQSTPATNQGSG(SEQ ID NO：95)。(D)通过暴露于各种物理极端后的D25反应性评估的sc变体的物理稳定性。

图4A-4D显示了一组图解和图形，其说明了具有优化的F2-F1接头的单链RSV F糖蛋白的设计循环2的结构、免疫原性和信息学。(A)具有优化的F2-F1接头的单链RSV F糖蛋白的结构。(B)显示了F2-F1接头的结构细节，其中显示了接头区域。显示的序列包括PATGSG(SEQ ID NO：91的残基5-10)、PATGGSGGSGG(SEQ ID NO：92的残基5-15)和NSALSATGSG(SEQID NO：88)。(C)来自用10μg具有优化接头的RSV F DS-Cav1单链变体免疫的小鼠的血清的中和滴度。来自每只小鼠的滴度显示为单独的点，并且几何平均值由水平线表示。以10μg每只小鼠施用的融合后F以及RSV F DS-Cav1(以灰点显示)作为对照()。(D左：设计循环1和2变体(包括DS-Cav1)的每种物理特性与中和滴度的斯皮尔曼相关性。调整后的P值(邦弗朗尼校正(Bonferroni correction))小于0.05的相关性用“*”标记。右：四级抗体抗原性与中和滴度的相关性。“10,000”用于具有“N.B”值的抗原性。

图5A-5D说明了具有原聚体间二硫键的单链RSV F糖蛋白的设计和特性。(A)RSVsc9-10 DS-Cav1三聚体的晶体结构以动画表示示出。插图显示了循环3设计的近视图，其中残基突变为Cys以形成原聚体间二硫键；突变被标记并以棒状表示显示。(B)通过阴性染色EM和SDS-PAGE表征具有原聚体间二硫键的工程化单链RSV F糖蛋白。(C)具有原聚体间二硫键的单链RSV F糖蛋白变体的抗原特征和物理特征。基于尺寸排阻色谱法指示观察到的变体的寡聚状态。给出来自1L Expi细胞的蛋白质产量，并显示五种抗体的抗体亲和力。显示了通过暴露于各种物理极端后的D25反应性评估的sc变体的物理稳定性。(D)在60℃针对融合前特异性抗体AM14、D25和MPE8评估的融合前RSV F糖蛋白免疫原的抗原稳定性(图9中显示的衰减曲线)。

图6A-6C说明了具有原聚体间二硫键的单链RSV F糖蛋白的设计循环3的结构、免疫原性和信息学。(A)具有原聚体间二硫键的单链RSV F糖蛋白sc9-10的结构，在近视图中以该区域的电子密度显示。(B)来自用10μg RSV F DS-Cav1单链变体免疫的小鼠的血清的中和滴度。来自每只小鼠的滴度显示为单独的紫点，并且几何平均值由水平线表示。来自用sc9-10和RSV F DS-Cav1免疫的小鼠的血清滴度(以灰点显示)是对照。(C)左：设计循环1、2和3变体(包括DS-Cav1)的每种物理特性与中和滴度的斯皮尔曼相关性。调整后的P值(邦弗朗尼校正)小于0.05的相关性用“*”标记。右：四级抗体抗原性和物理稳定性与中和滴度的相关性。含有残基183处突变的构建体不包括在四级抗体抗原性的相关性中，因为N183是AM14表位的一部分。“10,000”用于具有“N.B”值的抗原性。

图7A-7D显示了关于原聚体间二硫键与其它突变的组合的结果。(A)涉及原聚体间二硫键与其它变体组合的循环4设计。(B)测试的毒株的系统发生树。(C)RSV F单链变体分子的抗原性和物理稳定性。(D)在60℃针对融合前特异性抗体AM14、D25和MPE8评估的融合前RSV F糖蛋白免疫原的抗原稳定性(图9中显示的衰减曲线)。

图8A-8C说明了包括原聚体间二硫键与其它突变的组合的设计循环4的结构、免疫原性和信息学。(A)单链RSV F糖蛋白sc9-10 DS-Cav1 A149C，Y458CS46G-E92D-S215P-K465Q的结构，在插图中显示了表面突变的细节。(B)来自用10μg RSV F DS-Cav1单链变体免疫的小鼠的血清的中和滴度。来自每只小鼠的滴度显示为单独的点，并且几何平均值由水平线表示。来自用基于sc9-10 DS-Cav1 A149C，Y458C的设计免疫的小鼠的滴度以不同形式的圆圈显示，基于Sc-9-10 DS Cav1 N183GC，N428C的设计以正方形显示，并且基于Sc-9-10 DS Cav1 Q98C，Q361C的设计使用变化的三角形显示。显示RSV F DS-Cav1(以灰点显示)以供参考。(C)左：设计循环1、2、3和4蛋白质(包括DS-Cav1)的每种物理特性与中和滴度的斯皮尔曼相关性。调整后的P值(邦弗朗尼校正)小于0.05的相关性用“*”标记。右：四级抗体抗原性和物理稳定性与中和滴度的相关性。含有残基183处突变的构建体不包括在四级抗体抗原性的相关性中，因为N183是AM14表位的一部分。“10,000”用于具有“N.B”值的抗原性。

图9A-9D是显示融合前RSV F糖蛋白免疫原稳定性的一组图解和表格。使用融合前特异性抗体AM14、D25和MPE8，通过Octet BLI评估(A)设计循环3和(B)设计循环4的RSV F糖蛋白免疫原在60℃的衰减曲线。(C)高盐缓冲剂中的RSV F免疫原物理稳定性。(D)在存在甘油的10次冻融循环后评估RSV F变体D25反应性。

图10A-10B是显示免疫小鼠对D25和AM14表位的血清反应性的一组图。评估来自用RSV F的单链变体免疫的小鼠的血清用于与固定化DS-CAV1或通过融合前特异性抗体D25或AM14结合的固定化DS-CAV1的结合，以评估位点特异性应答。(A)RSV FDS-Cav1加载的传感器尖端分别用D25和AM14阻断。通过BLI测量应答。(B)通过从整体DS-Cav1应答减去D25或AM14结合的DS-Cav1应答计算D25和AM14表位特异性应答。

图11是显示晶体学数据收集和精修统计的表格。括号中的值是关于最高分辨率壳层(shell)。

图12是说明RSV F序列和二级结构的示意图。N-连接糖基化的位点用黑色三角形突出显示，标记抗原位点，并且向下箭头指示弗林蛋白酶切割位点的位置。二级结构显示在序列下方，其中圆柱体代表α-螺旋，箭头代表β-链。无序或缺少的残基用“X”表示；在融合前和融合后构象之间移动超过

图13显示了两种PAGE凝胶，其说明了所示重组RSV F胞外域构建体的纯化产率。所有构建体都具有C端折叠子(foldon)三聚化结构域。构建体2-3的RSV F胞外域的C端残基是位置513。对构建体4-7的“长”的提及表明构建体中包含的RSV F胞外域的C端残基是位置532。

图14是提供结合至融合前特异性抗体D25、AM14和MPE8以及莫他珠单抗(Motavizumab)抗体的RSV F的一系列单链变体()的ELISA抗原数据的表格。

图15A和15B是显示由工程化bRSV F融合前-F(pre-F)三聚体在小鼠中引发的血清中和抗体滴度的一组表格。(图15A)融合前-F稳定的bRSV F糖蛋白在小鼠中引发的几何平均EC50中和滴度比融合后-F(post-F)高43-344倍之间。显示了免疫方案。每组有10只小鼠用于小鼠免疫。来自每只动物的中和滴度显示为单个点，并且几何平均值用黑色水平线表示。Lod，检测限(滴度＝100)用水平虚线表示。垂直点线分开免疫原病毒株。P值通过双尾曼-惠特尼检验(two-tailed Mann-Whitney test)确定。*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001并且****表示P≤0.0001。(图15B)来自用bRSV F变体免疫的小鼠的第五周血清的ELISA结合滴度。来自每只动物的滴度由颜色编码的符号表示。实心符号表示固定化DS2-v1 RSV F三聚体的血清识别，空心符号表示固定化391-2融合后-F RSV F三聚体的识别。垂直点线分开免疫原病毒株。几何平均滴度由黑色水平线表示。

序列

所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示，如37C.F.R.1.822中所定义。仅显示了每条核酸序列的一条链，但互补链被理解为包括在对所呈现的链的任何引用中。序列表以名称为“Sequence.txt”(～424kb)的文件的形式以ASCII文本文件提交，所述文件于2017年3月23日创建，其通过引用并入本说明书。在所附序列表中：

SEQ ID NO：1-56是与本文公开的T4 Fibritin三聚化结构域连接的重组F

SEQ ID NO：57-64是示例性天然RSV F蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65是肽接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO：66是示例性T4 Fibritin三聚化结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：67-72是示例性半胱氨酸拉链三聚化结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：73-74是示例性跨膜结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：76-78是示例性蛋白质纳米颗粒亚基的氨基酸序列。

SEQ ID NO：79-80是示例性信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：81-84是编码与本文公开的T4 Fibritin三聚化结构域连接的重组F

SEQ ID NO：85-95是单链RSV F蛋白序列。

SEQ ID NO：96-99是编码与本文公开的T4 Fibritin三聚化结构域连接的重组F

SEQ ID NO：10-113是与本文公开的T4 Fibritin三聚化结构域连接的重组F

SEQ ID NO：114-116是示例性天然RSV F蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：117-162是肽接头的氨基酸序列。

SEQ ID NO：163是信号肽的氨基酸序列。

具体实施方式

在融合前构象中稳定的RSV F蛋白在动物模型中产生比在融合后构象中稳定的RSV F蛋白观察到的更大的中和免疫应答(参见McLellan等人，Science，342：592-598，2013)。因此，融合前稳定的RSV F蛋白是包含在RSV疫苗中的主要候选物。在融合前构象中稳定的可溶性RSV F胞外域先前已通过引入修饰(例如引入二硫键)产生，所述修饰在包括抗原位点

来自RSV的严重疾病最常发生在婴儿肺部仍在发育的生命的前六个月期间。母体抗体-在妊娠的最后几周内转移-提供保护性免疫，但这种保护每月减弱约2倍，并且在出生时应该是保护阈值的约2

本文公开了使用基于结构的设计的迭代循环开发的基于RSV F的免疫原的实施方案，以将RSV保护性滴度提高至比现有的基于RSV F的免疫原(包括DS-Cav1)提供的滴度再高出约4倍。本文提供的新型RSV F免疫原包括缺失融合肽的遗传连接的F

I.术语汇总

除非另外指出，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin，GenesX，Jones&Bartlett Publishers出版，2009；和Meyers等人(编)，The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine，Wiley-VCH出版，共16卷，2008和其他类似的参考文献中。如本文所用，除非上下文另有说明，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”是指单数形式以及复数形式。例如，术语“抗原”包括单个或多个抗原，并且可以认为等价于短语“至少一个抗原”。如本文所用，术语“包含”意指“包括”。因此，“包含抗原”意指“包括抗原”而不排除其它要素。还应理解，除非另有说明，否则针对核酸或多肽给出的任何和所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且是出于描述目的提供。尽管可以使用与本文描述的那些类似或等价的许多方法和材料，但是下面描述了特别合适的方法和材料。如果冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的并不打算是限制性的。为了便于审查各种实施方案，提供了以下术语解释：

5C4：特异性结合RSV F蛋白的融合前构象上存在的抗原位点

佐剂：用于增强抗原性的媒介物。佐剂包括吸附抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；或油包水乳液，例如其中抗原溶液在矿物油(弗氏不完全佐剂)中乳化，有时包含杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原降解和/或引起巨噬细胞的流入)。免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可用作佐剂。佐剂包括生物分子(“生物佐剂”)，例如共刺激分子。示例性佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL、免疫刺激复合物(ISCOM)基质和Toll样受体(TLR)激动剂，例如TLR-9激动剂、Poly I：C或PolyICLC。本领域普通技术人员熟悉佐剂(参见例如Singh(编)Vaccine Adjuvants and Delivery Systems.Wiley-Interscience，2007)。佐剂可以与公开的重组体组合使用。

施用：通过选择的途径将组合物引入对象。施用可以是局部或全身的。例如，如果所选择的途径是鼻内，那么通过将组合物引入对象的鼻道来施用组合物(例如包括公开的重组RSV F胞外域的组合物)。示例性施用途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内和静脉内)、舌下、直肠、透皮(例如局部)、鼻内、阴道和吸入途径。

AM22：特异性结合RSV F蛋白的融合前构象上存在的抗原位点

氨基酸取代：多肽中的氨基酸用一种或多种不同的氨基酸替代。在一些实例中，多肽中的氨基酸被来自同源多肽的氨基酸取代，例如，A组重组RSV F多肽中的氨基酸可以被来自B组RSV F多肽的相应氨基酸取代。在RSV F蛋白中提及“155C”取代是指包含已取代位置155处的相应天然残基的位置155处的半胱氨酸残基的RSV F蛋白。在RSV F蛋白中提及“S155C”取代是指包含已取代参考(例如天然)序列中的丝氨酸残基的位置155处的半胱氨酸残基的RSV F蛋白。

抗体：特异性结合并识别分析物(抗原)例如RSV F蛋白、其抗原性片段、或抗原的二聚体或多聚体的免疫球蛋白、其抗原结合片段或衍生物。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需抗原结合活性即可。抗体的非限制性实例包括例如完整的免疫球蛋白及其在本领域中已知的保留对抗原的结合亲和力的变体和片段。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)

空腔填充氨基酸取代：填充蛋白质()的蛋白质核内的空腔(例如RSV F胞外域)的氨基酸取代。空腔基本上是折叠蛋白质中的空隙，其中不存在氨基酸或氨基酸侧链。在若干实施方案中，引入空腔填充氨基酸取代以填充RSV F胞外域核心的融合前构象中所存在的空腔，其在转变至融合后构象后塌缩(例如具有减小的体积)。

保守变体：“保守”氨基酸取代是那些基本上不影响或降低蛋白质功能(例如当施用于对象时蛋白质诱导免疫应答的能力)的取代。术语保守变异还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸。此外，普通技术人员将认识到编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸(例如小于5％，在一些实施方案中小于1％)的个别取代、缺失或添加是保守变异，其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。

提供功能相似的氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员所熟知的。以下六组是彼此视为保守取代的氨基酸的实例：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

非保守取代是降低重组RSV F胞外域三聚体的活性或功能(例如当施用于对象时诱导免疫应答的能力)的取代。例如，如果氨基酸残基对于蛋白质的功能是必需的，那么即使是其它保守取代也可能破坏该活性。因此，保守取代不会改变感兴趣的蛋白质的基本功能。

对照：参考标准。在一些实施方案中，对照是从健康患者获得的阴性对照样品。在其它实施方案中，对照是从诊断患有RSV感染的患者获得的阳性对照样品。在其它实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值范围(例如先前测试的对照样品，例如具有已知预后或结果的一组RSV患者，或代表基线或正常值的样品组)。

测试样品和对照之间的差异可以是增加或相反地减少。差异可以是定性差异或定量差异，例如统计学上显著的差异。在一些实例中，差异是相对于对照增加或减少至少约5％，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％或大于500％。

半胱氨酸拉链结构域：包括在卷曲螺旋结构域的螺旋上的二半胱氨酸基序环中的半胱氨酸残基之间具有螺旋间二硫键的三聚体卷曲螺旋结构域。半胱氨酸拉链结构域在结构上类似于亮氨酸拉链结构域，并且包括具有半胱氨酸残基的卷曲螺旋结构域代替亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域的相应亮氨酸残基。与亮氨酸拉链类似，二半胱氨酸基序包括在七价(heptad)位置a和g处。

D25：特异性结合RSV F蛋白的融合前构象上存在的抗原位点

简并变体：在本公开的上下文中，“简并变体”是指包括由于遗传密码而简并的序列的编码多肽的多核苷酸。存在20种天然氨基酸，其中大多数是由不止一个密码子指定的。因此，只要核苷酸序列编码的肽的氨基酸序列不变，就包括编码肽的所有简并核苷酸序列。

表位：抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，使得它们引发特异性免疫应答，例如，表位是B和/或T细胞应答的抗原区域。抗体可以结合特定的抗原表位，例如RSV F蛋白的抗原位点

表达：核酸序列的转录或翻译。例如，基因在其DNA转录成RNA或RNA片段时表达，在一些实例中将其加工成mRNA。基因也可以在其mRNA被翻译成氨基酸序列(例如蛋白质或蛋白质片段)时表达。在一个特定实例中，异源基因在其转录成RNA时表达。在另一个实例中，异源基因在其RNA被翻译成氨基酸序列时表达。术语“表达”在本文中用于表示转录或翻译。表达的调节可以包括对转录、翻译、RNA转运和加工的控制，中间分子例如mRNA的降解，或通过特定蛋白质分子产生后的活化、失活、区室化或降解。

表达控制序列：调节与其可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和(适当的)翻译时，表达控制序列可操作地连接于核酸序列。因此，表达控制序列可以包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号(维持基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译)和终止密码子。术语“控制序列”旨在至少包括其存在可影响表达的组分，并且还可以包括其存在是有利的额外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。表达控制序列可以包括启动子。

启动子是足以指导转录的最小序列。还包括那些足以使启动子依赖性基因表达关于细胞类型特异性、组织特异性可控制或可由外部信号或试剂诱导的启动子元件；这类元件可以位于基因的5′或3′区。包括组成型和诱导型启动子(参见例如Bitter等人，Methodsin Enzymology 153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供核酸序列的转录。

表达载体：包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其它元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

糖基化位点：多肽(例如蛋白质)表面上的氨基酸序列，其适应聚糖的附着。N-连接的糖基化位点是NX(S/T)的三联体序列，其中N是天冬酰胺，X是除脯氨酸外的任何残基，(S/T)是丝氨酸或苏氨酸残基。聚糖是多糖或寡糖。聚糖也可用于指糖缀合物(例如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖)的碳水化合物部分。

异源：源自不同的遗传来源。与细胞异源的核酸分子源自除表达所述核酸分子的细胞以外的遗传来源。在一个具体的非限制性实例中，编码重组RSV F多肽的异源核酸分子在细胞例如哺乳动物细胞中表达。用于在细胞或生物体中引入异源核酸分子的方法是本领域熟知的，例如用核酸转化，包括电穿孔、脂质转染、颗粒枪加速和同源重组。

宿主细胞：载体可以在细胞中增殖并表达载体核酸的细胞。细胞可以是原核或真核的。所述术语还包括对象宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能与亲本细胞不同，因为在复制过程中可能发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括这类后代。

免疫应答：免疫系统细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的应答。在一个实施方案中，所述应答对特定抗原具有特异性(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4+应答或CD8+应答。在另一个实施方案中，应答是B细胞应答，并导致产生特异性抗体。

免疫原：可以在动物中引发免疫应答的化合物、组合物或物质(例如重组RSV F胞外域三聚体)，包括注射或吸收到动物体内的组合物。向对象施用免疫原可导致针对感兴趣的病原体的保护性免疫。

免疫原性组合物：包含公开的重组RSV F胞外域三聚体的组合物，其在施用于对象时诱导针对RSV的可测量的CTL应答，或诱导针对RSV的可测量的B细胞应答(例如抗体的产生)。它进一步指分离的核酸分子和编码所公开的重组RSV F胞外域三聚体的原聚体的载体，其可用于表达原聚体(并因此用于引发针对重组RSV F胞外域三聚体的免疫应答)。对于体内使用，免疫原性组合物通常在药学上可接受的运载体中包括重组RSV F胞外域三聚体或编码重组RSV F胞外域三聚体的原聚体的核酸分子，并且还可以包括其它试剂，例如佐剂。

分离：“分离”的生物组分已基本上与其它生物组分分离或纯化，例如组分天然存在的其它生物组分，例如其它染色体和染色体外DNA、RNA和蛋白质。已经“分离”的蛋白质、肽、核酸和病毒包括通过标准纯化方法纯化的那些。分离不需要绝对纯度，并且可以包括至少50％分离，例如至少75％、80％、90％、95％、98％、99％、甚至99.9％分离的蛋白质、肽、核酸或病毒分子。

接头和连接：可用于将两个分子连接成一个连续分子的双功能分子。肽接头的非限制性实例包括甘氨酸-丝氨酸肽接头。除非上下文另有说明，否则提及“连接”第一多肽和第二多肽，或将两个多肽“连接”在一起，或与第二多肽具有“连接”的第一多肽，是指通过肽键(例如通过肽接头)的共价连接()使得第一和第二多肽形成连续的多肽链。如果涉及肽接头，那么第一和第二多肽的共价连接可以是连接至肽接头的N端和C端。通常，使用分子生物学技术完成这种连接，以通过肽接头遗传操作编码与第二多肽连接的第一多肽的DNA。

天然蛋白质、序列或二硫键：并未例如通过选择性突变修饰的多肽、序列或二硫键。例如，选择性突变将抗原的抗原性集中于靶表位，或将二硫键引入天然蛋白质中不存在的蛋白质中。天然蛋白质或天然序列也称为野生型蛋白质或野生型序列。非天然二硫键是天然蛋白质中不存在的二硫键，例如，由于通过基因工程将一个或多个半胱氨酸残基引入蛋白质而在蛋白质中形成的二硫键。

核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义链和反义链以及上述的合成形式和混合聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。如本文所用的术语“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另有说明，否则核酸分子的长度通常为至少10个碱基。所述术语包括单链和双链形式的DNA。多核苷酸可包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的一种或两种。“cDNA”是指与mRNA互补或相同的单链或双链形式的DNA。“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，其充当在生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，其具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。

可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子与编码序列可操作地连接。一般，可操作地连接的核酸序列是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区接合在相同的阅读框中。

融合前特异性抗体：在融合前构象中特异性结合RSV F蛋白，但在融合后构象中不与RSV F蛋白特异性结合的抗体。示例性的融合前特异性抗体包括D25、AM22和5C4抗体。

药学上可接受的运载体：使用的药学上可接受的运载体是常规的。Remington′sPharmaceutical Sciences，E.W.Martin著，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版，1995描述了适用于所公开的免疫原的药物递送的组合物和制剂。

一般，运载体的性质取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体运载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的运载体外，待施用的药物组合物(例如免疫原性组合物)可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在特定实施方案中，适合施用于对象的运载体可以是无菌的，和/或悬浮的或以其它方式包含在含有一种或多种适于诱导所需免疫应答的测量剂量的组合物的单位剂型中。它也可能伴有药物用于治疗目的。单位剂型可例如在含有无菌内含物的密封小瓶或用于注射到对象体内的注射器中，或冻干用于随后的溶解和施用，或在固体或控释剂量中。

多肽：不论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)的任何氨基酸链。“多肽”适用于氨基酸聚合物，包括天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然氨基酸，例如，相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物。多肽具有氨基端(N端)末端和羧基端(C端)末端。“多肽”可与肽或蛋白质互换使用，并且在本文中用于指氨基酸残基的聚合物。

多肽修饰：多肽和肽(例如本文公开的重组RSV F蛋白)可以通过多种化学技术进行修饰，以产生具有与未修饰的肽基本相同的活性的衍生物，并任选地具有其它所需的特性。例如，蛋白质的羧酸基团，无论羧基端还是侧链，可以药学上可接受的阳离子的盐形式提供或酯化形成C

可以使用公认的技术将肽侧链的羟基转化为C

初免-加强疫苗接种：包括向对象施用第一免疫原性组合物(初免疫苗)，然后施用第二免疫原性组合物(加强疫苗)以诱导免疫应答的免疫疗法。初免疫苗和/或加强疫苗包括表达免疫应答所针对的抗原的载体(例如病毒载体、RNA或DNA载体)。在初免疫苗后向对象施用加强疫苗；本领域技术人员将理解初免疫苗和加强疫苗的施用之间的合适时间间隔，并且本文公开了此类时间范围的实例。在一些实施方案中，初免疫苗、加强疫苗或初免疫苗和加强疫苗两者额外得包括佐剂。在一个非限制性实例中，初免疫苗是基于DNA的疫苗(或基于基因递送的其它疫苗)，并且加强疫苗是基于蛋白质亚基或蛋白质纳米颗粒的疫苗。

蛋白质纳米颗粒：一种多亚基、基于蛋白质的多面体形状结构。亚基各自由蛋白质或多肽(例如糖基化多肽)组成，并且任选地具有以下个或多个特征：核酸、辅基、有机和无机化合物。蛋白质纳米颗粒的非限制性实例包括铁蛋白纳米颗粒(参见例如Zhang，Y.Int.J.Mol.Sci.，12：5406-5421，2011，以引证的方式纳入本文中)、包封蛋白(encapsulin)纳米颗粒(参见例如Sutter等人，Nature Struct.and Mol.Biol.，15：939-947，2008，以引证的方式纳入本文中)、硫加氧酶还原酶(SOR)纳米颗粒(参见例如Urich等人，Science，311：996-1000，2006，以引证的方式纳入本文中)、二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶纳米颗粒(参见例如Zhang等人，J.Mol.Biol.，306：1099-1114，2001)或丙酮酸脱氢酶纳米颗粒(参见例如Izard等人，PNAS 96：1240-1245，1999，以引证的方式纳入本文中)。铁蛋白、包封蛋白、SOR、二氧四氢蝶啶合酶和丙酮酸脱氢酶是单体蛋白质，其自组装成球状蛋白质复合物，在一些情况下分别由24、60、24、60和60个蛋白质亚基组成。在一些实例中，铁蛋白、包封蛋白、SOR、二氧四氢蝶啶合酶或丙酮酸脱氢酶单体与重组RSV F胞外域连接并自组装成在其表面上呈递重组RSV F胞外域的蛋白质纳米颗粒，其可以施用于对象以刺激对抗原的免疫应答。

重组：重组核酸分子是具有非天然存在的序列的分子，例如包括一个或多个核酸取代、缺失或插入，和/或具有通过两个以其它方式分离的序列区段的人工组合制备的序列。这种人工组合可以通过化学合成或更常见地通过人工操作分离的核酸区段(例如通过基因工程技术)来完成。

重组病毒是包括含有重组核酸分子的基因组的病毒。

重组蛋白是具有非天然存在的序列或具有通过两个以其它方式分离的序列区段的人工组合制备的序列的蛋白质。在若干实施方案中，重组蛋白由异源(例如重组)核酸编码，所述核酸已引入宿主细胞(例如细菌或真核细胞)，或引入重组病毒的基因组。

呼吸道合胞病毒(RSV)：副粘病毒科的包膜非节段负义单链RNA病毒。RSV基因组长度为约15,000个核苷酸，包括10个编码11种蛋白质(包括糖蛋白SH、G和F)的基因。F蛋白介导融合，允许病毒进入细胞细胞质并促进合胞体的形成。已经描述了人RSV病毒株的两个抗原亚组，A和B亚组，主要基于G糖蛋白的抗原性差异。其它物种的RSV病毒株也是已知的，包括牛RSV。示例性RSV病毒株序列是本领域普通技术人员已知的。此外，可获得数种人RSV感染模型，包括感染hRSV的模式生物，以及感染物种特异性RSV的模式生物，例如在牛中使用bRSV感染(参见例如Bern等人，Am J，Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.，301：L148-L156，2011；Nam和Kun(编).Respiratory Syncytial Virus：Prevention，Diagnosis andTreatment.Nova Biomedical Nova Science Publisher，2011；和Cane(编)RespiratorySyncytial Virus.Elsevier Science，2007.)。

RSV融合(F)蛋白：促进病毒膜和细胞膜融合的RSV包膜糖蛋白。在自然界中，RSV F蛋白最初合成为长度为约574个氨基酸的单个多肽前体，命名为F

RSV F蛋白在RSV亚型中表现出显著的序列保守性。例如，在F

三个F

在融合前构象中，RSV F蛋白在其膜远端顶端包含称为“抗原位点

融合前构象中的重组RSV F蛋白可以与结合RSV F蛋白的融合前构象而非融合后构象的抗体特异性结合，例如特异性结合抗原位点

“在融合前构象中稳定的”RSV F胞外域三聚体与天然RSV F序列相比，包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，从而与由相应天然RSV F序列形成的RSV F胞外域三聚体相比增加融合前构象的保留。融合前构象通过一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的“稳定化”可以是例如能量稳定化(例如相对于融合后开放构象，降低融合前构象的能量)和/或动力学稳定化(例如降低从融合前构象向融合后构象的转变速率)。另外，与相应的天然RSV F序列相比，融合前构象中RSV F胞外域三聚体的稳定化可以包括对变性的抗性的增加。本文提供了确定RSV F胞外域三聚体是否处于融合前构象的方法，包括(但不限于)阴性染色电子显微术和使用融合前构象特异性抗体，例如5C4、D25或AM22抗体的抗体结合测定。

序列相同性/相似性：氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，或者称为序列相同性。序列相同性通常根据百分比相同性(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法比对时，多肽的同源物、直向同源物或变体将具有相对高程度的序列相同性。

用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。各种程序和比对算法描述于：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73：237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-3，1989；Corpet等人，Nuc.AcidsRes.16：10881-90，1988；Huang等人Computer Appls.in the Biosciences 8，155-65，1992；和Pearson等人，Meth.Mol.Bio.24：307-31，1994。Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-10，1990，呈现了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

一旦比对，通过计数两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定匹配数。通过将匹配数除以所鉴定序列中所示序列的长度或明确的(articulated)长度(例如来自所鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将结果值乘以100来确定序列相同性百分比。例如，当与具有1554个氨基酸的测试序列比对时具有1166个匹配的肽序列与测试序列()具有75.0％的相同性(1166÷1554*100＝75.0)。序列相同性百分比值四舍五入到最接近的十分位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下舍入到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上舍入到75.2。长度值始终为整数。

NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403，1990)可从若干来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互联网，以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。有关如何使用该程序确定序列相同性的说明可在互联网上的NCBI网站获得。

多肽的同源物和变体(例如RSV F胞外域)的特征通常在于在与感兴趣的氨基酸序列的全长比对中经计数具有至少约75％，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质在通过该方法评估时将显示出增加的相同性百分比，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列相同性。当比较少于整个序列的序列相同性时，同源物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少80％的序列相同性，并且可具有至少85％或至少90％或95％的序列相同性，取决于它们与参考序列的相似性。在这类短窗口内确定序列相同性的方法可以在互联网上的NCBI网站获得。本领域技术人员将理解，提供这些序列相同性范围仅用于指导；完全有可能获得超出所提供范围的非常显著的同源物。

对于核酸序列的序列对比，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。使用默认程序参数。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443，1970的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988的检索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或通过手动比对和目视检查(参见例如Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第4版，Cold SpringHarbor，New York，2012)和Ausubel等人(In Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，至增刊104，2013)来进行。有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360，1987的渐进比对方法的简化。使用的方法类似于Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153，1989描述的方法。使用PILEUP，将参考序列与其它测试序列进行比较，使用以下参数以确定序列相同性百分比关系：默认缺口权重(3.00)、默认缺口长度权重(0.10)和加权末端缺口。PILEUP可以从GCG序列分析软件包获得，例如7.0版(Devereaux等人，Nuc.Acids Res.12：387-395，1984。

适用于确定序列相同性百分比和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1990和Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1977中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(ncbi.nlm.nih.gov)公开获得。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11，比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较作为默认。BLASTP程序(用于氨基酸序列)使用字长(W)为3，期望(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵作为默认(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915，1989)。寡核苷酸是长度至多约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。

如本文所用，提及“至少90％的相同性”是指与指定的参考序列具有“至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或甚至100％的相同性”。

信号肽：将新合成的分泌蛋白或膜蛋白引导至膜并通过膜(例如内质网膜)的短氨基酸序列(例如长度约18-25个氨基酸)。信号肽通常位于多肽的N端，并在多肽穿过膜后被信号肽酶去除。信号肽序列通常含有三个共同的结构特征：N端极性碱性区(n区)、疏水核和亲水c区)。示例性信号肽序列如SEQ ID NO：57-64(来自A、B和牛RSV的RSV F蛋白信号肽)的残基1-25所示。

单链RSV F胞外域：在单个连续多肽链中包含RSV F

特异性结合：当提及抗体：抗原蛋白复合物或蛋白质：蛋白质复合物的形成时，是指在蛋白质的异质群体和其它生物制剂存在下确定靶蛋白、肽或多糖(例如糖蛋白)的存在的结合反应。因此，在指定条件下，特定抗体或蛋白质优先结合特定靶蛋白、肽或多糖(例如存在于病原体表面上的抗原，例如RSV F胞外域三聚体上的抗原位点0)并且不与样品或对象中存在的其它蛋白质或多糖大量结合。特异性结合可以通过本领域已知的方法确定。当相互作用的K

可溶性蛋白质：能够在室温溶解于水性液体中并保持溶解的蛋白质。蛋白质的溶解度可以根据水基液体中蛋白质的浓度、液体的缓冲条件、液体中其它溶质的浓度(例如盐和蛋白质浓度)、以及液体的热量而变化。在若干实施方案中，可溶性蛋白质是在室温在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中溶解达到至少0.5mg/ml浓度并保持溶解至少48小时的蛋白质。

对象：活的多细胞脊椎动物生物，是包括人类和非人类哺乳动物的类别。在一个实例中，对象是人类。在一个特定实例中，对象是新生婴儿。在另一个实例中，选择需要抑制RSV感染的对象。例如，对象未感染且有RSV感染的风险或被感染需要治疗。

T4 Fibritin三聚化结构域：也称为“折叠子”结构域，T4 Fibritin三聚化结构域包含天然形成三聚体结构的氨基酸序列。在一些实例中，T4 Fibritin三聚化结构域可以包括在公开的重组蛋白的氨基酸序列中，使得抗原将形成三聚体。在一个实例中，T4Fibritin三聚化结构域包含如(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF(SEQ ID NO：66)所示的氨基酸序列。若干实施方案包括可以从纯化的蛋白质切割的T4 Fibritin三聚化结构域，例如通过掺入可以用于切割目的的T4 Fibritin三聚化结构域附近的凝血酶切割位点。

治疗有效量：足以预防、治疗(包括防治)、减少和/或改善病症或疾病的症状和/或潜在病因，例如预防、抑制和/或治疗RSV感染的试剂(例如公开的重组RSV F胞外域)的量。在一些实施方案中，治疗有效量足以减少或消除疾病的症状，例如RSV感染。例如，这可以是抑制或预防病毒复制或可测量地改变病毒感染的外部症状所必需的量。

在一个实例中，期望的应答是抑制或减少或预防RSV感染。为了使方法有效，不需要完全消除或减少或预防RSV感染。例如，与合适的对照相比，施用治疗有效量的试剂可使RSV感染(例如，通过细胞感染或通过RSV感染的对象的数量或百分比测量)减少所需的量，例如减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，或甚至至少100％(消除或预防可检测的RSV感染)。

应理解，为了获得针对病原体的保护性免疫应答，可能需要多次施用免疫原性组合物。因此，治疗有效量涵盖与先前或后续施用组合有助于获得保护性免疫应答的分剂量。例如，治疗有效量的试剂可以在治疗过程中(例如初免-加强免疫接种治疗)以单次剂量或数次剂量施用，例如每天施用。然而，治疗有效量可取决于所治疗的对象、所治疗病况的严重程度和类型，以及施用方式。试剂的单位剂型可以治疗量或治疗量的倍数包装，例如在小瓶(例如，具有可刺穿的盖子)或具有无菌组件的注射器中。

跨膜结构域：插入脂质双层(例如细胞或病毒或病毒样颗粒的脂质双层)的氨基酸序列。跨膜结构域可用于将抗原锚定到膜上。在一些实例中，跨膜结构域是RSV F跨膜结构域。

治疗或预防疾病：例如，在处于例如RSV感染的疾病风险中的对象中，抑制疾病或病况的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其病征或症状的治疗性干预。关于疾病或病理状况，术语“改善”是指治疗的任何可观察的有益效果。例如，可以通过在易感对象中延迟疾病的临床症状的发作、降低疾病的一些或所有临床症状的严重性、减慢疾病的进展、减少病毒载量、提高对象整体健康或福祉、或通过本领域熟知的对特定疾病有特异性参数来证明有益效果。“防治性”治疗是出于降低病理发展风险的目的而对未表现出疾病病征或仅表现出早期病征的对象施用的治疗。

术语“减少”是相对术语，使得如果在施用试剂后应答或病况被定量减少，或者如果在施用试剂后其与参考试剂相比减少，那么试剂减少应答或病况。类似地，术语“预防”并不一定意味着试剂完全消除应答或病况，只要消除应答或病况的至少一个特征即可。因此，减少或预防感染的免疫原性组合物可以但不一定完全消除这种感染，只要感染或应答可测量地减少，例如，在没有试剂的情况下或与参考试剂相比，感染减少至少约50％，例如至少约70％、或约80％、或甚至约90％(即达到10％或更低)。

疫苗：一种能够刺激免疫应答的免疫原性物质制剂，其被施用以用于预防、改善或治疗感染性疾病或其它类型的疾病。免疫原性物质可以包括减毒或杀死的微生物(例如细菌或病毒)，或来源于它们的抗原蛋白、肽或DNA。疫苗可以包括公开的免疫原(例如重组RSVF胞外域三聚体或编码其的核酸分子)、病毒、细胞或一种或多种细胞成分。疫苗可以引发防治性(预防性或保护性)和治疗性应答。施用方法根据疫苗而不同，但可以包括接种、摄取、吸入或其它形式的施用。疫苗可以与佐剂一起施用以加强免疫应答。在一个具体的非限制性实例中，与对照相比，疫苗预防和/或降低与RSV感染相关的症状的严重性和/或降低病毒载量。

载体：含有带有启动子的DNA或RNA分子的实体，所述启动子与感兴趣的(一或多种)抗原的编码序列可操作地连接并且可以表达编码序列。非限制性实例包括裸露或包装的(脂质和/或蛋白质)DNA、裸露或包装的RNA、病毒或细菌或其它可能无复制能力的微生物的亚组分、或者病毒或细菌或其它可能具有复制能力的微生物。载体有时被称为构建体。重组DNA载体是具有重组DNA的载体。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括本领域已知的一种或多种选择标记基因和其它遗传元件。病毒载体是重组核酸载体，其具有至少一些来源于一种或多种病毒的核酸序列。

病毒样颗粒(VLP)：衍生自数种病毒中的任何一种的非复制的病毒壳。VLP通常由一种或多种病毒蛋白构成，例如但不限于称为衣壳蛋白、外壳蛋白、壳蛋白、表面蛋白和/或包膜蛋白的那些蛋白，或衍生自这些蛋白的颗粒-形成多肽。在适当的表达系统中重组表达蛋白质后，VLP可以自发形成。产生特定VLP的方法是本领域已知的。可以使用本领域已知的常规技术检测病毒蛋白重组表达后VLP的存在，例如通过电子显微镜、生物物理表征等。此外，VLP可以通过已知技术分离，例如密度梯度离心，并通过特征密度条带鉴定。参见例如Baker等人(1991)Biophys.J.60：1445-1456；和Hagensee等人(1994)J.Virol.68：4503-4505；Vincente，JInvertebr Pathol.，2011；Schneider-Ohrum和Ross，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，354：53073，2012)。

II.重组RSV F胞外域三聚体

本文公开了重组RSV F胞外域三聚体，其从天然形式修饰(例如通过引入一个或多个氨基酸取代)以在RSV F融合前构象中稳定，所述构象包含抗原位点

重组RSV F胞外域三聚体包含三种重组原聚体，其包含RSV F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体可以是可溶性蛋白质复合物，例如用作重组亚基疫苗。在若干此类实施方案中，重组F

在其它实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体可以是膜锚定蛋白复合物，例如用于减毒病毒或病毒样颗粒疫苗。膜锚定可以例如通过重组F

与天然RSV F序列相比，重组F

在若干实施方案中，除DS、Cav1或DS-Cav1取代外，所公开的RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，本文公开的任何RSV F胞外域三聚体中的重组F

在融合前构象中重组RSV F胞外域三聚体的稳定化保留了抗原位点

在纯化的三聚体中，重组F

来自不同RSV组的天然RSV F蛋白以及编码这些蛋白的核酸序列和方法是已知的。所公开的重组RSV F胞外域三聚体可以衍生自任何类型的RSV，例如亚型A(例如A1或A2)、亚型B(例如B1或B2)或牛RSV。来自不同RSV亚型的RSV F蛋白，以及编码这些蛋白的核酸序列和用于操纵和将这些核酸序列插入载体的方法是已知的(参见例如，PCT公开号WO2014160463，通过引用并入本文；Sambrook等人(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第4版，Cold Spring Harbor，New York，2012)和Ausubel等人(In CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，至增刊104，2013)。

在一些实施方案中，包括本文公开的重组F

表1.示例性天然RSV F蛋白序列

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重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，与相应的天然RSV F序列相比，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在若干实施方案中，本文公开的重组RSV F胞外域三聚体可溶于水溶液。在一些实施方案中，重组RSV F胞外域在室温(例如20-22摄氏度)在水溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)或350mM NaCl(pH7.0))中溶解达到至少0.5mg/ml的浓度(例如至少1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml或至少5.0mg/ml)并保持溶解至少12小时(例如至少24小时、至少48小时、至少一周、至少两周、至少一个月或更多时间)。在一个实施方案中，磷酸盐缓冲盐水包括NaCl(137mM)、KCl(2.7mM)、Na

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体可以作为均匀群体提供，其在融合后构象中不包括可检测的RSV F胞外域三聚体。RSV F胞外域三聚体的构象可以例如通过负染色电子显微镜检测和/或通过适当的融合前或融合后特异性抗体的特异性结合来检测。在一些实施方案中，同质群体中至少约95％的重组RSV F胞外域三聚体(例如至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的RSV F蛋白)在融合前构象中是稳定的。

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体在磷酸盐缓冲盐水中在70℃孵育1小时后保留对融合前特异性抗体的特异性结合。例如，重组RSV F胞外域三聚体在磷酸盐缓冲盐水中的溶液在70℃孵育后可以保留至少50％(例如至少70％)对融合前特异性抗体(例如D25、AM22、5C4或MPE8)的结合活性。

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体在磷酸盐缓冲盐水中在70℃孵育1小时后保留对融合前特异性抗体的特异性结合。例如，重组RSV F胞外域三聚体在磷酸盐缓冲盐水中的溶液在70℃孵育后可以保留至少50％(例如至少70％)对融合前特异性抗体(例如D25、AM22、5C4或MPE8)的结合活性。

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体在磷酸盐缓冲盐水中在4℃孵育6个月后保留对融合前特异性抗体的特异性结合。例如，重组RSV F胞外域三聚体在磷酸盐缓冲盐水中的溶液在4℃孵育6个月后可以保留至少50％(例如至少70％、至少80％，或至少90％)对融合前特异性抗体(例如D25、AM22、5C4或MPE8)的结合活性。

在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的免疫原以包含本领域已知且容易获得的额外非蛋白质部分。适用于免疫原衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷(prolypropylene oxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可在制造中具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体附着的聚合物的数量可以变化，并且如果附着多于一种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑因素来确定，包括但不限于待提高或改变的免疫原的特定特性或功能、免疫原衍生物是否将用于在明确条件下的治疗等。

重组RSV F胞外域可以衍生化或与另一分子(例如另一肽或蛋白质)连接。通常，重组RSV F胞外域被衍生化，使得与针对重组RSV F蛋白的三聚体的广泛中和抗体(例如D25或AM22)的结合不受衍生化或标记的不利影响。例如，重组RSV F胞外域可以与一种或多种其它分子实体(例如抗体或蛋白质或检测标签)功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其它)。

本文提供的一些重组RSV F胞外域的序列包括本领域普通技术人员将理解的不会包括在分离的免疫原(包括用于治疗用途的重组RSV F胞外域三聚体)中的蛋白酶切割位点(例如凝血酶位点)、蛋白质标签(例如His标签、Strep标签II、Avi标签等)、信号肽的序列。

与三聚化结构域的连接

在若干实施方案中，所公开的重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

例如，所公开的重组RSV F胞外域三聚体中每个重组F

促进可溶性重组蛋白的稳定三聚体的外源多聚化结构域的非限制性实例包括：GCN4亮氨酸拉链(Harbury等人1993Science 262：1401-1407)、来自肺表面活性蛋白的三聚化基序(Hoppe等人1994FEBS Lett 344：191-195)、胶原蛋白(McAlinden等人2003 J BiolChem 278：42200-42207)以及噬菌体T4 fibritin折叠子(Miroshnikov等人1998 ProteinEng 11：329-414)，其中任何一个都可以与重组F

在一些实例中，所公开的重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

与三聚化结构域连接的重组RSV F胞外域可以包括本文提供的任何稳定化突变(或其组合)，只要与三聚化结构域连接的重组RSV F胞外域保留所需特性(例如包括抗原位点

在额外的实施方案中，所公开的重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

在这样的实施方案中，半胱氨酸拉链结构域包含具有三个平行的α-螺旋的卷曲螺旋结构域，每个螺旋基于开始于大约位置512处的天然RSV F蛋白的α10螺旋的一部分。天然RSV F蛋白在其融合前构象中的α10螺旋在F蛋白的大约位置492处开始，并在C端直接延伸到跨膜结构域(其大约在残基529处开始)。与细胞膜相邻，天然RSV F胞外域的三个α10螺旋形成卷曲螺旋结构域。将半胱氨酸残基引入卷曲螺旋的序列中以允许在卷曲螺旋的α-螺旋之间形成原聚体间二硫键，从而将三个α-螺旋“锁定”在三聚体构型中。天然卷曲螺旋结构域的长度足以引入二半胱氨酸基序的三个环(在七价位置g和a处，从RSV F位置512开始)。在若干实施方案中，半胱氨酸取代存在于RSV F位置512、513、519、520、526和527处。在二半胱氨酸基序的每个环的半胱氨酸残基之间可以形成原聚体间二硫键，从而使重组RSV F蛋白在三聚体构型中稳定。例如，重组RSV F胞外域三聚体中每个重组F

hRSV F亚型A DS-Cav1，ABC环：

hRSV F亚型B DS-Cav1，ABC环：

牛RSV F DS-Cav1，ABC环：

在一些实施方案中，与天然RSV F蛋白中的相应α-螺旋结构相比，半胱氨酸拉链三聚化结构域中的三个平行α-螺旋可以是延长的。通常，延长卷曲螺旋结构域中的α-螺旋包括从F

hRSV F亚型A DS-Cav1，ABCD环：

hRSV F亚型B DS-Cav1，ABCD环：

牛RSV F DS-Cav1，ABCD环：

膜锚定的实施方案

在一些实施方案中，RSV F胞外域三聚体可以是膜锚定的，例如，对于RSV F胞外域三聚体在减毒病毒疫苗或病毒样颗粒上表达的实施方案。在此类实施方案中，三聚体中的重组F

用于所公开实施方案的跨膜结构域的非限制性实例包括RSV F跨膜结构域，例如IIIVIIVILLSLIAVGLLLYC(SEQ ID NO：57，残基530-550)、甲型流感血凝素TM结构域(ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF，SEQ ID NO：73)以及甲型流感神经氨酸酶TM结构域(IITIGSICMVVGIISLILQIGNIISIWVS，SEQ ID NO：74)。

与跨膜结构域连接的重组F

示例性序列

下表提供了重组F

表2.示例性重组F

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在一些实施方案中，重组RSV F胞外域三聚体中的重组F

SEQ ID NO：1、3-5、7-10、12-13、24-29、36-37、40-41、44-45、48-49、52-53、56、100-102、105-107或110-113中任一个的残基26-474；

SEQ ID NO：2、6、11、30-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55中任一个的残基26-475。

SEQ ID NO：14-15、17-20、22-23、103-104或108-109中任一个的残基31-479；

SEQ ID NO：16或21中任一个的残基31-480；

SEQ ID NO：81-84中任一个的残基26-484；

SEQ ID NO：1、3-5、7-10、12-13、24-29、36-37、40-41、44-45、48-49、52-5356、100-102、105-107或110-113中任一个的残基26-504；

SEQ ID NO：2、6、11、30-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55中任一个的残基26-505。

SEQ ID NO：14-15、17-20或22-23、103-104或108-109中任一个的残基31-509；

SEQ ID NO：16或21中任一个的残基31-510；或

SEQ ID NO：81-84中任一个的残基26-514；

或与其至少90％(例如至少95％或至少98％)相同的氨基酸序列。

III.蛋白质纳米颗粒

在一些实施方案中，提供了蛋白质纳米颗粒，其包括一种或多种所公开的重组RSVF胞外域(例如包括DS-Cav1取代的RSV F胞外域，其通过半胱氨酸拉链结构域中二半胱氨酸基序的四个环中半胱氨酸残基之间的原聚体间二硫键在三聚体构型中稳定)。纳米颗粒的非限制性实例包括铁蛋白纳米颗粒、包封蛋白纳米颗粒、硫加氧酶还原酶(SOR)纳米颗粒和二氧四氢蝶啶合酶纳米颗粒，其分别由包括铁蛋白、包封蛋白、SOR蛋白和二氧四氢蝶啶合酶的单体亚基的组装构成。下文提供了与纳米颗粒亚基连接的重组RSV F胞外域的示例性序列。为了构建包括重组RSV F胞外域的蛋白质纳米颗粒，RSV F胞外域可以与蛋白质纳米颗粒的亚基(例如铁蛋白、包封蛋白、SOR蛋白或二氧四氢蝶啶合酶蛋白)连接。融合蛋白在适当条件下自组装成纳米颗粒。

在若干实施方案中，蛋白质纳米颗粒包含两种或更多种重组RSV F胞外域，其中两种或更多种重组RSV F胞外域来自至少两种不同的RSV病毒株。

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域(例如包含SEQ ID NO：9-16中任一个的F

每个单体亚基具有螺旋束的拓扑结构，其包括四个反平行螺旋基序，第五个较短的螺旋(C端螺旋)大致位于垂直于4个螺旋束的长轴。按照惯例，螺旋分别从N端标记为‘A、B、C、D和E’。N端序列位于与衣壳三重轴相邻并延伸至表面，而E螺旋在四重轴处与延伸到衣壳核心的C端包装在一起。这种包装的结果在衣壳表面上形成两个孔。预期这些孔中的一个或两个代表水合铁扩散进出衣壳的点。产生后，这些单体亚基蛋白自组装成球状铁蛋白。因此，铁蛋白的球状形式包含24个单体亚基蛋白，并且具有432对称性的衣壳样结构。构建铁蛋白纳米颗粒的方法是本领域普通技术人员已知的并且在本文中进一步描述(参见例如Zhang，Int.J.Mol.Sci.，12：5406-5421，2011，其通过引用全部并入本文中)。

在具体实例中，铁蛋白多肽是大肠杆菌(E.coli)铁蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白、人轻链铁蛋白、牛蛙铁蛋白或其杂交体，例如大肠杆菌-人杂交铁蛋白、大肠杆菌-牛蛙杂交铁蛋白或人-牛蛙杂交铁蛋白。用于制备包括重组RSV F胞外域的铁蛋白纳米颗粒的铁蛋白多肽的示例性氨基酸序列和编码铁蛋白多肽的核酸序列可以在

在额外的实施方案中，任何公开的重组RSV F胞外域可以与二氧四氢蝶啶合酶亚基连接以构建二氧四氢蝶啶合酶纳米颗粒。二氧四氢蝶啶合酶纳米颗粒的球状形式由单体亚基构成；一个这样的二氧四氢蝶啶合酶亚基的序列的实例以如下所示的氨基酸序列形式提供：

在一些实施方案中，公开的其重组RSV F胞外域可以与二氧四氢蝶啶合酶亚基连接，所述二氧四氢蝶啶合酶亚基包括与SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少97％)相同的氨基酸序列。

在额外的实施方案中，其重组RSV F胞外域可以与包封蛋白纳米颗粒亚基连接以构建包封蛋白纳米颗粒。包封蛋白纳米颗粒的球状形式由单体亚基构成；一个这样的包封蛋白亚基的序列的实例以如下所示的氨基酸序列形式提供：

在一些实施方案中，重组RSV F胞外域可以与包封蛋白亚基连接，所述包封蛋白亚基包括与SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少97％)相同的氨基酸序列。

包封蛋白是一种保守的细菌蛋白家族，也称为linocin样蛋白，其形成大蛋白组装体以充当包装酶的最小区室。包封蛋白组装体由单体亚基构成，所述单体亚基是分子量约为30kDa的多肽。在产生后，单体亚基自组装成球状包封蛋白组装体，其包括60个单体亚基，或在一些情况下，180个单体亚基。构建包封蛋白纳米颗粒的方法是本领域普通技术人员已知的，并且在本文中进一步描述(参见例如Sutter等人，Nature Struct.and Mol.Biol.，15：939-947，2008，其通过引用全部并入本文中)。在具体实例中，包封蛋白多肽是细菌包封蛋白，例如海栖热袍菌(Thermotoga maritime)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)或红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)或黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)包封蛋白。

在额外的实施方案中，重组RSV F胞外域可以与硫加氧酶还原酶(SOR)亚基连接以构建重组SOR纳米颗粒。在一些实施方案中，SOR亚基可以包括如下所示的氨基酸序列：

在一些实施方案中，其重组RSV F胞外域可以与SOR亚基连接，所述SOR亚基包括与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列至少80％(例如至少85％、至少90％、至少95％或至少97％)相同的氨基酸序列。

SOR蛋白质是微生物蛋白质(例如来自嗜热嗜酸型古细菌布氏酸双面菌(Acidianus ambivalens)，其形成24个亚基蛋白质组装体。构建SOR纳米颗粒的方法是本领域普通技术人员已知的(参见例如Urich等人，Science，311：996-1000，2006，其通过引用全部并入本文中)。用于制备SOR纳米颗粒的SOR蛋白的氨基酸序列的实例在Urich等人，Science，311：996-1000，2006中列出，其通过引用全部并入本文中。

出于生产目的，与纳米颗粒亚基连接的重组F

在一些实例中，重组RSV F胞外域或其免疫原性片段可以连接至N或C端，或者例如与接头(例如Ser-Gly接头)一起置于铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶亚基的内环中。当构建体在HEK 293 Freestyle细胞中制备时，融合蛋白从细胞中分泌并自组装成纳米颗粒。可以使用已知技术纯化纳米颗粒，例如通过若干不同的色谱方法，例如Mono Q(阴离子交换)随后进行尺寸排阻(

若干实施方案包括铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶蛋白的单体亚基，或其能够指导单体亚基自组装成蛋白质的球状形式的任何部分。来自任何已知铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶蛋白的单体亚基的氨基酸序列可被用于与重组RSV F胞外域或其免疫原性片段一起产生融合蛋白，只要所述单体亚基能够自组装成纳米颗粒在其表面上展示重组RSV F胞外域或其免疫原性片段即可。

融合蛋白不需要包含铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶蛋白的单体亚基多肽的全长序列。可以使用单体亚基多肽的部分或区域，只要所述部分包含指导单体亚基自组装成蛋白质的球状形式的氨基酸序列即可。

完成任何重组RSV F胞外域(例如三聚体形式)或其免疫原性片段与铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶蛋白的融合，使得重组RSV F胞外域或其免疫原性片段不干扰单体铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶亚基自组装成球状蛋白质，并且使得铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶亚基不干扰所公开的重组RSV F胞外域或其免疫原性片段引发对RSV F的免疫应答的能力。在一些实施方案中，铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶蛋白和重组RSV F胞外域或其免疫原性片段可以直接连接在一起而不影响任一部分的活性。在其他实施方案中，铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶蛋白和重组RSV F胞外域或其免疫原性片段可以使用接头(也称为间隔区)序列连接。设计接头序列以定位融合蛋白的铁蛋白、包封蛋白、SOR或二氧四氢蝶啶合酶部分，并且重组RSV F胞外域或其免疫原性片段可以相对于彼此与融合蛋白的一部分连接，使得融合蛋白保持组装成纳米颗粒的能力，并且还引发对重组RSV F胞外域的免疫应答。在若干实施方案中，接头序列包含氨基酸。使用的优选氨基酸是具有小侧链和/或不带电荷的氨基酸。这些氨基酸不太可能干扰融合蛋白的合适折叠和活性。因此，单独或组合用于接头序列的优选氨基酸是丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸。这种接头序列的一个实例是SGG。可根据需要添加或减少氨基酸。本领域技术人员能够确定用于构建蛋白质纳米颗粒的合适的接头序列。

IV.多核苷酸和表达

还提供了编码任何公开的重组RSV F胞外域三聚体的重组F

编码RSV A2病毒株sc9-10、DS-Cav1、A149C-Y458C的DNA(SEQ ID NO：96)

编码RSV A2病毒株sc9-10、DS-Cav1、N183GC-N428C的DNA(SEQ ID NO：97)

编码RSV病毒株B18537-sc9-10、DS-Cav1、Q98C-361C-L95M-I221M-R429K的DNA(SEQ ID NO：98)

编码RSV LongVR26病毒株sc9-10、DS-Cav1、Q98C-361C-L95M-I221M-R429K-I217P-S46G-K465Q-S215P-E92D的DNA(SEQ ID NO：99)

在若干实施方案中，核酸分子编码公开的重组F

在若干实施方案中，核酸分子编码前体F

示例性核酸可以通过克隆技术制备。已知适当克隆和测序技术的实例和足以通过许多克隆练习指导技术人员的说明书(参见例如Sambrook等人(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor，New York，2012)和Ausubel等人(InCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，至增刊104，2013)。来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供有用的信息。这些制造商包括SIGMA Chemical Company(Saint Louis，MO)、R&D Systems(Minneapolis，MN)、PharmaciaAmersham(Piscataway，NJ)、CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、Chem GenesCorp.、Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)、Glen Research，Inc.、GIBCO BRLLife Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)、Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)、Invitrogen(Carlsbad，CA)和AppliedBiosystems(Foster City，CA)，以及技术人员已知的许多其它商业来源。

核酸也可以通过扩增方法制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自主序列复制系统(3SR)。多种克隆方法、宿主细胞和体外扩增方法是本领域技术人员所熟知的。

编码公开的重组F

编码公开的重组F

编码所公开的重组F

宿主可以包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物生物体。在原核生物中表达具有真核或病毒序列的DNA序列的方法是本领域熟知的。合适的宿主细胞的非限制性实例包括细菌、古细菌、昆虫、真菌(例如酵母)、植物和动物细胞(例如哺乳动物细胞，例如人)。使用的示例性细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、SF9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢菌(Neurospora)以及永生化的哺乳动物骨髓和淋巴细胞系。用于在培养物中增殖哺乳动物细胞的技术是熟知的(参见例如Helgason和Miller(编)，2012，Basic Cell CultureProtocols(Methods in Molecular Biology)，第4版，Humana Press)。常用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、CHO细胞和WI38、BHK和COS细胞系，尽管可以使用细胞系，但是设计例如用于提供更高表达、期望的糖基化模式或其它特征的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括HEK293细胞或其衍生物，例如GnTI

用重组DNA转化宿主细胞可以通过本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是原核生物时，例如但不限于大肠杆菌，可以从指数生长期后收获的细胞制备能够摄取DNA的感受态细胞，随后使用本领域熟知的程序通过CaCl

当宿主是真核生物时，可以使用转染DNA的方法例如磷酸钙共沉淀物、常规机械程序(例如显微注射)、电穿孔、插入包裹在脂质体中的质粒或病毒载体。真核细胞也可以与编码公开的抗原的多核苷酸序列和编码可选择表型的第二外源DNA分子(例如单纯疱疹胸苷激酶基因)共转化。另一种方法是使用真核病毒载体，例如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒，以瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白质(参见例如Viral Expression Vectors，Springer press，Muzyczka编，2011)。本领域技术人员可以容易地使用表达系统，例如用于在细胞中产生蛋白质的质粒和载体，所述细胞包括高等真核细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。

在一个非限制性实例中，使用pVRC8400载体表达公开的免疫原(描述于Barouch等人，J.Virol.，79，8828-8834，2005，其通过引用并入本文中)。

可以对编码所公开的重组F

在一些实施方案中，所公开的重组F

V.病毒载体

编码公开的重组F

在若干实例中，编码重组F

在若干实施方案中，编码重组F

额外的病毒载体也可用于表达公开的抗原，包括多瘤病毒，即SV40(Madzak等人，1992，J.Gen.Virol.，73：15331536)、腺病毒(Berkner，1992，Cur.Top.Microbiol.Immunol.，158：39-6；Berliner等人，1988，Bio Techniques，6：616-629；Gorziglia等人，1992，J.Virol.，66：4407-4412；Quantin等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2581-2584；Rosenfeld等人，1992，Cell，68：143-155；Wilkinson等人，1992，Nucl.Acids Res.，20：2233-2239；Stratford-Perricaudet等人，1990，Hum.Gene Ther，1：241-256)、牛痘病毒(Mackett等人，1992，Biotechnology，24：495-499)、腺相关病毒(Muzyczka，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：91-123；On等人，1990，Gene，89：279-282)、包括HSV和EBV和CMV的疱疹病毒(Margolskee，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：67-90；Johnson等人，1992，J.Virol.，66：29522965；Fink等人，1992，Hum.Gene Ther.3：11-19；Breakfield等人，1987，Mol.Neurobiol.，1：337-371；Fresse等人，1990，Biochem.Pharmacol.，40：2189-2199)、辛德毕斯病毒(H.Herweijer等人，1995，Human Gene Therapy 6：1161-1167；美国专利第5,091,309号及第5,2217,879号)、甲病毒(S.Schlesinger，1993，Trends Biotechnol.11：18-22；I.Frolov等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11371-11377)以及禽类逆转录病毒(Brandyopadhyay等人，1984，Mol.Cell Biol.，4：749-754；Petropouplos等人，1992，J.Virol.，66：3391-3397)、鼠类逆转录病毒(Miller，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：1-24；Miller等人，1985，Mol.Cell Biol.，5：431-437；Sorge等人，1984，Mol.Cell Biol.，4：1730-1737；Mann等人，1985，J.Virol.，54：401-407)和人类来源的逆转录病毒(Page等人，1990，J.Virol.，64：5370-5276；Buchschalcher等人，1992，J.Virol.，66：2731-2739)。杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒；AcMNPV)载体也是本领域中已知的，并且可以从商业来源获得(例如PharMingen，San Diego，Calif.；Protein Sciences Corp.，Meriden，Conn.；Stratagene，La Jolla，Cali(.)。额外的病毒载体是本领域普通技术人员熟悉的。

VI.病毒样颗粒

在一些实施方案中，提供了病毒样颗粒(VLP)，其包括公开的重组RSV F胞外域三聚体。通常，此类VLP包括通过C端跨膜结构域膜锚定的重组RSV F胞外域三聚体，例如三聚体中的重组F

VII.免疫原性组合物

还提供包含公开的免疫原(例如重组RSV F胞外域三聚体、编码公开的重组RSV F胞外域三聚体的重组F

此类组合物可以通过本领域普通技术人员已知的各种施用模式施用于对象，例如肌肉内、皮下、静脉内、动脉内、关节内、腹膜内或肠胃外途径。

因此，本文所述的免疫原可以与药学上可接受的运载体一起配制，以帮助保留生物活性，同时还促进在可接受的温度范围内储存期间的稳定性增加。可能的运载体包括但不限于生理平衡的培养基、磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)、各种类型的润湿剂、冷冻保护添加剂或稳定剂，例如蛋白质、肽或水解产物(例如白蛋白、明胶)、糖(例如蔗糖、乳糖、山梨糖醇)、氨基酸(例如谷氨酸钠)或其它保护剂。可以将所得水溶液包装以便原样使用或冻干。对于单次或多次给药，在施用之前将冻干制剂与无菌溶液混合。

配制的组合物，尤其是液体制剂，可以含有抑菌剂以在储存期间防止或最小化降解，包括但不限于有效浓度(通常≤1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。抑菌剂对于一些患者可能是禁忌；因此，冻干制剂可以在含有或不含有这种成分的溶液中复原。

本公开的免疫原性组合物可以含有根据需要接近生理条件的作为药学上可接受的媒介物物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和三乙醇胺油酸酯。

免疫原性组合物可以任选地包括佐剂以增强宿主的免疫应答。佐剂，例如氢氧化铝(可从Brenntag Biosector，Copenhagen，Denmark购得的

在若干实施方案中，选择佐剂以在对象中引发Th1偏向的免疫应答。

在一些情况下，佐剂制剂是矿物盐，例如钙或铝(明矾)盐，例如磷酸钙、磷酸铝或氢氧化铝。在一些实施方案中，佐剂包括油和水乳液，例如水包油型乳液(例如MF59(Novartis)或AS03(GlaxoSmithKline))。水包油型乳液的一个实例包含在水性运载体中的可代谢的油，例如角鲨烯、母育酚例如生育酚(例如α-生育酚)、和表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span85)或聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(Tween80))。

在某些情况下，可能需要将公开的免疫原与诱导对其它试剂的保护性应答的其它药物产品(例如疫苗)组合。例如，包含如本文所述的重组RSV F胞外域三聚体的组合物可以与Advisory Committee on Immunization Practices(ACIP；cdc.gov/vaccines/acip/index.html)针对目标年龄组(例如大约一至六个月大的婴儿)推荐的其它疫苗同时(通常单独)或顺序施用。因此，本文所述的公开的免疫原可以与针对例如乙型肝炎(HepB)、白喉、破伤风和百日咳(DTaP)、肺炎球菌(PCV)、b型流感嗜血杆菌(Hib)、脊髓灰质炎、流感和轮状病毒的疫苗同时或顺序施用。

在一些实施方案中，组合物可以作为无菌组合物提供。免疫原性组合物通常含有有效量的公开的免疫原，并且可以通过常规技术制备。通常，每种剂量的免疫原性组合物中免疫原的量选择为诱导免疫应答而没有显著的不良副作用的量。在一些实施方案中，组合物可以单位剂型提供，用于在对象中诱导免疫应答，例如以预防对象中的RSV感染。单位剂型含有适合施用于对象的单一预选剂量，或两种或多种预选单位剂量的合适标记或测量倍数，和/或用于施用单位剂量或其倍数的计量机制。

在一些实施方案中，所述组合物包括第一免疫原，其包括基于RSV F亚型A蛋白的本文公开的第一重组RSV F胞外域三聚体，和基于RSV F亚型B蛋白的本文公开的第二重组RSV F胞外域三聚体。

VIII.治疗方法

公开的免疫原(例如重组RSV F胞外域三聚体、编码公开的重组RSV F胞外域三聚体的重组F

可以选择具有RSV感染或有发生RSV感染风险(例如由于暴露或可能暴露于RSV)的对象进行治疗。在施用公开的免疫原后，可以监测对象的RSV感染或与其相关的症状，或两者。

旨在用本公开的疗法和方法治疗的典型对象包括人，以及非人灵长类动物和其它动物，例如牛。由于几乎所有人都在5岁前感染RSV，因此包括整个出生队列作为相关的免疫接种群体。例如，这可以通过从出生到6个月、从6个月到5岁的任何时间、在孕妇(或育龄妇女)中通过抗体的被动转移来保护其婴儿、新生儿家庭成员或仍在子宫内的成员，以及年龄超过50岁的对象中开始免疫方案来进行。本公开的范围旨在包括母体免疫。在若干实施方案中，对象是对RSV特异性抗体具有血清反应阴性的人类对象。在另外的实施方案中，对象不超过一岁，例如不超过6个月、不超过3个月，或不超过1个月。

具有严重症状(例如需要住院治疗)的RSV感染风险最大的对象包括早产儿、患有支气管肺发育不良和先天性心脏病的儿童，其最易患严重疾病。特应性或特应性家族史也与婴儿期的严重疾病有关。在儿童期和成年期，疾病较轻但可能与下呼吸道疾病相关，并且通常并发鼻窦炎。在收容入院的老年人(例如65岁以上的人)中疾病严重程度增加。患有重症联合免疫缺陷病或在骨髓或肺移植后的个人也会发生严重疾病。(参见例如Shay等人，JAMA，282：1440-6，1999；Hall等人，N Engl J Med.2009；360：588-598；Glezen等人，AmJDis Child.，1986；140：543-546；和Graham，Immuno1.Rev.，239：149-166，2011，其各自通过引用并入本文中)。因此，可以选择这些对象用于施用公开的免疫原，或编码、表达或包括免疫原的核酸或病毒载体。

为了根据本公开的方法鉴定用于预防或治疗的对象，采用公认的筛选方法来确定与靶向或疑似疾病或病况相关的风险因子，或确定对象中现有疾病或病况的状态。这些筛选方法包括例如常规检查，以确定可能与靶向或疑似疾病或病况相关的环境、家族、职业和其它此类风险因素，以及本领域中可用并熟知的诊断方法，例如各种ELISA和其它免疫测定方法，以检测和/或表征RSV感染。这些和其它常规方法允许临床医生选择需要使用本公开的方法和免疫原性组合物的疗法的患者。根据这些方法和原理，组合物可以根据本文的教导或本领域普通技术人员已知的其它常规方法施用，作为独立的预防或治疗程序，或作为其它治疗的后续、辅助或协调治疗方案。

公开的免疫原的施用可以用于预防或治疗目的。当在预防上提供时，可以在任何症状之前，例如在感染之前提供免疫原。预防性施用用于预防或改善任何后续感染。在一些实施方案中，所述方法可以涉及选择有感染RSV感染风险的对象，和向所述对象施用治疗有效量的公开的免疫原。可以在预期暴露于RSV之前提供免疫原，以便在暴露或怀疑暴露于病毒之后或在实际感染开始之后减弱预期的感染的严重性、持续时间或程度和/或相关疾病症状。当在治疗上提供时，在RSV感染症状发作时或之后，或在诊断RSV感染后提供公开的免疫原。通过抑制RSV复制或感染来治疗RSV可以包括延迟和/或减少对象中RSV感染的病征或症状。在一些实例中，使用本文公开的方法的治疗延长了对象的存活时间。

在一些实施方案中，当对象随后被野生型RSV感染或再感染时，向对象施用公开的免疫原可以引发免疫应答的产生，所述免疫应答预防严重的下呼吸道疾病，例如肺炎和细支气管炎，或哮吼。虽然天然循环病毒仍然能够引起感染，特别是在上呼吸道中，但是由于接种疫苗可能导致鼻炎的可能性降低，并且随后通过野生型病毒的感染可能增强抗性。接种疫苗后，存在可检测水平的宿主产生的血清和分泌抗体，其能够在体外和体内中和同源(相同亚组)野生型病毒。在许多情况下，宿主抗体也会中和不同的非疫苗亚组的野生型病毒。为了实现更高水平的交叉保护，例如针对另一亚组的异源病毒株，可以用包括重组病毒载体的组合物接种对象，所述重组病毒载体包括来自RSV组A和B的至少一种主要病毒株的RSV F蛋白。

本文所述的免疫原及其免疫原性组合物以有效诱导或增强对象(优选人)针对RSVF蛋白的免疫应答的量提供给对象。公开的免疫原的实际剂量将根据以下因素而变化：例如疾病适应症和对象的特定状态(例如对象的年龄、体型、适合度、症状程度、易感因素等)、施用的时间和途径、同时施用的其它药物或治疗，以及用于在对象中引发所需活性或生物应答的组合物的特定药理学。可以调整剂量方案以提供最佳的预防或治疗应答。

包括一种或多种公开的免疫原的免疫原性组合物可用于协调(或初免-加强)疫苗接种方案或组合制剂。在某些实施方案中，新的组合免疫原性组合物和协调免疫方案采用单独的免疫原或制剂，每种免疫原或制剂针对引发抗病毒免疫应答，例如对RSV蛋白的免疫应答。引发抗病毒免疫应答的单独免疫原性组合物可以组合在单次免疫步骤中施用于对象的多价免疫原性组合物中，或者它们可以在协调(或初免-加强)免疫方案中单独施用(在单价免疫原性组合物中)。

可以有数种加强，并且每种加强可以是不同的公开的免疫原。在一些实例中，加强可以是与另一种加强或初免相同的免疫原。初免和加强可以作为单剂量或多剂量施用，例如可以在数天、数周或数月内向对象施用两剂、三剂、四剂、五剂、六剂或更多剂。还可以给出多次加强，例如一到五次(例如1、2、3、4或5次加强)或更多。不同剂量可用于一系列顺序免疫。例如，初次免疫中的相对大剂量，然后加强中的相对较小剂量。

在一些实施方案中，可以在初免后约两周、约三至八周或约四周，或在初免后约数月施用加强。在一些实施方案中，可以在初免后约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约10个月、约12个月、约18个月、约24个月，或在初免后的更多或更少时间施用加强。还可以在适当的时间点使用定期额外的加强来增强对象的“免疫记忆”。所选择的疫苗接种参数(例如制剂、剂量、方案等)的充分性，可以通过从对象获取等份的血清并在免疫程序的过程中测定抗体滴度来确定。另外，可以监测对象的临床状况以获得期望的效果，例如预防RSV感染或提高疾病状态(例如减少病毒载量)。如果这种监测表明疫苗接种是次优的，则可以用额外剂量的免疫原性组合物加强对象，并且可以预期增强免疫应答的方式修改疫苗接种参数。

在一些实施方案中，施用于对象的初免包括(或编码)基于亚型A RSV F蛋白的公开的重组RSV F胞外域三聚体，并且施用于对象的加强包括(或编码)基于亚型B RSV F蛋白的公开的重组RSV F胞外域三聚体。在一些实施方案中，施用于对象的初免包括(或编码)基于亚型B RSV F蛋白的公开的重组RSV F胞外域三聚体，并且施用于对象的加强包括(或编码)基于亚型ARSV F蛋白的公开的重组RSV F胞外域三聚体。在一些实施方案中，施用于对象的初免和/或加强组合物各自包括(或编码)基于亚型A和亚型B RSV F蛋白的公开的重组RSV F胞外域三聚体的混合物(例如50/50混合物)。

在一些实施方案中，初免-加强方法可以包括针对对象的DNA-初免和蛋白质-加强免疫方案。该方法可以包括两次或多次施用核酸分子或蛋白质。

对于蛋白质治疗，通常，每个人剂量将包含1-1000μg蛋白质，例如约1μg至约100μg，例如约1μg至约50μg，例如约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约40μg或约50μg。基于对象群体(例如婴儿或老年人)选择免疫原性组合物中使用的量。特定组合物的最佳量可以通过标准研究确定，所述标准研究涉及观察抗体滴度和对象中的其它应答。应理解，免疫原性组合物中公开的免疫原(例如重组RSV F胞外域或其免疫原性片段、病毒载体或核酸分子)的治疗有效量可以包括通过施用单剂量引发免疫应答无效，但在施用多剂量时(例如在初免-加强施用方案中)有效的量。

在施用公开的免疫原后，对象的免疫系统通常通过产生特异性针对病毒蛋白的抗体来应答免疫原性组合物。这种应答表明免疫有效剂量被递送给对象。

对于每个特定对象，可以随时间推移根据个体需要和施用或监督免疫原性组合物施用的个人的专业判断来评估和调整特定剂量方案。剂量和剂量数量将取决于设定，例如在由先前RSV感染或免疫而初免的成人或任何人中，单剂量可以是足够的加强剂。在未免疫的对象中，在一些实例中，将给予至少两个剂量，例如至少三个剂量。在一些实施方案中，每年进行一次加强，例如连同每年一次的流感疫苗接种一起。

在一些实施方案中，对象的抗体应答将在评估有效剂量/免疫方案的背景下确定。在大多数情况下，评估从对象获得的血清或血浆中的抗体滴度就足够了。关于是否施用加强接种和/或改变施用于个体的治疗剂的量的决定可以至少部分地基于抗体滴度水平。抗体滴度水平可以基于例如免疫结合测定，其测量血清中与包括例如RSV F蛋白的抗原结合的抗体浓度。

有效剂量的确定通常基于动物模型研究，随后进行人体临床试验，并且通过显著降低对象中靶向疾病症状或病况的发生或严重性或在对象中诱导所需应答(例如中和免疫应答)的施用方案来指导。在这方面，合适的模型包括例如小鼠、大鼠、猪、猫、白鼬、非人灵长类动物和本领域已知的其它可接受的动物模型对象。或者，可以使用体外模型(例如免疫学和组织病理学测定)确定有效剂量。使用这样的模型，仅需要普通的计算和调整来确定施用治疗有效量(例如有效引发期望的免疫应答或减轻目标疾病的一种或多种症状的量)的组合物的适当浓度和剂量。在替代实施方案中，有效量或有效剂量的组合物可以简单地抑制或增强与疾病或病况相关的一种或多种选定的生物活性，如本文所述，用于治疗或诊断目的。在一个实施方案中，病毒施用的一般范围是约10

施用引发免疫应答以减少或预防感染的免疫原性组合物可以但不一定完全消除这种感染，只要感染可测量地减少即可。例如，与合适的对照相比，施用有效量的试剂可使RSV感染(例如，通过细胞的感染或通过RSV感染的对象的数量或百分比测量)减少所需的量，例如减少至少10％、至少20％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，或甚至至少100％(消除或预防可检测的RSV感染。

在一些实施方案中，向对象施用治疗有效量的一种或多种公开的免疫原在对象中诱导中和免疫应答。为了评估中和活性，在对象免疫后，可以在适当的时间点从对象收集血清，冷冻并储存用于中和测试。测定中和活性的方法是本领域普通技术人员已知的并且在本文中进一步描述，并且包括但不限于空斑减少中和(PRNT)测定、微量中和测定、基于流式细胞术的测定、单一循环感染测定。在一些实施方案中，可以使用一组RSV假病毒测定血清中和活性。

施用核酸的一种方法是用质粒DNA直接免疫，例如用哺乳动物表达质粒。通过核酸构建体的免疫是本领域熟知的，并且教导于例如美国专利第5,643,578号(其描述了通过引入编码所需抗原的DNA以引发细胞介导的应答或体液应答来免疫脊椎动物的方法)，以及美国专利第5,593,972号和美国专利第5,817,637号(其描述了将编码抗原的核酸序列与能够实现表达的调控序列可操作地连接)。美国专利第5,880,103号描述了数种向生物体递送编码免疫原性肽或其它抗原的核酸的方法。所述方法包括核酸(或合成肽本身)、和免疫刺激构建体、或ISCOMS

在一些实施方案中，质粒DNA疫苗用于在对象中表达公开的免疫原。例如，可以将编码以在融合前构象中稳定的重组RSV F胞外域的核酸分子施用于对象以诱导对RSV F蛋白的免疫应答。在一些实施方案中，核酸分子可以包括在用于DNA免疫的质粒载体上，例如pVRC8400载体(描述于Barouch等人，J.Virol，79，8828-8834，2005，其通过引用并入本文中)。

在使用核酸进行免疫的另一种方法中，公开的重组RSV F胞外域或其免疫原性片段也可以通过减毒病毒宿主或载体或细菌载体表达。重组牛痘病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、逆转录病毒、细胞瘤病毒或其它病毒载体可用于表达肽或蛋白质，从而引发CTL应答。例如，在美国专利第4,722,848号中描述了用于免疫方案的牛痘载体和方法。BCG(卡介苗(Bacillus Calmette Guerin))提供了另一种用于表达肽的载体(参见Stover，Nature351：456-460，1991)。

在一个实施方案中，将编码公开的重组RSV F胞外域或其免疫原性片段的核酸直接引入细胞中。例如，可以通过标准方法将核酸加载到金微球上，并通过例如Bio-Rad的Helios

在某些实施方案中，免疫原可以与其它抗RSV治疗剂顺序施用，例如在其它试剂之前或之后。本领域普通技术人员将知道，顺序施用可以意指紧接着或在适当的时间段之后，例如数小时、数天、数周、数月或甚至数年之后。

在若干实施方案中，将本文公开的免疫原性组合物与其它试剂如蛋白质、肽、抗体和其它抗病毒剂如抗RSV剂一起施用可能是有利的。抗RSV剂的非限制性实例包括单克隆抗体帕利珠单抗(

实施例

提供以下实施例以说明某些实施方案的特定特征，但权利要求的范围不应限于所例举的那些特征。

实施例1

针对呼吸道合胞病毒的融合糖蛋白疫苗的迭代基于结构的提高

摘要

来自呼吸道合胞病毒(RSV)的严重疾病最常发生在婴儿肺部仍在发育的生命的前六个月。母体抗体-在妊娠的最后几周内转移-提供保护性免疫，但这种保护每月减弱约2倍，并且在出生时应该是保护阈值的约2

引言

人类呼吸道合胞病毒(RSV)几乎感染了所有两岁以内儿童，占该年龄组由于呼吸道感染住院治疗的约50％。母体抗体-在妊娠的最后几周内通过胎盘转移-为足月婴儿提供保护性免疫(van den Berg等人，Early Human Development，87，67，2011；Hobbs和Davis，Lancet，1，757，1967)，但这种保护每月减弱约2倍(Leuridan等人，BMJ，340，c1626，2010；Sarvas等人，J.Clinical Immunol.，13，145，1993；Lee等人，J.Infect.Dis.，183，1281，2001)，由于母体抗体减弱和婴儿肺部仍在发育，因此出生后头五个月婴儿住院治疗RSV达到峰值(Hall等人，Pediatrics 132，e341，2013)。对于妊娠＜28周出生的婴儿，建议每月注射人源化单克隆抗体帕利珠单抗

一种可能性是母体免疫。然而，假设大约一个月的半衰期，滴度在出生时必须比保护阈值高出2

从历史上看，在先前存在免疫力的人类中加强中和活性已经困难：数十年的RSV疫苗研究先前已实现健康成人中RSV中和滴度仅增加2-4倍(Langley等人，Vaccine，27，5913，2009；Paradiso等人，Pediatric Infect Dis.，J 13，792，1994；Tristram等人，Vaccine12，551，1994)，并且pre-F DS-Cav1的免疫原性相比融合后RSV F增加约70倍被认为是2013年最重要的科学突破之一(Cohen，Science 342，1442，2013)。

如本文所公开，通过基于结构的设计的迭代循环获得了DS-Cav1的免疫原性。在每个循环中，使用原子级设计来工程化变体，表达和评估它们的抗原特性和物理特性，确定结构并测量所选变体的免疫原性，并且在信息上分析结果以提供下一循环中免疫原性优化的方向。总共采用4个基于结构的工程化循环，涉及数百个变体的设计、表达和抗原评估、6个晶体结构和14个免疫原性。所得第2代DS-Cav1抗原的抗原稳定性增加并且诱导显著更高的RSV中和活性-对于提高和扩展疫苗诱导的针对RSV介导的疾病的免疫力的重要性的成就。

结果

信息学演绎的基于结构的设计方向：设计循环1的工程化和特性.在DS-Cav1的基于结构的设计中(McLellan等人，Science，342，592，2013)，检查设计、物理和抗原特性、原子级结构、和免疫原性之间的相互作用以获得对工程化的RSV F的抗原特性和物理性质与RSV保护性应答的引发之间的关系的了解。融合前特异性位点

DS-Cav1变体经过工程化，具有与F

合成了具有各种接头的超过一打的构建体(表A)，其表达以96孔微板形式的瞬时转染形式进行测试(McLellan等人，Science，342，592，2013)。这些构建体中的五种以允许表征其抗原特性和物理特性的水平表达(图1C)。其中，sc9 DS-Cav1，包含残基105和145之间的GS连接，显示出4倍增强的表达和许多融合前特异性抗体的识别(图1C)。值得注意的是，单链变体在尺寸排阻色谱法(SEC)中显示出改变的迁移率(图1D)，并且许多显示出对物理极端的耐受性降低(图1E)。然而，sc9 DS-Cav1确实显示在70℃孵育后保留抗原位点

设计循环1的结构、免疫原性和信息学.为了评估sc9改变对DS-Cav1的影响，sc9DS-Cav1在立方pH5.5晶格中结晶。衍射数据扩展到

为了测量各种单链DS-Cav1的免疫原性，CB6F1/J小鼠通过在第0周和第3周肌肉内注射10μgRSV F和50μg聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂来进行免疫，并评估第5周血清预防HEp-2细胞的RSV感染的能力。值得注意的是，这些单链抗原引发的所有滴度均低于DS-Cav1引发的滴度。变体sc8 DS-Cav1和sc11 DS-Cav1具有特别低的免疫原性，而sc9 DS-Cav1(具有最高免疫原性的单链)的几何平均滴度是DS-Cav1的三分之一。

sc9 DS-Cav1在70℃增加的物理稳定性没有产生免疫原性的增加，可能表明在DS-Cav1和sc9 DS-Cav1之间已经改变了具有更实质的免疫原性作用的其它因素。五种特征性单链DS-Cav1构建体sc4、sc8、sc9、sc10和sc11的免疫原性在它们1)对位点

设计循环2的工程化、特性、结构、免疫原性和信息学.由于F2和F1亚基之间接头的差异似乎影响免疫原性，因此该接头进一步变化，sc9 DS-Cav1的F2α-1螺旋中的残基(图3A)也是如此。合成了45种构建体(表A)，并以96孔微板瞬时转染形式测试它们的表达(McLellan等人，Science，342，592，2013)。这些构建体中的大部分以允许表征其抗原特性和物理特性的水平表达(图3C，D)。其中，与sc9 DS-Cav1相比缺失残基104和105的sc9-10DS-Cav1具有与DS-Cav1相似的SEC洗脱体积，并且显示出对融合前四级特异性抗体AM14的提高的亲和力。尽管含有DS-Cav1稳定化突变，具有缩短的F2接头区域的构建体sc9-41和sc9-42不与融合前特异性抗体结合，表明F2-F1接头序列和长度的微妙变化可对抗原性产生实质性影响。sc9-10相比sc9对抗体AM14的提高的亲和力相似，sc9-9也是如此，但sc9-9未被选择用于进一步提高，因为它具有次优的SEC谱并且通过动态光散射(DLS)是多分散的。

为了提供原子水平的细节，使sc9-10、sc9-19和sc9-24型式的DS-Cav1结晶。衍射数据分别扩展到3.6、2.6和

如前所述，通过在第0周和第3周使CB6F1/J小鼠免疫来测量各种单链DS-Cav1分子的免疫原性。重要的是，第5周时sc9-10 DS-Cav1的滴度(几何平均值为1988)与DS-Cav1的滴度是统计学上无法区分的(图4C)。值得注意的是，信息学分析表明四级抗体亲和力与提高的免疫原性显著相关(P＝0.0083，图4D)，表明降低的原聚体柔性可能导致提高的中和滴度。对于基于结构的设计的第3个循环，通过引入原聚体间二硫键来寻求进一步降低原聚体柔性。

用于设计循环3的原聚体间稳定的第二代RSV F抗原的设计、特性、结构和免疫原性.分析sc9-10 DS-Cav1的结构，用于可能引入二硫键的原聚体间位置(图5A)。用引入的原聚体间二硫键合成17种sc9-10变体(表A)，并以96孔微板形式的瞬时转染形式测试它们的表达。这些构建体中的四个以允许在还原和非还原SDS-PAGE上表征的水平表达(图5B)；在不存在还原剂的情况下，所有这些构建体都以超过150kDa的二硫键连接的寡聚体形式跑胶而没有任何二聚体或单体群的指示，并且在还原剂的存在下，所有这三种都以约60kDa的单体跑胶。

sc9-10 DS-Cav1 A149C-Y458C构建体以1mg/L表达，N183GC-N428C变体以约0.1mg/L表达，T100C-S362C和T369C-T455C变体以过低量的表达进行表征(图5C)。sc9-10DS-Cav1 A149C-Y458C和N183GC-N428C变体均显示出增加的物理稳定性，在60℃比DS-Cav1更稳定6倍和19倍(图5D)。

sc9-10 DS-Cav1 A149C-Y458C在立方晶格中结晶。衍射数据扩展到

为了测量具有原聚体间二硫键的第二代DS-Cav1的免疫原性，如先前针对变体所述，肌肉内免疫CB6F1/J小鼠(图6B)。值得注意的是，sc9-10 DS-Cav1 A149C-Y458C和N183GC-N428C均显示出RSV中和滴度的显著增加，比DS-Cav1高3-4倍。当来自设计循环1-3的免疫原性对各种特性的累积数据在信息上分析时，四级抗体亲和力(P＝0.0016)和物理稳定性(P＝0.0037)与免疫原性显著相关(图6C)，表明适当的四级组织以及提高的物理稳定性对引发RSV中和抗体的重要性。

用于设计循环4的额外的第二代RSV F抗原的设计、特性、结构和免疫原性.具有原聚体间二硫键的DS-Cav1变体的增强的免疫原性表明，原聚体间稳定性可能是增加RSV保护性应答的引发的一般方式。然而，许多设计的原聚体间变体的低表达水平表明表达是一个障碍。对于设计循环4，将原聚体间二硫键A149C-Y458C和N183GC-N428C与可能另外稳定融合前状态或增加表达的其它突变组合(图7A)-包括由Krarup及其同事鉴定的突变N67I和S215P(Krarup等人，Nature Commun.，6，8143，2015)以及RSV的变体病毒株，包括B病毒株，例如B18537(图7B)。合成了396个构建体(表A)，并以96孔微板瞬时转染形式评估它们的抗原性和表达水平。这些构建体中的六种以允许表征其抗原特性和物理特性的水平表达(图7C)。三重突变体S46G、K465Q和S215P的存在似乎提高了表达水平。重要的是，所有这些原聚体间稳定的构建体在60℃保持增加的物理稳定性，其范围从基于A149C-Y458C的构建体的6-7倍至基于N183GC-N428C的构建体的13-19倍(图5C和7C)。

为了深入了解与S46G、K465Q和S215P突变体相关的增加的表达，测定了sc9-10A149C-Y458C S46G-K465Q-S215P-E92D的结构(图8A)。衍射数据扩展到

为了测量这些突变对具有原聚体间二硫键的这些第二代DS-Cav1的免疫原性的影响，使CB6F1/J小鼠免疫(图8B)。值得注意的是，相对于DS-Cav1，四种原聚体间二硫键连接的RSV F三聚体显示出RSV中和应答的引发增加2.5-4倍。所有增加的滴度都涉及A2病毒株中具有三重突变体S46G、K465Q和S215P的变体，而没有这些突变的两个变体显示出降低的免疫原性并且也不是A2病毒株。为了理解与免疫原性相关的因子，使用信息学方法，但是这次并入来自循环1-4的所有信息(图8C)。与使用循环1-3数据的分析类似，四级抗体亲和力(P＜0.0001)和物理稳定性(P＜0.0001)与免疫原性显著相关(图8C)，再次表明适当的四级组织和改善的物理稳定性可以导致更高的RSV中和抗体的引发。

为了进一步了解可能增加免疫原性的因素，从设计循环1至4的选择免疫组评估了对DS-Cav1以及D25和AM14抗原位点的血清反应性(图10)。值得注意的是，除sc9外，用AM14阻断使对融合前稳定的F的血清反应性降低至少三分之二，这表明大部分应答是四级特异性的。总体而言，血清反应性与免疫原性数据一致，更稳定的原聚体间连接的免疫原引发对DS-Cav1以及D25和AM14抗原位点的血清反应性增加。

讨论

通过采用基于结构的设计的迭代循环，第二代F糖蛋白免疫原被鉴定为具有原聚体间二硫键，在未感染RSV的CB6F1/J小鼠的两次免疫后诱导比DS-Cav1高达约4倍的中和活性。先前观察到这些小鼠和恒河猴的滴度是相关的(McLellan等人，Science，342，592，2013；Elicited levels ofRSV protective antibodies in CB6F1/J mice and rhesusmacaque correlated (31)(r＝0.9975，P＝0.0451)。然而，这些第二代RSV F抗原的免疫原性是否足以诱导孕妇的滴度超过在生命的前6个月内保护婴儿所需的临界64倍保护阈值，需要通过临床试验来回答。与此相关，值得注意的是，母体免疫可能不需要耐久性，仅在妊娠的最后几周需要很高的量级，并且就中和活性来说，越多越好。因此，这些第二代构建体可能延长保护期。

可以进一步优化第二代RSV F免疫原。尽管与DS-Cav1相比，这些RSV F抗原在较高温度的稳定性明显增加，但它们对于pH和重量摩尔渗透压浓度等其它物理极端不如DS-Cav1稳定。值得注意的是，物理稳定性和RSV保护性应答引发的增加之间的相关性仅在考虑到原聚体间二硫键时是显著的。这可能与由原聚体间二硫键引起的抗原稳定性的实质性增加有关。

材料和方法

蛋白质表达和纯化.使用Stratagene Quik-change程序通过位点定向诱变制备RSV F突变。通过使用293Fectin(Invitrogen)瞬时转染Expi293F细胞来表达RSV F变体。转染后5天收获细胞培养物上清液，并以10,000g离心以去除细胞碎片。将上清液无菌过滤，并通过镍和链霉素亲和层析纯化RSV F蛋白，然后进行尺寸排阻色谱法。去除镍和链霉素纯化标签用于动物免疫和结晶研究。为了去除纯化标签，在4℃用2U/mg限制级凝血酶(Novagen)消化蛋白质过夜，然后通过PBS缓冲剂中的第二轮尺寸排阻色谱法纯化。

筛选融合前稳定的RSV F构建体.融合前RSV F变体衍生自RSV F(+)Fd构建体(Leuridan等人，BMJ，340，c1626，2010)，其由RSV F残基1-513和C端T4 fibritin三聚化基序、凝血酶位点、6x His标签和StreptagII或修饰的RSV F DS-Cav1构建体组成(McLellan等人，Science，342，592，2013)。如前所述(Pancera等人，PloS one，8，e55701，2013)，使用96孔微板形式的瞬时基因表达方法来实现各种RSV F蛋白的高通量表达。简言之，在转染前24小时，将HEK 293T细胞以每毫升表达培养基(高葡萄糖DMEM，补充有10％超低IgG胎牛血清和1×非必需氨基酸)中2.5×10

RSV F抗原表征.使用fortéBio Octet Red384仪器测量RSV F T4 Fibritin三聚化去除的变体与靶向融合前形式的抗体的结合动力学(van den Berg等人，Early HumanDevelopment，87，67，2011；Young，Respiratory Medicine，96增刊B，S31，2002；Gilman等人，PLoS pathogens，11，e1005035，2015；McLellan等人，Science，340，1113，2013；McLellan等人，Nat.Struct.Mol.Biol.，17，248，2010)。所有测定均在设定为1,000rpm的搅拌下，在补充有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行，以使非特异性相互作用最小。所有溶液的最终体积为50微升/孔。在倾斜的黑色384孔板(Geiger Bio-One)中在30℃进行测定。Ni-NTA传感器尖端(ForteBio)用于加载带his标签的蛋白质300秒以进行捕获。然后将生物传感器尖端在PBS+1％BSA中平衡90秒，然后测量与溶液(0.007μM至0.5μM)中的抗原结合片段(Fab)的结合300秒；接着根据观察到的解离速率使Fab解离300秒-1200秒。通过减去在PBS+1％BSA中孵育的加载传感器记录的测量值来进行平行校正以减去系统基线漂移。使用Octet软件8.0版进行数据分析和曲线拟合。实验数据以描述1∶1相互作用的结合方程进行拟合。假设可逆结合(完全解离)的数据集的全局和局部分析使用非线性最小二乘拟合进行，允许对于每个实验中使用的所有浓度同时获得单组结合参数。

RSV F变体的物理稳定性.为了评估设计的RSV F糖蛋白在各种应力条件下的融合前构象的物理稳定性，蛋白质用各种药学上相关的应力处理，例如极端pH、高温、低和高重量摩尔渗透压浓度，以及在50μg/ml浓度的反复冷冻/融化循环。通过处理后抗原位点

在pH处理中，将RSV F糖蛋白溶液用适当的缓冲剂交换调节至pH 3.5和pH 10，并在室温孵育60分钟，随后中和至pH 7.4。通过在带有加热盖的PCR循环仪中将RSV F糖蛋白溶液在50℃和70℃孵育60分钟来进行温度处理。在重量摩尔渗透压浓度处理中，最初在PBS缓冲剂中含有137mMNaCl的RSV F糖蛋白溶液用2.5mM Tris缓冲剂(pH 7.5)稀释至10mMNaCl的重量摩尔渗透压浓度或用4.5M MgCl2调节至最终浓度3.0M MgCl2。将蛋白质溶液在室温孵育60分钟，然后通过彻底缓冲剂返回PBS缓冲剂，并浓缩至50μg/ml。通过反复在液氮中冷冻RSV F糖蛋白溶液并在37℃融化10次来进行冷冻/融化处理。10个循环的冷冻/融化处理也用于评估一些补充有5或10％甘油的RSV F变体。用PBS缓冲剂将所有RSV F糖蛋白稀释至40μg/ml，并使用Octet仪器使用上述方案测量它们结合D25 Fab的能力。物理稳定性程度报告为应力处理前后稳态D25结合水平的比率。

负染色电子显微镜.将样品吸附到新发光-放电的碳膜网格上，用缓冲剂冲洗两次，并用新制的0.75％甲酸铀酰染色。在具有2k×2k Eagle CCD相机的FEI T20显微镜上记录图像，像素尺寸为

小鼠免疫.所有动物实验均由Animal Care and Committee of the VaccineResearch Center(NIAID，NIH)根据动物草案13-454进行审查和批准，并且所有动物均按照地方、州、联邦和研究所政策在NIH中American Association for Accrediation ofLaboratory Animal Care(AAALAC)认可的机构进行饲养和照顾。将6周至12周龄称为CB6F1/J的作为BALB/cJ雌性(C)和C57BL/6J雄性(B6)(The Jackson Laboratory)之间杂交的第一杂交后代的杂交小鼠在第0周和第3周肌肉内注射RSV F免疫原。将冷冻的RSV F变体免疫原蛋白在冰上融化并与5倍w/w poly I：C(Invivogen)佐剂混合(即10μg RSV F，50μgPoly I：C每只动物每次免疫)，注射在免疫原：佐剂制备1小时内进行。没有观察到免疫的不利影响。在免疫前至少三天，以及在初次免疫后第二周、第五周和第七周采集血液。

病毒和细胞.如前所述制备和维持病毒原液(Graham等人，J.Med.Virol.，26，153，1988)。如Hotard等人(Hotard等人，Virology 434，129，2012)报道，构建表达原型亚型A(病毒株A2)F基因和Katushka荧光蛋白的重组mKate-RSV。将HEp-2细胞维持在含有10％胎牛血清的伊格尔最低必需培养基(10％EMEM)中，所述培养基补充有谷氨酰胺、青霉素和链霉素。

RSV中和测定.将血清以1∶10至1∶163840的四倍稀释液形式分配，与等体积的表达来自亚型A(病毒株A2)的原型F基因和Katushka荧光蛋白的重组mKate-呼吸道合胞病毒混合，并在37℃孵育1小时。接下来，将50μl各种血清稀释液/病毒混合物加入到HEp-2细胞中，所述HEp-2细胞以30μl MEM(最小必需培养基)中2.4×10

保护阈值计算如下：临床以15mg/kg施用帕利珠单抗(Synagis)，导致患者血清水平达到约40μg/ml的谷值。该血清浓度提供保护婴儿免受严重疾病，并保护棉鼠免受RSV感染。在上述中和测定中，40μg/ml的帕利珠单抗产生的EC

融合前稳定的RSV F蛋白的结晶和X射线数据采集.RSV F单链RSV F融合前变体的晶体通过蒸汽扩散法在20℃悬滴，通过将1μl RSV F与1μl储库溶液混合来生长。RSV F sc9DS-Cav1和sc9-24 DS-Cav1的晶体在乙酸钠pH 5.5、硫酸锂、硫酸镁、Peg 400条件生长。确切地说，sc9 DS-Cav1晶体在0.1M NaOAc-乙酸pH 5.5、1.09M Li

融合前稳定的RSV F的结构测定、精修和分析.使用HKL2000套件对X射线衍射数据进行整合和归并(Otwinowski和Minor，Methods Enzymol.(Academic Press，1997)，第276卷，第307-326页)，并使用RSV F DS-Cav1结构(PDB ID：4MMU(McLellan等人，Science，342，592，2013))作为搜索模型，通过PHASER(McCoy等人，J.Appl.Crystallogr，40，658，2007)获得分子置换溶液。使用COOT(Emsley等人，Acta crystall.D，Biol.Crystall.，66，486，2010年4月)进行手动模型构建，并且在PHENIX(Adams等人，Acta crystall.D，Biol.Crystal.，66，213，2010)中进行精修。最终数据收集和精修统计数据显示在图12中。使用显示高水平的结构相似性的残基225-455进行RSV F结构的叠加。抗原位点

免疫原性与不同特性的相关性.使用斯皮尔曼相关性测量免疫原性与以下特性之间的相关性：洗脱体积、表达产量、针对位点

血清抗原性分析.使用fortebio Octet HTX仪器评估来自迭代优化循环的免疫组子集的小鼠血清在抗原位点

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实施例2

对象的免疫

该实施例描述了用公开的免疫原使对象(例如人或非人灵长类动物)免疫和测量相应免疫应答的示例性程序。

在一些实例中，可以将编码公开的重组RSV F胞外域三聚体(例如RSV A2病毒株sc9-10、DS-Cav1、A149C-Y458C、SEQ ID NO：1)的核酸分子克隆到表达载体CMV/R中。然后使用293Fectin(Invitrogen，Carlsbad，CA)将表达载体转染到293F细胞中。转染后7天，收获细胞培养上清液并通过抗体亲和柱。用PBS洗涤后，用3M MgCl

对于用公开的免疫原疫苗接种，用polyIC-LC作为佐剂使对象免疫。每组中的五名对象例如在第0周、第4周、第20周在四头肌中肌肉内疫苗接种1ml的100μg蛋白质和500μgpolyIC-LC。例如在第2周(Post-1)、第6周(Post-2)、第24周(Post-3)收集血清，随后分析它们对一组RSV病毒株的中和活性，以及介导中和作用的抗体谱。

实施例3

在不存在S155C/S290C取代的情况下，RSV F在融合前构象中的稳定化

该实施例提供RSV F蛋白的若干实施方案的抗原性数据，所述RSV F蛋白在不存在“DS”突变(包括S155C和S290C取代)的情况下在融合前构象中稳定。产生可溶性RSV F胞外域三聚体，其中亚基与sc9-10突变共价融合(将残基103-145与GS接头连接)，融合前构象通过Cav1取代和由以下之一的半胱氨酸取代引入的原聚体间二硫键稳定：98C-360C、99C-360C、100C-360C、98C-361C、99C-361C、100C-361C、98C-362C、99C-362C、100C-362C、146C-458C、369C-455C、149C-458C或183GC-428C，还包括C端折叠子三聚化结构域。如上所述表达和纯化蛋白质，并在评估与融合前特异性抗体D25、AM14和MPE8以及莫他珠单抗抗体的结合之前，在4℃孵育一周。如图14所示，在测试的构建体中，sc9-10、Cav1、99-361构建体保持最佳抗原谱。

实施例4

在哺乳动物中诱导免疫应答

牛呼吸道合胞病毒是小牛呼吸道疾病的主要原因，与人类RSV密切相关。该实施例提供了显示使用工程化型式的牛呼吸道合胞病毒F在小鼠中成功诱导中和免疫应答的数据，所述工程化型式的牛呼吸道合胞病毒F的亚基共价融合，融合肽被去除，并且通过空腔填充突变以及原聚体内和原聚体间二硫键稳定融合前构象。工程化的牛RSV F蛋白通过融合前特异性抗体AM14、D25和MPE8识别，并引发牛呼吸道合胞病毒中和滴度，其比融合后F引发的滴度高＞100倍。

如上所述，用单链突变(sc9或sc9-10)和各种融合前稳定突变(包括DS-Cav1、Q98C-Q361C和A149C-Y458C)修饰来自RSV的牛病毒株的F蛋白。设计了许多变体，并且在96孔微板瞬时转染形式中评估了它们的抗原性和表达水平。评估新构建体的抗原特性和物理特性(参见下表)，并选择数种用于哺乳动物的免疫测定。

列出了通过凝胶过滤纯化的三聚体级分的特性

a

b

c

d

e

f

为了评估免疫原性，使用DS2-v1、DS2-v33和DS2-v35构建体和数种对照来使一组10只CB6F1/J小鼠免疫。每种免疫原剂量包含10μg用50μg聚肌苷酸：聚胞苷酸(Poly I∶C)佐剂化的蛋白质。小鼠分别在第0周和第3周肌肉内注射初免和加强。对第5周血清的分析显示，对于pre-F免疫原免疫的小鼠，几何平均倒数EC50中和滴度为6880-11，453，其比post-F免疫原免疫的小鼠所观察到的滴度(几何平均值100-210)高出33至55倍(P＜0.0001)(图15A)。由pre-F免疫小鼠引发的中和滴度比校准的保护滴度100大82-110倍(参见McLellan，J.S.等人Science 342，592-598，2013)。为了测量每种免疫原的总体免疫原性，通过ELISA评估对pre-F和post-F免疫原的血清结合应答(图15B)。与中和结果类似，pre-F引发的血清与六种pre-F免疫原的结合滴度在统计学上彼此相当，几何平均终点-结合滴度范围为4687至100,323。

明显的是，在不脱离所述实施方案的精神的情况下，可以改变或修改所描述的方法或组合物的精确细节。我们要求保护属于以下权利要求的范围和精神内的所有这些修改和变化。