一种缓解细胞双酚A毒性的方法

技术领域

本发明属于动物生殖系统毒性领域，尤其涉及雷帕霉素在缓解睾丸细胞双酚A损伤方面的应用。

背景技术

双酚A(Bisphenol A,BPA)，作为一种常见的塑化剂，广泛用于人们日常生活中，如水杯、奶瓶、玩具等，可以通过皮肤接触、饮食及空气接触等多种暴露方式积聚在人体内。有报道表明BPA具有激素样作用，会干扰机体的内分泌功能，对人体造成各种损伤，特别是对生殖系统的损害备受关注。研究发现BPA暴露会破坏小鼠的精子发生过程，导致精子数量减少，受精能力显著下降，而且BPA的这一毒性效应还可以跨代遗传。随着塑化剂在人们日常生活中的普遍应用，如何避免BPA带来的危害在逐渐引起人们的重视。

TM4是小鼠睾丸支持细胞系，睾丸支持细胞具有精细的协调作用。作为睾丸曲细精管中唯一的体细胞，Sertoli细胞为精子发生进程、精原细胞分化、减数分裂和精子发育等提供了必须的生长因子、细胞外基质以及结构支持。有研究表示，支持细胞功能的减退或数量的减少均可导致精子生成减少。

雷帕霉素(rapamycin,RAPA)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是结构和功能相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是调控细胞生长代谢的中枢节点，参与细胞生长、增殖、存活、运动、自噬和蛋白合成，也参与细胞衰老过程的调节。mTOR主要通过mTORC1和mTORC2两种不同的蛋白质复合体复合物行使生理功能。已有研究表明mTORC1是细胞生长的正向调节因子，可激活合成代谢、抑制分解，以满足细胞生长和增殖的需要。但对于BPA损伤细胞的保护作用目前尚无报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是雷帕霉素在缓解BPA损伤的TM4细胞方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

雷帕霉素在缓解细胞双酚A毒性中的应用。

优选的，所述细胞为睾丸支持细胞。

优选的，所述雷帕霉素为50nM。

缓解TM4细胞双酚A毒性的细胞培养液，含有雷帕霉素。

优选的，所述培养液是以DMEM为基础添加了10％的FBS，Penicillin G和Streptomycin。

优选的，添加了100μM的双酚A，双酚A的溶剂为DMSO。

一种缓解细胞双酚A毒性的药物，包含有效含量的雷帕霉素，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

优选的，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、口服液、糖浆、颗粒、滴丸、水针或分针。

优选的，雷帕霉素在保护BPA损伤的TM4细胞方面的应用。

TM4为小鼠睾丸支持细胞系。

TM4细胞培养的培养基是以DMEM为基础添加了10％的FBS，青霉素的工作浓度100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。

BPA损伤TM4细胞模型的细胞培养液在上述培养液的基础上添加了终浓度100μM的BPA，BPA的溶剂为DMSO。

保护BPA损伤的TM4细胞培养的培养液在上述培养液的基础上添加终浓度50nM雷帕霉素，雷帕霉素的溶剂为DMSO。

有益效果：本发明通过添加50nM的雷帕霉素显著提高了TM4细胞活性和增殖速度，缓解了BPA对睾丸支持细胞的毒性。在BPA环境和职业暴露所致毒性的防治药物中，雷帕霉素具有潜在的应用价值。该作用可能对于BPA导致的男性生殖功能的损伤及男性不育症的治疗有着重要的指导意义，可能开辟新的途径。

附图说明

图1是BPA和雷帕霉素处理后TM4细胞的生长情况示例图。

图2是BPA和雷帕霉素处理TM4细胞36h后的细胞计数结果统计图。

图3是BPA和雷帕霉素处理TM4细胞36h后细胞活性统计图。

图中：Control为正常培养液对照组，BPA为正常培养液加入100μM BPA组，BPA+10nM Rapa为BPA(100μM)+Rapamycin(10nM)组，BPA+50nM Rapa为BPA(100μM)+Rapamycin(50nM)组，BPA+100nM Rapa为BPA(100μM)+Rapamycin(100nM)，50nM Rapa为正常培养基单独加入Rapamycin组；不同字母表示差异显著。

具体实施方式

(一)小鼠睾丸支持细胞TM4的培养：

将公司购买的小鼠睾丸支持细胞TM4细胞置于37℃水浴锅中快速解冻，接种在直径35mm的细胞培养皿中，培养液以DMEM为基础添加了10％的FBS，Penicillin G和Streptomycin，在37℃，5％CO

(二)血细胞计数法统计小鼠睾丸支持细胞TM4的细胞数：

1.用0.25％的胰酶将贴壁培养的TM4细胞消化成细胞悬液，并加入血清终止消化，将细胞悬液稀释。

2.先清洗血细胞计数板，然后将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用移液枪吸取10μl的细胞悬液滴到盖玻片的边缘待其自行渗透。

3.所用计数板为16*25规格，待细胞全部沉降到计数室底部再在显微镜下取四角：1、4、13、16四个中方格(100个小方格)计数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：细胞个数/1mL＝100个小方格细胞总数/100×400×10000×稀释倍数。

(三)CCK8法测定小鼠睾丸支持细胞TM4的存活率：

1.将传代培养的TM4细胞每孔加入100微升5000个细胞接种到96孔板中，培养过夜；

2.加样设置control组，BPA(100μM)组，BPA(100μM)+Rapamycin(50nM)组和Rapamycin(50nM)组，按照上述分组，每组3个复孔分别加入对应细胞培养液培养36h。

2.每孔加入10微升增强型CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育6小时。

3.用酶标仪测定450nm处的吸光度即OD值。

4.通过graph pad进行统计学分析。

结果从图1和图2中可知对添加50nM的雷帕霉素可以显著提高BPA损伤TM4细胞的增殖速度。另外，从图3的CCK8法检测的睾丸支持细胞活性的图表中也可以发现添加50nM的雷帕霉素可以显著提高TM4细胞的活性。

针对BPA目前存在的生殖毒性问题，发明人从雷帕霉素入手，发现雷帕霉素可以显著缓解BPA的细胞毒性，具有良好的促进TM4细胞增殖和提高细胞活性的作用。