一种核酸提取系统和方法及应用

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，尤其涉及核酸的快速提取和/或免纯化提取领域，具体为一种核酸提取系统和方法及应用。

背景技术

核酸提取在医疗、科研、农业、生物科技等领域有着极为重要的应用价值。在人类、动植物细胞以及细菌、病毒等物种中，包括DNA、RNA在内的核酸物质普遍处于被各种生物膜、壁组织以及蛋白质的包裹、保护或者附着的状态中，需要从这种被束缚的状态中释放和提取出来才能用于后续的针对遗传物质的分析、检测和制备，从而实现多种多样的实际应用。常见的应用实例包括：从人体细胞中提取的DNA/RNA用于检测潜在的基因突变或者对癌症患者进行基因分型和用药指导；在转基因农作物产品的开发中对植物细胞的DNA进行提取来分析基因转入的成败及效率；对口鼻中收集的拭子样品进行核酸提取和分析来判断是否感染了流感以及其它引起呼吸道疾病的病毒；对食品表面收集的样品进行核酸提取和检测来判断被细菌污染的程度和细菌种类，等等。

核酸提取通常可以简单的分为裂解和纯化两个部分。裂解是利用表面活性剂和蛋白变性剂等成分将细胞膜结构破坏并使与核酸结合的蛋白质变性脱落，从而实现核酸的释放。早期的核酸纯化方法包括氯仿抽提法，利用氯仿将裂解体系中的蛋白质反复抽提出来从而实现蛋白和核酸的分离。但这种方法需要用到有毒试剂，并且需要反复多次操作，操作时间长、效率低，无法实现高通量提取。

目前最常用的核酸提取技术依赖于固体吸附以及相应的商业化的试剂盒核酸提取系统。细胞或者细菌、病毒首先被裂解液破碎并将核酸释放出来，带负电的核酸被具有特定性质的固相介质表面所吸附；接着通过多次清洗将其它杂质去除，最后用洗脱液将吸附的核酸洗脱下来得到提纯的核酸。根据固相介质的形态，这类提取技术又可分为离心柱法和磁珠法。离心柱法将吸附材料做成膜的形态装在离心柱里，利用离心力让裂解产物通过膜来实现核酸的吸附以及后续的清洗和洗脱。磁珠法是将能够吸附核酸的磁性粒子加入裂解产物，然后利用磁力将磁珠连带吸附的核酸与其它杂质分离并进行清洗和洗脱。相对于离心柱法，磁珠法在实施手段上更灵活，可以实现较大批量样品的同时处理和自动化提取。两种方法的共同问题在于需使用特殊固体介质，试剂耗材价格较高；同时需进行多步吸附、清洗和洗脱操作，费时费力。若想实现基于磁珠的自动化提取又需要购买昂贵的专用仪器，不适合在小型医疗、研究机构或企业，乃至社区和家庭应用和普及。

为了解决目前核酸提取的时间和经济成本较高的问题，一个常见思路是将核酸裂解、释放出来之后跳过费时费力的纯化步骤，直接用于后续的核酸分析与应用。这种策略通常被称为核酸快提或者免提。其优势是省去了常规核酸提取中最耗费时间、人力和经济成本的环节，同时因为其步骤简单，往往不需要特殊仪器就能实现高通量大批量样品处理，这些都大大降低了成本，提高了效率，以及增加了相关核酸应用的适用范围。

实现核酸快提或者免提的关键是裂解步骤所使用的试剂和操作不会影响后续应用中对所提核酸的分析、检测和利用。常见的后续反应比如PCR(聚合酶链式反应)和RNA的逆转录等分子生物学反应高度依赖于多种酶的正常功能。作为一类蛋白质，这些酶容易受到各种抑制剂、蛋白变性剂、或者其它蛋白降解酶的影响，导致活性被抑制、结构改变甚至氨基酸链断裂而失去活性。因此核酸快提的产物需要严格避免此类杂质。有鉴于此，常用的核酸快提裂解液的主要成分通常是温和的非离子表面活性剂，例如Triton X-100，Tween-20，NP-40(IGEPAL CA-630)等[Ho YK,Xu WT,Too HP.Direct quantification of mRNAand miRNA from cell lysates using reverse transcription real time PCR:amultidimensional analysis of the performance of reagents and workflows.PLoSOne.2013Sep 5；8(9):e72463.doi:10.1371/journal.pone.0072463.]。这类表面活性剂可以破坏细胞膜的结构但不会影响大多数蛋白质的结构和功能，实现基本的细胞和细菌的裂解。其它被报道的用于快提的裂解成分还包括牛血清蛋白(BSA)等[Svec D,Andersson D,Pekny M,

由此可见，目前市面上的核酸提取方法无法兼顾成功率、高效、安全、低成本的需求，急需一种适用范围广、环境依赖程度低、安全、高效、简单、低成本、高成功率的核酸提取方法。

发明内容

为了解决上述问题至少之一，本发明提供一种核酸提取系统和方法及应用，上述的一种核酸提取系统，包括：

裂解液系统，所述裂解液系统包含：a)缓冲液或纯水；b)SDS(sodium dodecylsulfate，十二烷基硫酸钠)；以及c)还原剂；

中和系统，包含中和试剂，用于中和所述裂解液系统中的SDS。

上述核酸提取系统中，所述中和试剂选自钾盐类化合物，所述钾盐类化合物为氯化钾、硫酸钾、醋酸钾、硝酸钾的一种或其组合；

所述缓冲液选自Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，HEPES，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)的一种或其组合，且所述缓冲液的pH呈弱酸性或弱碱性；

所述SDS的质量/体积比值为0.01％-10％；

所述还原剂选自TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羧乙基)膦)及其衍生物的一种或者其组合。

上述核酸提取系统中，所述中和试剂为氯化钾试剂，且中和浓度范围为1-1000mM；所述还原剂为TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羧乙基)膦)及其衍生物中的一种或组合，且浓度范围为0.1-500mM。

上述核酸提取系统中，所述裂解液系统与所述中和系统分别独立装配。

另一方面，本发明还涉及一种核酸提取的方法，使用上述的核酸提取系统，且包括将待提取样品与裂解液系统及中和系统混合步骤。

上述方法中，所述混合步骤还进一步包括：

步骤1：将裂解液系统与待提取样品充分混匀，室温孵育；

步骤2：将经过步骤1孵育后的样品与中和系统充分混匀后静置；

步骤3：将经过步骤2静置后的样品进行离心，或等待沉淀自然沉降，或通过过滤，得到的上清液中包含已提取的DNA和/或RNA，可直接用于后续核酸相关反应；

上述方法中，当需要不包含DNA的RNA产物时，还包括步骤4：DNA降解，所述步骤4进一步包含：

步骤4.1：上清液中加入DNA降解酶，混匀孵育；

步骤4.2：溶液加热至95摄氏度孵育以灭活DNA降解酶，得到的溶液可直接用于后续RNA反应。

上述方法中，所述DNA降解酶为DNase I，加热至95摄氏度后孵育时间为1分钟。

上述方法中，其特征在于，所述待提取样品选自血液细胞，实验室培养的细胞，血浆血清，体液，器官、组织中的细胞，各种拭子收集的样品，细菌样品，病毒样品，真菌样品，植物样品的一种或其组合；所述步骤1中的室温孵育时间为20分钟及以下；所述步骤2中的静置方式为室温静置或冰上静置，所述室温静置时间为40分钟及以下，所述冰上静置时间为30分钟及以下；所述步骤3中的瞬时离心的离心力至少为100x g，离心时间为5秒及以上。

本发明还涉及将上述核酸提取系统用于核酸的快速提取和/或免纯化提取。

本发明的优点和有益效果在于：

①本发明所涉及的核酸提取方法及提取系统采用了无毒体系，区别于传统氯仿等有毒体系，更为安全；

②区别于传统的氯仿抽提法需要反复多次操作，或离心柱法和磁珠法需要使用特殊固体介质造成的高成本、低效率、要求高等缺点，本发明采用的新型快提技术及提取系统，达到了适用范围广、简单高效、提取成本低的目的；

③同时，为了解决目前传统快速提取和/或免纯化提取的缺陷，本发明采取了裂解时使用强力蛋白变性剂，并在裂解后将其简单快速地除去的新思路，解决了目前已有的快提或免提方法中因需要严格避免杂质采用传统温和表面活性剂造成的成功率低、操作复杂、条件要求高等问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是几种常见蛋白还原剂的分子结构示意图；

图2是本发明实施例中核酸提取方法中样品离心前后的对比示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

为了解决目前核酸快提的问题，本发明提出了一个完全不同的策略：在裂解液里就使用强力的蛋白变性剂，然后在裂解完成后简便快速的将这些试剂中和或者除去使其不影响后续的应用。这样当裂解时，样品中的蛋白质(包括核酸降解酶等)在与裂解液接触的瞬间就被抑制或者破坏，使核酸得到最大限度的保护和释放；同时变性剂被快速中和或者清除后，又不会影响后续针对核酸的应用。因为其挑战性，PBMC(外周血单个核细胞)中RNA的提取被作为一个模型系统来演示核酸快提的效果。PBMC是血液免疫细胞的一个重要组成部分，主要包括淋巴细胞(T细胞，B细胞，NK细胞)和单核细胞(Monocytes)。PBMC常被用于免疫学和免疫疾病相关的研究，也被广泛用于传染病，血液病，疫苗开发等方面的研究和应用。然而PBMC细胞中RNA的快提/免提极具挑战性，目前提取主要还是基于商业化的核酸提取试剂盒，文献中或市场上都未见用于PBMC的核酸快提的报道或产品例子。这很可能是多方面的原因。首先PBMC的组成较复杂，含有多种不同功能的免疫相关细胞；并且多种免疫细胞中核糖核酸酶(RNases，RNA降解酶)的浓度较高、活性较强，这是免疫系统用来抵御入侵的RNA病毒的重要机制。因此PBMC的快提过程中本就容易降解的RNA还极易受到核糖核酸酶的攻击和降解，使得快提效率极低或完全失败。而蛋白变性剂则有可能解决快提中核糖核酸酶活性的问题。

用在常规核酸提取中的蛋白变性剂通常是一类叫做离散剂(Chaotropic agents)的分子。它们能够破坏蛋白质中赖以维持正常结构和功能的非共价作用力(包括氢键、范德华力和疏水效应等)，从而使蛋白质失去功能与活性。代表性的离散剂包括盐酸胍(Guanidine hydrochloride)和尿素等。其中盐酸胍是商业上最常用的核酸提取裂解成分之一。然而它起效需要的浓度相当高，达到6-8mol/L，同时也没有明显及有效的中和剂，因此难以作为核酸快提的主要成分。

根据本发明的快提策略筛选得到符合要求的蛋白变性剂包括SDS(Sodiumdodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)，因其拥有简单的中和试剂。SDS是一种常用的表面活性剂，同时也是一种强力的蛋白变性剂。它能与蛋白质结合并破坏其三维结构使其成为舒展的长链，从而完全抑制其功能与活性。SDS常被用来制作SDS-PAGE胶用于蛋白质的凝胶电泳分析。当SDS遇到钾盐时会形成不溶的PDS沉淀(Potassium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钾)。基于这一原理，SDS也被用于DNA质粒制备中使蛋白质与DNA分离。由此可以推测，当用于核酸快提时，这种沉淀将能有效清除快提产物中的SDS，使其不影响后续反应中起关键作用的各种酶。

本发明人首先测试了SDS用于核酸快提的可能性：用SDS作为裂解液成分处理外周血PBMC细胞，然后用钾盐将SDS沉淀并分离，得到的细胞提取产物进行了靶标RNA的检测。然而试验并没有有效的检测到靶标RNA。推测可能的原因包括：1)细胞中链式结构的天然RNA和DNA与人工制备的环状的质粒DNA有较大区别，比如稳定性较差等，造成了提取结果的差异；2)SDS的基于破坏非共价作用力的蛋白变性是可逆的，当变性剂消失后蛋白可以恢复原状，因此虽然SDS沉淀能带走很多与SDS结合的蛋白，但也有可能使得部分蛋白比如核酸降解酶从SDS释放出来并重新恢复了原有的结构和功能，造成了RNA被降解。解决这些问题的办法是在SDS蛋白变性的基础上对蛋白质进行不可逆的破坏，从而实现对DNA/RNA的彻底释放和保护。

接下来的研究了将PBMC细胞用同时含有SDS和蛋白酶K的裂解液进行处理，利用蛋白酶K不可逆降解已变性的蛋白质，接着将SDS进行沉淀分离以及将蛋白酶K进行高温灭活。这样得到的快提产物中有效的检测到了靶标RNA。这个实验证实了可逆的蛋白质变性是上述提取问题的主要原因，而有效的核酸快提可能需要不可逆的蛋白破坏。然而基于蛋白酶K的蛋白质降解依然存在着之前提到的温度高、时间长、步骤多的问题，难以成为理想的简便、快速、高效、适合于广泛普及的核酸快提/免提方法。

为了解决上述问题，本发明人还研究了其它不可逆破坏蛋白的方法，其中就包括利用还原剂进行蛋白质破坏。蛋白质除了使用非共价作用力如氢键等维持其正确的三维构型和折叠外，还利用共价作用力如双硫键-S-S-。当两个半胱氨酸(Cysteine)在空间上邻近时，可以由各自所含的巯基-SH互相连接形成双硫键来固定其空间结构。高效的RNA降解酶RNase A(核糖核酸酶A)就是通过多个双硫键形成异常稳定的结构，即使经过长时间煮沸也不会失去活性。而使用还原剂则可以将双硫键打开使其回到巯基状态，从而破坏相应的空间构型和活性。常用的蛋白还原试剂包括2-巯基乙醇(BME)，二硫苏糖醇(DTT)和三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)，主要被用来防止蛋白质的氧化。虽然三者都能被用来破坏双硫键，但它们各自具有不同的性质，例如BME还原能力最小且具有一定的毒性；DTT稳定性最差，还原能力较强但对蛋白的还原是可逆的，并且还具有较强的硫化物的气味。与这两者相比较，TCEP拥有诸多优势，包括还原性最强且还原不可逆；在较大温度和溶液pH范围内保持活性，常温下即可起作用；非常稳定，可长期储存；无色无味等等。

鉴于上述比较，本发明最优方案中最终选择了TCEP与SDS搭配组成全新的裂解液配方。PBMC经过此裂解液常温处理后，加入钾盐将SDS完全沉淀，简单离心后得到的核酸快提产物直接加入到RT-qPCR反应中对目标RNA进行检测，得到了媲美甚至超过使用商业化核酸提取试剂盒核酸提取系统的结果。这个结果证实了SDS-TCEP-钾盐构建的新型核酸快提体系能实现复杂样品的简便快速高效的核酸提取。同时本发明也发现这个独特的组合三者缺一不可。由于文献中大量报导了TCEP强大的还原能力，本发明人测试了仅用TCEP能不能实现核酸快提，其它成分仅包括Triton X-100用于破坏细胞膜使TCEP充分接触膜内分子。实验的结果显示仅用TCEP基本上未能检测到目标RNA，说明核酸提取量极低。本发明人认为一个合理的解释是文献中对TCEP还原力的测试多是基于简短的多肽链(peptides)的模型，其双硫键完全暴露在表面易与TCEP接触和反应。而蛋白质由于结构更复杂且双硫键经常埋藏在其三维结构内部，造成TCEP难以接触和反应。根据文献中的报道，TCEP及其衍生物对简单多肽的还原能力显著高于DTT而对蛋白质的还原能力却远低于DTT，其原因很可能是TCEP分子量更大，空间位阻也更大(图1)，极大的影响了它与蛋白质中的双硫键接触的能力[Cline DJ,Redding SE,Brohawn SG,Psathas JN,Schneider JP,Thorpe C.New water-soluble phosphines as reductants of peptide and protein disulfide bonds:reactivity and membrane permeability.Biochemistry.2004Dec 7；43(48):15195-203.Doi:10.1021/bi048329a.]。而SDS的作用正是打破蛋白质的三维结构，将所有双硫键暴露出来与TCEP充分接触和反应。这也解释了在除去SDS的快提产物中依然存在的TCEP为什么没有破坏后续PCR反应中的酶，这是由于缺少了SDS的TCEP对蛋白质的还原效率变得非常低。TCEP的这种特有的性质反而使得它非常独特的适合本发明提出的核酸快提体系：在蛋白变性剂存在时提供高效的蛋白还原破坏能力，而在除去蛋白变性剂的同时也丧失了绝大部分蛋白还原能力；在无需另外专门除去蛋白还原剂的情况下即可大大降低对后续反应的影响。作为总结，SDS与TCEP或其衍生物的组合在核酸快提中提供了非常高效的不可逆的蛋白破坏能力，而钾盐的加入又同时消除了SDS和TCEP对后续反应的影响，形成了一个非常独特又高度自洽，可用于复杂生物样品的优异的核酸快提系统。同时整个提取过程可在单管、室温、短时间内及低成本下完成，既可以自成一体，也很容易接入现有核酸分析系统，非常适合高通量、自动化以及大范围推广。

由此完成了本发明，详见下文实施例。

核酸提取系统

本发明记载了一种用于提取核酸的核酸提取系统，包括三个关键组分。

该核酸提取系统包含裂解液系统以及中和系统，中和系统包含中和试剂，用于中和裂解液系统中的SDS，裂解液系统包含：

a)缓冲液，缓冲液可为Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，HEPES，MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)，Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)的一种或者几种的混合物，也可以为纯水，且最终缓冲液系统的pH呈弱酸性或弱碱性，pH范围可以为5-9，优选为pH6-8；

b)关键组分一：SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基硫酸钠，也称为SodiumLauryl Sulfate)，SDS最终浓度范围为0.01％-10％(w/v，质量/体积)；

c)关键组分二：还原剂，所述还原剂选自TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羧乙基)膦)及其衍生物的一种或多种的组合，优选的最终浓度范围0.1-500mM(豪摩尔浓度)。同时，如图1给出了几种常见的蛋白还原剂的分子结构示意图。

d)关键组分三：中和试剂，为钾盐类化合物，如氯化钾、硫酸钾、醋酸钾、硝酸钾的一种或者几种的混合物，优选地选择氯化钾，且最终中和反应浓度范围为1-1000mM。

在实物产品中，本发明所述的核酸提取系统的裂解液系统与中和系统分别独立装配，还可附有使用说明书。

核酸提取的方法

相应地，本发明提供一种快速简易的核酸提取的方法，此方法会用到上文所记载的用于提取核酸的核酸提取系统，在一种实施例中可参见以下步骤：

步骤1：将裂解液系统加入待提取样品中，待提取样品选自血液细胞，实验室培养的细胞，血浆血清，体液，器官、组织中的细胞，各种拭子收集的样品，细菌样品，病毒样品，真菌样品，植物样品的一种或组合物，并充分混匀，室温孵育20分钟以下，优选为1-20分钟；

步骤2：将中和试剂加入经过步骤1孵育后的样品，充分混匀后静置，可选择室温静置或冰上静置，室温静置时间为40分钟以下，优选为5-40分钟，冰上静置时间为30分钟以下，优选为2-30分钟，通常为10分钟；

步骤3：将经过步骤2静置后的样品进行离心，优选瞬时离心(离心力至少为100xg，离心时间为5秒或以上)，或等待沉淀自然沉降，或使用过滤装置进行过滤，得到的上清液中包含已提取的DNA/RNA，可直接用于后续核酸相关反应。

如图2所示，图2左边为PBMC细胞中加入裂解液混匀后的状态图；右边为裂解产物加入中和液混匀离心后的状态图。可见加入中和液后沉淀产生，同时由于表面活性剂SDS被沉淀，溶液中的泡沫也消失。

如果最终需要不包含DNA的RNA产物，则需加上DNA降解步骤4，步骤4包含：

步骤4.1：上清液中加入DNA降解酶，优选为DNase I，混匀孵育；

步骤4.2：溶液加热至95摄氏度孵育1分钟以灭活DNA降解酶，得到的溶液可直接用于后续RNA反应。

本发明可适用于各种情况下的核酸快提，例如血液细胞；实验室培养的细胞；血浆血清、唾液、尿液等体液及分泌物；器官、组织中的细胞；各种拭子收集的样品；细菌样品；真菌以及植物样品；等等。本发明的广泛使用场景举例如下：医院及实验室小批量样品的快速处理和核酸提取；医疗与检测机构大批量样品的自动化核酸提取，适用于96孔板甚至384孔板上样品的同时处理；整合进入现有系统和体系比如微流控装置中，为其在常温常压下提供样品中的核酸；在社区及家庭自检产品中提供简便快速的核酸提取；在田间、野外、战场等环境里提供方便实用的核酸快提等等。

应用

在一种实施例中，上文所记载的核酸提取系统、核酸提取的方法可应用于快速提取和/或免纯化提取等技术领域。

下文将结合试验说明具体实施例实施过程。

实施例1

三个关键组分

本发明用实验验证了SDS，TCEP，氯化钾作为钾盐这三个组分的关键性。在这个实验中每次去掉三个组分中的一个(实验方案3中，用0.5％ TritonX-100代替SDS的表面活性剂作用用于裂解细胞)，然后测试能否实现PBMC细胞的有效核酸提取并检测到目标RNA。实验方案如下：

表1：各组实验方案的试剂组成表

具体做法如下，往200μL血液中提取的PBMC细胞中，加入50μL裂解液(10mM Tris-HCl缓冲液pH7.5，含SDS 0.5％或者0，TCEP 5mM或者0，Triton X-100 0.5％或者0，见上表)，搅拌混匀至细胞团块消失，室温放置约10分钟。加入适量裂解中和液(2M KCl)至KCl最终浓度为60mM或者0(见上表)，搅拌混匀，静置于冰上或4摄氏度15分钟，500x g离心力以上离心5秒或更长，收集上清液作为最终核酸提取产物，如图2右图所示。

最终快提产物取2μL加入18μL双重RT-qPCR反应液中同时检测IRF1和HPRT1两个基因的mRNA表达产物。RT-qPCR反应液组成如下：

表2：RT-qPCR反应液组成成分表

靶标序列的扩增和检测在一台罗氏LightCycler 480II荧光定量PCR仪上完成，所使用的PCR程序为：55℃，10分钟；95℃，1分钟；45个循环的95°C，5秒钟和60℃，10秒钟。扩增完成后，仪器根据扩增曲线自动判定扩增反应的Ct值，结果如下表：

表3：扩增结果CT值

Ct值越小表示检测到的目标RNA越多，没有Ct值则表示未检测到目标。对四个实验结果的分析解释如下：

1)实验1未使用钾盐将SDS沉淀分离，SDS被带入RT-qPCR反应中，它的强变性作用使得反应中的酶失去活性，所以未能检测到目标RNA。

2)实验2未使用TCEP不可逆的破坏核酸降解酶，导致SDS被钾盐沉淀分离后核酸酶恢复活性并将核酸降解，造成检测失败。

3)实验3未使用SDS将蛋白质变性帮助TCEP进行不可逆还原，造成核酸酶未被显著破坏，测得的Ct高达40，相当于未能测到。

4)实验4在三组分都存在的情况下，实现了PBMC细胞中蛋白质的显著破坏和核酸的大量释放，以及SDS的中和与消除，最后测得的Ct相当于使用商业提取试剂盒的核酸提取系统的结果。

实施例2：

钾盐的选择

常用的钾盐包括氯化钾(KCl)，硫酸钾(K

所得到的上清液进行了IRF1和HPRT1两个基因的mRNA表达产物的检测(试剂、操作同实施例1)，Ct结果如下表：

表4：mRNA表达产物检测CT值结果

由表4可见，磷酸氢钾未能测到目标RNA，很有可能是它与PCR反应液中的镁离子形成了磷酸镁沉淀造成PCR扩增失败。四种钾盐中氯化钾的效果最好，硫酸钾其次。实际上，KCl是生物分子反应中常用的一个成分，与镁离子一样具有稳定核酸分子间识别与结合的能力。因此，快提产物中的KCl对后续反应的影响可能最小甚至有一定帮助。从实验的结果看，其它钾盐如硫酸钾和醋酸钾也可用于SDS去除，但核酸检测效果不如氯化钾，说明它们对后续反应可能也有一定影响。

实施例3：

与离心柱吸附的商业试剂盒中的核酸提取系统的比较

为了验证核酸快提的提取效率，本发明的方法和多个商业试剂盒的核酸提取系统进行了比较：

1.首先比较的是基于离心柱吸附的商业试剂盒(Direct-zol Miniprep Plus试剂盒，Zymo Research Corp.)对PBMC细胞RNA提取效果。

将PBMC样品分为细胞数目大致相等的两份，一份用于试剂盒提取，按试剂盒附带说明操作；一份用于本发明的快提提取(同实施例1方案4)。

最后的提取产物都稀释到同样的体积，从中取出2μL最终产物加入18μL双重RT-qPCR反应液中检测IRF1和HPRT1两个基因的mRNA表达产物(试剂、操作同实施例1)。下表列出了多个PBMC细胞样品的比较结果，用Ct值衡量检测到的目标RNA的量：

表5：PBMC细胞样品的CT值比较结果

由表5可见，本发明快提的Ct值普遍比试剂盒低差不多2甚至更多，最多低了6左右，这意味着本发明快提方法提取到的目标RNA普遍是试剂盒的2^2＝4倍，最高甚至到2^6＝64倍。本发明快提的高效率可能是由于整个操作在单管内完成，核酸没有流失到溶液以外造成额外损失。而在商业试剂盒提取中，样品经过多步处理，在多个容器和固体表面之间转移尤其是核酸要吸附在离心柱上经过反复清洗和洗脱的步骤，每一步都可能造成损失，最后叠加起来造成了显著的损失。因此，本发明的核酸快提在更简便，更快，更经济的基础上还能实现更高效的核酸提取。

实施例4：

与商业化的核酸快提试剂盒的核酸提取系统比较

目前已有多个跨国公司的核酸快提试剂盒在市场上销售，包括Qiagen(凯杰)的FastLane试剂盒，ThermoFisher(赛默飞)的Cells-to-Ct试剂盒，Bio-Rad(伯乐)的SingleShot试剂盒，NEB的

以Qiagen的FastLane试剂盒作为代表与本发明快提方法进行了比较。同样数目的PBMC细胞用两种方法各自进行了快提。Qiagen的FastLane试剂盒按其说明书要求进行，本发明的快提方法参照实施例3。

得到的产物用双重RT-qPCR来检测IRF1和HPRT1两个基因的mRNA表达产物(试剂、操作同实施例1)，结果如下：

表6：mRNA表达产物CT值比较结果

由表6可见，本发明提出的快提方法检测到了正常的基因表达Ct值，而凯杰的试剂盒未能测到足够信号(Ct值40相当于未能测到)。值得注意的是，所有这些市面上在售的快提试剂盒都明确提到产品适用于培养的细胞而未提到其它细胞种类或生物样本。因此很可能这些试剂盒只能用于相对单一组成的细胞样品如实验室培养细胞，而对成分复杂且酶活性高的外周血PBMC细胞则无能为力。因此这类试剂盒更接近于比较温和的快提试剂。而本发明提出的快提方法则可轻松应对更加复杂、挑战性更高的生物样品。

实施例5：

DNA的提取

RNA的提取通常比DNA更困难，这是由于RNA的稳定性比DNA差很多，容易受到多种因素的影响而降解，包括温度、酸碱度、酶活性等等。因此本发明主要利用更具挑战性的PBMC细胞中RNA的提取来演示核酸快提的效果，但这并不代表DNA没有被同时提取出来。为了演示本发明的快提方法对DNA同样适用，在PBMC的核酸快提产物中进行了DNA的检测。所选取的目标序列位于常用的内参基因GAPDH的启动子区域。在基因组中，启动子位于基因的上游，在基因被转录为RNA的过程中启动子一般不会被转录为RNA；同时在PCR反应中未加入逆转录酶，进一步保证检测到的是DNA而不是RNA。

具体步骤，PBMC细胞经过核酸快提得到快提产物(同实施例1方案4)，取2μL(含约5000个PBMC细胞的核酸)加入到18μL的PCR反应液中。反应液组成如下表：

表7：反应液组成成分表

靶标序列的扩增和检测在一台罗氏LightCycler 480II荧光定量PCR仪上完成，所使用的PCR程序为：95℃，1分钟；45个循环的95℃，5秒钟和60℃，10秒钟。扩增完成后，仪器根据扩增曲线自动判定扩增反应的Ct值，得到多个重复的平均Ct值为27.4，大致符合5000个基因拷贝的预期结果。实验证明了核酸快提产物中也包含了DNA并且DNA得到了充分的提取。

实施例6：

咽拭子采集物的快提用于新冠假病毒的检测

为了显示本发明核酸快提方法在其它领域和样品种类中的应用，以新冠病毒为例演示了引起呼吸道疾病的病毒的快速核酸提取与检测。

购买的商业化的新冠假病毒及新冠病毒检测试剂盒如下：

假病毒：COVID-19-pseudovirus(2019-nCoV假病毒)，货号：

11900ES03，翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

新冠病毒检测试剂盒：新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，货号：ZC-HX-201-2，上海伯杰医疗科技股份有限公司。

核酸快提步骤参见实施例1的方案4，具体方法如下：用咽拭子采集了口腔样品后直接将拭子放入100μL含SDS和TCEP的裂解液(10mM Tris-HCl缓冲液pH7.5，含0.5％ SDS，5mM TCEP)，同时加入约一百万新冠假病毒，用来模拟真实世界从口腔采集到的新冠病毒。搅拌混匀室温孵育10分钟后进行氯化钾(加KCl至最终浓度50mM)中和及沉淀分离，取1μL上清液使用新冠病毒检测试剂盒并按其说明书进行检测(每个反应约含1万个假病毒)。

作为比较，也使用了商业的核酸提取试剂盒(凯杰Qiagen，RNeasy试剂盒)，以及温和的核酸快提法(仅用TritonX-100裂解)进行了同样的采样和提取。RNeasy试剂盒的提取方法按照其试剂盒的说明书进行。温和的核酸快提法(仅用TritonX-100裂解)的具体方法是：已取样的咽拭子及约一百万假病毒加入100μL裂解液(10mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5，含1％ TritonX-100)，充分涡旋混匀约五分钟，于10000x g离心力离心1分钟，收集上清液作为核酸提取产物，取1μL上清液进行检测(每个反应约含1万个假病毒)。

三种提取方法得到的Ct结果如下表：

表8：三种提取方法Ct结果对比表

由表8可见，本发明核酸快提法在操作步骤大为简化的情况下取得了与需要多步骤长时间的商业化试剂盒的核酸提取系统接近甚至某些方面更好的结果。同时温和的快提方法由于没有从根本上解决蛋白质对核酸的影响，检测到的靶标大大减少，难以用于有效可靠的病毒检测。

这个例子展示了本发明快提方法用于临床诊断的巨大前景。呼吸道疾病的分子检测是核酸提取的典型应用场景。当使用本专利的快提技术时，病人咽拭子取样后，拭子可当场放入含有裂解液的试管中混匀静置几分钟，此时病毒及其蛋白被快速的变性和灭活，同时核酸被释放出来并可在裂解液中长时间储存而不用担心被核酸酶降解。当需要检测时，只需加入中和试剂静置十几分钟后，即可得到可直接用于核酸检测的提取产物，无需再采用额外的提取步骤，大大简化了核酸提取和提高了核酸检测的整体效率。

对所公开的实施例的上述说明，以便本技术领域的专业技术人员能够实现或使用本申请。针对这些实施例的多种修改，对本技术领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。