一株耐盐且能降解四环素类抗生素的菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。更具体地，涉及一株耐盐且能降解四环素类抗生素的菌株及其应用。

背景技术

自1928年发现青霉素以来，数千种抗生素已被鉴定并用作药物和食品添加剂，用于预防人类和牲畜的疾病和感染。其中，四环素因价格低廉且具有广谱抗菌活性，是全球范围内应用最为广泛的抗生素之一。作为全球第二大和中国第一大四环素生产和使用国，中国每年生产1.2×10

目前，四环素在环境中可通过非生物和生物两种途径进行降解，前者包括光解和水解，后者主要是微生物降解，大多数情况下前者降解速率远低于后者，因此微生物降解是四环素在自然环境中的主要降解途径。然而，四环素的广谱抗菌活性及其结构的特殊性限制了它们的微生物降解，还涉及四环素对多数革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有抑制作用，高浓度的四环素有强烈的杀菌作用，抑制微生物生长，导致其生物利用度低。同时，微生物降解亦面临“菌株环境适应力低，降解底物专一性，与土著微生物竞争”等应用局限性。根据污染场地特有的环境条件，选择合适的优质菌种是决定微生物修复技术能否成功运用的关键。

近年来，已有部分四环素类抗生素降解菌株被发现且在世界各地农药污染场地得到应用，例如：不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等已成功用于土壤四环素类抗生素污染修复。但是，目前发现的四环素降解菌株还比较少，而且利用微生物实现对四环素类抗生素进行降解，机理比较复杂。此外，大多数研究只针对常态条件下进行四环素降解研究，很少有在高盐度条件下进行降解四环素的研究，然而高盐度会抑制微生物的生长，进而影响四环素的降解效率。因此，筛选在高盐度条件下的四环素高效降解菌是一大突破。

鉴于此，为了满足日益扩大的四环素类抗生素污染的微生物修复需求，为抗生素污染的微生物修复提供更多菌种资源，开展四环素污染微生物修复技术研究，筛选耐盐的四环素高效降解微生物菌株，扩大抗生素降解微生物菌种库是十分必要的，可为修复四环素污染的滨海盐土土壤提供有效手段，对于治理环境污染具有重要的经济价值和现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一株耐盐且能降解四环素类抗生素的菌株及其应用。

本发明的目的是提供一株耐盐四环素类抗生素降解菌。

本发明另一目的是提供所述菌株的新应用。

本发明另一目的是提供一种四环素类抗生素降解菌剂。

本发明的再一目的是提供一种降解四环素的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从广东省湛江市遂溪县滨海滩涂放牧场土壤中筛选出一株高效降解四环素的多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)FD-08菌株，并于2022年2月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61970。FD-08菌株的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，FD-08菌株为革兰氏阴性菌，菌落为混浊半透明，有光泽，圆形凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，直径为0.5～0.8μm；对过氧化氢酶活性、氧化酶活性、淀粉水解酶活性与蔗糖、麦芽糖水解均呈阳性；对革兰氏染色、明胶液化、吲哚反应和脲酶反应均呈阴性。FD-08菌株的适宜生长条件为：pH范围为5～8，温度范围为30～40℃，盐度范围为0～6％，接种量范围为1％～7％，四环素浓度范围为0～50mg/L。

本发明研究显示，FD-08菌株能够降解多种四环素类抗生素，同时，菌株FD-08可在高盐度下有效降解四环素类抗生素，其中，对四环素、土霉素、金霉素和强力霉素有较好的降解效果，降解率分别为93.20％、52.34％、66.07％和38.36％；能应用于四环素污染的滨海盐土的修复和治理。

因此，本发明提供所述多食鞘氨醇杆菌FD-08菌株在降解四环素类抗生素和/或在制备四环素类抗生素降解菌剂、在修复四环素类抗生素污染的环境或在高盐浓度下修复四环素类抗生素污染的环境中的应用。

进一步地，所述四环素类抗生素污染的环境为土壤或水体。

优选地，所述高盐浓度下四环素类抗生素污染的环境为滨海盐土。

进一步地，所述四环素类抗生素为四环素、土霉素、金霉素或强力霉素中的一种或多种。

本发明提供一种四环素类抗生素降解菌剂，含多食鞘氨醇杆菌FD-08菌株或其菌液。

优选地，所述菌株的浓度不低于2.0×10

本发明提供一种降解四环素的方法，采用多食鞘氨醇杆菌FD-08菌株对四环素污染的土壤或样本进行处理。

优选地，所述菌株的接种量为1％～7％。

更优选地，菌株的接种量为5.69％。

优选地，处理条件为：pH为5～8，温度为30～40℃，盐度为0～5％，四环素浓度范围为0～50mg/L。

更优选地，pH：7.15，温度：34.18℃，盐度：4.77％。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)FD-08能够在高盐度条件下有效将多种四环素类抗生素(四环素、土霉素、金霉素和强力霉素)进行降解，其中对四环素的降解率高达93.20％，对于四环素类抗生素的降解和修复四环素类抗生素污染环境方面具有重要的现实意义和价值。

本发明提供的多食鞘氨醇杆菌FD-08对盐度具有较好的耐受能力，能够有效去除滨海盐土土壤中的四环素，可广泛用于滨海盐土的四环素污染修复治理及土壤污染修复领域，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为菌株FD-08的形态特征；

图2为菌株FD-08的系统发育树；

图3为菌株FD-08的生长曲线及降解四环素的性能试验；

图4为菌株FD-08在不同生长条件下对四环素的降解能力；

图5为菌株FD-08在不同生长条件下对四环素降解的3D响应曲面图；

图6为菌株FD-08对不同四环素类抗生素的降解能力测试。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明使用的无机盐培养基组成如下：1.0g/L(NH

LB培养基组成如下：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，10.0g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

平板固体培养基为相应的培养基中加入20g的琼脂。

FD-08菌株的16S rDNA的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO:1：ACGGGATCCATCGGAGAGCTTGCTCGAAGATGGTGAGAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGAGCAACCTACCTCTATCAGGGGGATAGCCTCTCGAAAGAGAGATTAACACCGCATAATATCAACAGTTCGCATGTTCGGTTGATTAAATATTTATAGGATAGAGATGGGCTCGCGTGACATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATGTCTAGGGGCTCTGAGAGGAGAATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGTCCAGGAATAAACCTAAATACGTGTATTTAGCTGAATGTACTGGAAGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCCTATTAAGTCAGGGGTGAAATACGGTGGCTCAACCATCGCAGTGCCTTTGATACTGATGGGCTTGAATCCATTTGAAGTGGGCGGAATAAGACAAGTAGCGGTGAAATGCATAGATATGTCTTAGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTCACTAAGCTGGTATTGACGCTGATGCACGAAAGCGTGGGGATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATAACTCGATGTTGGCGATAGACAGCCAGCGTCCCAGCGAAAGCGTTAAGTTATCCCCCTGGGGAGTACGCCCGCAAGGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAGCATGTGGTTTAATTTGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAAAGTTAGTGAAGAGTGCAGAGACGCCCTTGTCCTTCGGGACCCGAAACTAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATGTTTAGTTGCCAGCATGTCATGGTGGGGACTCTAAACAGACTGCCTGTGCAAACAGAGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAGCGGGCAGCTACATAGCAATATGATGCTAATCTCTAAAAGCCATTCACAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGATTCGCTAGTAATCGCGTATCAGCAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAA

实施例1菌株富集、分离和纯化、特性鉴定

(1)菌株的富集

从广东省湛江市遂溪县滨海滩涂放牧场附近采集土壤样品。在无菌操作下，准确称取10g土壤样品放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使样品与水充分混合，将细胞分散，形成均匀的菌悬液。静置20-30s，再吸取1mL上清液到含有10mg/L的四环素无机盐培养基中(以四环素作为唯一碳源)，在30℃，180rpm条件下避光震荡培养。培养5d后，再次以1％接种量接种于20mg/L四环素的无机盐培养基中，在相同条件下培养，依次类推，直至无机盐培养基中四环素浓度为50mg/L。每次富集培养都有不加菌液的空白对照。

(2)菌株的分离和纯化

将四环素驯化浓度为50mg/L时的富集培养物分别稀释为10

(3)特性鉴定

3.1菌株形态特性

FD-08菌株为革兰氏阴性菌，在LB培养基上培养24h后形成的菌落如图1所示，为混浊半透明，有光泽，圆形凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，直径为0.5-0.8μm。

3.2菌株生理生化特性

FD-08菌株对过氧化氢酶活性、氧化酶活性、淀粉水解酶活性与蔗糖、麦芽糖水解均呈阳性；菌株对革兰氏染色、明胶液化、吲哚反应和脲酶反应均呈阴性。

3.3分子生物学特性

采用试剂盒法提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R，PCR扩增细菌的16S rDNA，在1400bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，FD-08菌株的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。将获得的DNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行Blast比对分析，并利用MEGA软件(版本:7.0)构建系统发育树。如图2所示，结果发现本发明菌株的16S rDNA序列和与GenBank中多食鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)的多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)具有较高的同源性。结合上述的形态特性、16S rDNA序列的结果，将本发明分离得到的菌株归属于多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)，命名为FD-08，并于2022年2月24日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61970，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2FD-08的生长条件及其对四环素的降解性能

(1)菌株FD-08生长曲线

将菌株FD-08的种子液(OD

结果如图3所示，菌株FD-08可显著降解四环素，FD-08菌株生长率和四环素降解率呈显著负相关关系。实验72h后，添加FD-08菌株的处理中四环素降解率达到96.20％。

(2)菌株FD-08在不同条件下对四环素的降解实验

本次不同条件下对四环素的降解实验主要研究温度、pH、盐度、接种量和四环素浓度对菌株降解四环素的能力影响。各影响因子的处理组分别为：温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)；pH(5、6、7、8、9、10)；盐度(0％、2％、4％、6％、8％、10％)；接种量(1％、3％、5％、7％、9％)；四环素浓度(10mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L)。分别在上述不同影响因子，180rpm条件下在恒温震荡培养箱中避光培养72h后，测定菌株生长情况(OD

不同温度、pH、盐度、接种量和四环素浓度条件下菌株降解四环素的能力结果如图4所示，结果表明：菌株FD-08适宜温度范围为30-40℃，四环素降解率分别为96.85％和94.20％。当温度小于25℃或大于40℃时，菌株生长缓慢，特别是温度为20℃，对四环素的降解能力较差。

菌株FD-08适宜pH范围为5～8，四环素降解率分别为91.76％、98.19％、96.20％和90.21％。当pH大于8时，菌株生长受到抑制，对四环素的降解能力严重下降。因此，菌株FD-08可在弱酸或中性条件下高效降解四环素。

菌株FD-08适宜盐度范围为0～6％，四环素降解率依次为96.20％、97.83％、98.55％、84.50％。当盐度大于6％时，菌株对四环素的降解能力急速下降。因此，菌株FD-08可在盐浓度较高的条件下有效降解四环素。

菌株FD-08不同接种量对四环素的降解影响不明显，其中接种量为5％时四环素降解率最佳，高达98.00％，接种量为9％时四环素降解率较差，为86.74％。当四环素的浓度为10、25、50mg/L，菌株FD-08对四环素的降解率依次为96.04％、95.44％和96.99％。当四环素浓度大于50mg/L时，菌株对四环素的降解能力急速下降。

综上所述，该菌株适宜pH范围为5～8，温度范围30～40℃，盐度范围为0～6％，接种量范围为0％～6％，四环素浓度范围为0～50mg/L。

实施例3FD-08生长条件响应曲面优化设计

为明确菌株FD-08对四环素的降解潜力，应用了响应曲面优化了温度、pH、盐度和接种量四种因素及其相互作用的影响。基于Box-Behnken设计，以上述四种主要影响因子为自变量，降解率为响应值，四环素起始浓度为50mg/L。用Design Expert 13.0软件设计Box-Behnken实验，共计30组处理，每个处理3个重复，培养72h后测定菌液残留的四环素浓度，计算降解率。具体处理如表1所示。

表1Box-Behnken设计及其所得响应值

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上述二次多项方程式中Yi为预测响应值，X

对实验数据进行多项式回归分析，并通过Design Expert 13.0软件建立二次响应模型。

拟合并推导的二次多项方程式如下：

Yi＝98.18+8.82*X

表2拟合模型的方程分析(ANOVA)

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上述表2中Sum of Squares为序列之和，DF为自由度，Mean Square为均方，P值小于0.05为该模型项呈显著性，反之为不显著。

经过Design Expert 13.0软件的统计分析表明，该模型具有极高的显著性(p<0.05)。同时该模型的相关系数R

3D响应曲面图能有效而直观地反映测试结果中的各种因素及其相互作用，如图5所示。本研究中成功拟合了二次多项式模型，减少了处理次数和资源的投入，达到优化降解条件的目的。在理论最佳点上的最大降解率为99.88％，X1、X2、X3、X4的编码值分别为0.418、-0.140、-0.046和0.1725；实际值：温度为34.18℃，pH为7.15，盐度为4.77％，接种量为5.69％。为了预测上述模型的预测准确性，使用上述优化条件对四环素进行降解实验。结果发现，在培养72h后，四环素的残留量只有0.62mg/L，降解率为98.76％，与模型预测值相差不足0.01。因此，该模型对降解条件的优化是可行和可靠的。

实施例4FD-08对不同四环素类抗生素的降解性能

本实施例选用四环素、土霉素、金霉素、强力霉素配制浓度为50mg/L的无机盐培养基，盐度设置为6％，按5％接种量接入菌株FD-08的种子液(OD

结果如图6所示，表明FD-08菌株对四环素、土霉素、金霉素有较好的降解效果，降解率分别为93.20％、52.34％和66.07％，对强力霉素的降解效果较差，降解率仅为38.36％。

实施例5FD-08在滨海盐土中去除土壤四环素

为观察菌株FD-08在滨海盐土对四环素污染的修复能力，本实施例使用的土壤采集于广东省湛江市遂溪县滨海滩涂某牧场，其土壤盐度为4.52％，pH为6.36，四环素浓度为44.96mg/kg。称取100g干燥土壤置于锥形瓶，加入相同盐度的海水使其保持60％田间含水量。并以5％接种量接入菌株FD-08。以不接菌的土壤作为空白对照组，每组处理3个重复，置于30℃恒温培养箱。培养阶段分别在0d、1d、3d、5d、7d和9d采样，检测土壤中四环素的残留浓度，计算其降解率。

结果如表3所示，经过9d的时间后，在空白处理中，四环素在自然环境下的降解率较差，仅为13.63％。相反地，在投入菌株FD-08强化后的处理中，污染土壤的四环素残留浓度仅为5.07mg/kg，降解率为88.17％。因此，菌株FD-08可在滨海盐土中高效修复四环素污染土壤。

表3菌株FD-08在滨海盐土对四环素的降解效果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。