一种非洲哈茨木霉Tr35及其应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体地涉及一种非洲哈茨木霉Tr35及其应用。

背景技术

玉米茎腐病是世界玉米产区普遍发生的一种重要病害，在我国各玉米种植区严重发生。一般年份，田间病株率在5％～10％，严重发生时，田间病株率可达50％以上。重发生年产量损失在5～10％，严重地块减产25％左右。玉米茎腐病病原组成复杂，已报道玉米茎腐病的病原菌有20余种，这些病原菌单独或复合侵染导致玉米茎腐病的发生，我国茎腐病主要病原菌为镰孢菌(Fusarium spp.)和腐霉菌(Pythium spp.)。已明确为病原菌的镰孢菌有15余种，其中禾谷镰孢(F.graminearum)、拟轮枝镰孢(F.verticillioides)、层出镰孢(F.proliferatum)为分离频率最高的3种病原镰孢菌。目前生产中对于该病害的防治主要采取含咯菌腈成分的化学种衣剂和增施钾肥，但防效多数仅在30％左右。同时，随着化学农药的长期和大量使用而引起的农药残留、环境污染、病虫的抗药性、农田微生态平衡破坏和对生物健康的威胁等问题日益凸显。

生物防治是以具有防病和促生作用的微生物作为生防因子来防治植物病害。近年来，以其安全高效的优势逐渐受到重视，成为替代化学防治的重要措施。木霉属(Trichoderma)是自然界广泛分布的生防真菌，至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用，主要用于防治各种植物的土传病害，以及部分叶部和穗部病害，具有较高经济价值和应用前景。

目前已用于玉米茎腐病防治的木霉菌有深绿木霉SG3403(专利CN103484377A)、棘孢木霉ZJSX5003(专利CN103484376A)和哈茨木霉LTR-2(专利CN11081074A)，但这些木霉菌株都只是对禾谷镰孢菌引起的茎腐病进行的有效防治，防治谱较窄，防治效果不突出。专利CN11081074A中虽然记载了哈茨木霉对玉米茎腐病的防效为72.53％，但是基于说明书中记载的对照组和处理组的发病率都很低，仅为1.02％和3.72％，根据其统计得到的防效数据可以算作无效结果，不具有参考价值。因此，提供一种具有更宽防治谱，对多种植物病害有防治作用的新菌株尤其重要。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一株具有广谱拮抗植物病原菌作用的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)Tr35，本发明的非洲哈茨木霉Tr35具有防治多种植物病害以及促进植物生长发育的作用。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明提供一种非洲哈茨木霉，所述非洲哈茨木霉为Trichodermaafroharzianum Tr35，保藏编号为CGMCC NO.40207。

本发明中，所述非洲哈茨木霉Tr35的EF-1α基因序列如SEQ IDNO:1所示，RPB2基因序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明中，所述非洲哈茨木霉Tr35的形态特征为：菌落圆形，初期为白色，逐渐变成绿色；菌丝丝状，较细长，呈棉絮状，从中心向四周辐射状生长；分生孢子梗呈烧瓶形至安瓿形，中间膨大，顶端最细并可产孢，瓶梗细胞单生或2～5个轮生；分生孢子呈球形或椭球形，单细胞，表面光滑，淡绿色，老熟后呈深绿色。

本发明还包括上述非洲哈茨木霉的培养物，所述培养物是将上述的非洲哈茨木霉Tr35在微生物培养基中培养得到的物质。

作为一种可选的实施方式，所述培养物包括非洲哈茨木霉Tr35的菌悬液、孢子悬液、发酵液和/或其代谢产物。

本发明的另一个目的还在于提供上述非洲哈茨木霉Tr35和/或其培养物在下述任意一项中的应用：

1)抑制植物病原菌；所述植物病原菌为下述至少一种：禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌、拟轮枝镰孢菌、层出镰孢菌、玉蜀黍平脐孺孢、新月弯孢、麦根腐平脐蠕孢、禾谷丝核菌、假禾谷镰孢菌、腐皮镰孢菌和人参链格孢菌；

2)制备1)所述植物病原菌的抑制剂；

3)防治1)所述植物病原菌导致的植物病害；

4)制备3)所述植物病害的抑制剂。

作为优选的，所述植物病害包括下述至少一种：玉米茎腐病、玉米穗腐病、玉米根腐病、玉米鞘腐病、玉米小斑病、弯孢菌叶斑病、麦根腐叶斑病、小麦纹枯病、小麦根腐病、小麦茎基腐病、小麦赤霉病、大豆根腐病、人参根腐病、人参黑斑病和烟草根腐病。

作为一种可选的实施方式，所述非洲哈茨木霉Tr35的使用浓度为10

本发明的另一个目的还在于提供上述非洲哈茨木霉Tr35和/或其培养物在下述任意一项中的应用：

A)促进植物生长；

B)制备促进植物生长的产品；

C)促进植物种子萌发；

D)制备促进植物种子萌发的产品。

作为一种可实施方式，所述植物包括玉米，所述促进植物生长包括促进玉米的胚芽、胚根及侧根的生长。

本发明还提供了一种微生物菌剂或肥料，含有上述的非洲哈茨木霉Tr35和/或培养物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明的非洲哈茨木霉Tr35具有广谱的拮抗植物病原真菌的作用，可用于粮食作物、经济作物及药用植物等病害防治；该菌株具有较好的促进植物生长发育的作用，对玉米种子的萌发、根部生长具有促进作用。

保藏说明

非洲哈茨木霉Trichoderma afroharzianum Tr35于2022年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40207；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为根据EF-1α基因序列获得的Tr35菌株系统发育树。

图2为根据RPB2基因序列获得的Tr35菌株系统发育树。

具体实施方式

本发明从河南省周口市玉米茎腐病病株的根际土壤中分离纯化得到非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)Tr35，该菌株具有广谱的拮抗植物病原真菌和促进植物生长的作用。

目前，该非洲哈茨木霉已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.40207；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2022年6月2日，分类命名为Trichoderma afroharzianum Tr35。

本发明的非洲哈茨木霉Tr35的形态特征为：菌落圆形，初期为白色，逐渐变成绿色；菌丝丝状，较细长，呈棉絮状，从中心向四周辐射状生长；分生孢子梗呈烧瓶形至安瓿形，中间膨大，顶端最细并可产孢，瓶梗细胞单生或2～5个轮生；分生孢子呈球形或椭球形，单细胞，表面光滑，淡绿色，老熟后呈深绿色。

本发明的非洲哈茨木霉Tr35的EF-1α基因序列如SEQ ID NO:1所示，RPB2基因序列如SEQ ID NO:2所示。

非洲哈茨木霉Tr35鉴定为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、粘孢菌类的木霉属真菌(T.afroharzianum)。

本发明中，上述非洲哈茨木霉的培养物是指将非洲哈茨木霉Tr35在微生物培养基中培养得到的物质，包括但不限于非洲哈茨木霉Tr35的菌悬液、孢子悬液、发酵液和/或其代谢产物。此处的微生物培养基指的是能实现非洲哈茨木霉Tr35生长扩繁的培养基，包括但不限于PDA培养基，以及在PDA培养基上为实现更好非洲哈茨木霉Tr35生长或代谢的改进培养基。本领域技术人员可根据实际培养情形调节或改进培养基及培养条件。

本发明的非洲哈茨木霉Tr35及其培养物具有抑制多种植物病原菌的功能，能够作为植物病原菌抑制剂的唯一或部分活性成分。优选的，本发明的非洲哈茨木霉Tr35及其培养物对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、拟轮枝镰孢菌(F.verticillioides)、层出镰孢菌(F.proliferatum)、玉蜀黍平脐孺孢(Bipolarismaydis)、新月弯孢(Curvularia lunata)、麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、假禾谷镰孢菌(F.pseudograminearum)、腐皮镰孢菌(F.solani)、人参链格孢菌(Alternaria panax)等多种植物病原真菌均具有抑制作用。

本发明的非洲哈茨木霉Tr35及其培养物通过抑制植物病原菌达到防治植物病害的作用，可以作为植物病害抑制剂的唯一或部分活性成分。作为一种实施方式，本发明的植物病害包括下述至少一种：玉米茎腐病、玉米穗腐病、玉米根腐病、玉米鞘腐病、玉米小斑病、弯孢菌叶斑病、麦根腐叶斑病、小麦纹枯病、小麦根腐病、小麦茎基腐病、小麦赤霉病、大豆根腐病、人参根腐病、人参黑斑病和烟草根腐病。作为一种可选的实施方式，所述非洲哈茨木霉Tr35的使用浓度为10

本发明的非洲哈茨木霉Tr35及其培养物具有促进植物生长的作用，能够作为促进植物生长产品的唯一或部分活性成分。本发明的非洲哈茨木霉Tr35及其培养物具有促进植物种子萌发的作用，能够作为作为促进植物种子萌发产品的唯一或部分活性成分。一种实施方式，本发明的非洲哈茨木霉Tr35及其培养物能够促进玉米的萌发，及胚芽、胚根和侧根的生长。作为一种实施方式，将非洲哈茨木霉Tr35的发酵液以原液或稀释液的形式浸泡种子，稀释倍数可选的为1～300倍，更优选的为2～200倍，或上述范围中的任意稀释倍数，如2倍、10倍、30倍、50倍、100倍、150倍、200倍。

本发明另一方面还提供一种微生物菌剂或肥料，含有本发明的非洲哈茨木霉Tr35和/或其培养物。本发明的微生物菌剂或肥料可以根据本领域技术人员熟知的方法生产。微生物菌剂或肥料的制剂类型可以为溶液剂、分散剂、悬浮剂、颗粒剂等形式。使用方式可以为喷施、撒施、沟施或随水灌溉施用。

在一个实施方案中，本发明的微生物菌剂或肥料还包括与本发明非洲哈茨木霉Tr35不同的微生物类型，不同微生物之间的复配使用，扩大微生物菌剂的宿主谱，提高对植物病原菌的防治效果，延缓抗药性的产生。本发明的微生物肥料中还可包括植物生长所需要的有机无机肥料。将本发明的非洲哈茨木霉Tr35或其培养物与有机无机肥料共同制作成微生物菌肥，在防治植物病害的同时，提高微生物肥料的促生长效果。

在一个实施方案中，本发明非洲哈茨木霉Tr35或其培养物可经冷冻干燥、或溶于适当溶媒中制备微生物菌剂或肥料。冷冻干燥采用本领域中的常规方法。所述溶媒可选的为水、微生物培养基等。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。以下实施例中所用植物病原菌来源于实验室保存的植物病原菌菌种，为已知的植物病原菌类型。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

木霉菌株的分离和纯化

玉米成熟期，采用五点取样法，从玉米茎腐病发病田里的玉米茎腐病病株周围采集10～20cm耕作层土样，同一小区内的土样混合均匀、编号并装入保鲜袋中，带回实验室4℃保存。共采集土样124份。

采用稀释平板法，从冰箱中取10g土壤样品装入盛有90ml灭菌水和5-10粒直径4mm玻璃珠的三角瓶，然后在200r/min的摇床上摇30min。取5ml倒入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，混匀后，再吸取5ml转入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，充分混匀后吸取0.2ml于直径9cm的平板上，用涂布器涂抹均匀，放于28℃恒温培养箱中培养。48～72h后挑取产绿色分生孢子的菌落，转接到PDA平板上，28℃恒温培养箱中继续培养，待菌落直径长到4～5cm时再次转接PDA平板28℃恒温培养。共获得109株木霉菌株。

采用平板对峙法测试上述木霉菌株对玉米镰孢茎腐病病原菌的抑制作用。将实验室保存的玉米镰孢茎腐病主要病原菌禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌进行活化，将活化后的病原菌与木霉菌在PDA平板上分别培养5d，分别用打孔器在菌落边缘打取直径为0.5cm的菌饼对峙接种于直径为9cm PDA平板的两侧，菌饼圆心相距约4.5cm，连线经过平板圆心，28℃恒温培养箱中培养。另将接种禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌纯培养作为对照，每处理重复3次。用十字交叉法测量记录第5d的菌落直径，计算抑制率。

抑制率＝(对照病原菌的菌落直径－处理病原菌的菌落直径)/(对照病原菌的菌落直径-0.5cm)×100％。

由表1可知，木霉菌株Tr35对禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌均有较高的抑制作用，抑制率分别为76.41％、72.42％和73.74％。

表1Tr35对玉米镰孢茎腐病主要病原菌抑制率的测定

实施例2

Tr35菌株的形态鉴定

用打孔器在菌株Tr35菌落边缘打取直径为0.5cm的菌饼置于PDA平板上，于28℃黑暗条件下培养。每天观察培养皿上菌落的生长速度、颜色变化等特征。待菌落培养3-5d后，挑取菌丝制片，置于光学显微镜下观察菌丝、分生孢子以及孢子梗的形态等特征。

结果：Tr35菌株在PDA培养基上活化后，气生菌丝生长迅速。菌落圆形，初期为白色，逐渐变成绿色。菌丝丝状，较细长,呈棉絮状，从中心向四周辐射状生长。分生孢子梗呈烧瓶形至安瓿形，中间膨大，顶端最细并可产孢，瓶梗细胞单生或2～5个轮生。分生孢子呈球形或椭球形，单细胞，表面光滑，淡绿色，老熟后呈深绿色。通过以上菌种的形态学特征，初步鉴定其为木霉菌属(Trichoderma)中的一种。

实施例3

Tr35菌株的分子鉴定

将木霉菌株Tr35在PDA培养基上培养5d，收集孢子及菌丝体，采用CTAB法提取真菌的总DNA。

分别利用EF-1α基因引物和RPB2基因引物进行PCR扩增。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

EF-1α基因引物如下：

EF1-728F：5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'；

TEF1LLErev：5'-AACTTGCAGGCAATGTGG-3'。

RPB2基因引物如下：

5F：GAYGAYMGWGATCAYTTYGG；

7CR：CCCATRGCTTGYTTRCCCAT。

PCR反应体系为25μL：其中12.5μL 2*Es Taq MasterMix(康为世纪)，模板DNA 1μL，正反引物(10μmol/L)各0.5μL，ddH

PCR扩增反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，退火温度依引物不同分别为53℃(引物EF1-728F和TEF1LLErev)和51℃(引物5F和7CR)，时间为30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。

将PCR扩增产物直接送交上海生工生物工程股份有限公司测序。测序结果在GenBank中进行同源性比对，同时根据所得序列以及从GenBank中获得的其他病原菌相关序列信息，利用MEGA 5.2软件构建系统发育树，确定病原菌的分类地位。

对菌株Tr35的EF-1α和RPB2进行PCR扩增，扩增产物大小分别为1276bp和1136bp。对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2所示。将获得的Tr35菌株的EF-1α基因序列和RPB2基因序列在GenBank中进行同源性比较，结果发现菌株Tr35与非洲哈茨木霉菌株Z19的EF-1α基因序列亲源关系最近，同源性为99.84％；与非洲哈茨木霉菌株Tri-1和菌株Tafum2的RPB2基因序列的亲源关系最近，同源性分别为99.74％和99.91％。利用MEGA5.2软件构建系统发育树，结果显示，菌株Tr35与非洲哈茨木霉聚合到一起，说明Tr35属于木霉属非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)。

根据菌株Tr35的培养性状、形态特征、EF-1α基因序列和RPB2基因序列分析结果，将其鉴定为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、粘孢菌类的木霉属真菌，非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)。

实施例4

Tr35的抑菌谱测定

采用平板对峙法，将菌株Tr35在PDA培养基上分别与玉米主要致病菌玉米穗腐病菌、玉米小斑病菌、弯孢霉叶斑病菌、玉米根腐病菌、玉米鞘腐病菌、麦根腐叶斑病菌、小麦根腐病菌、小麦纹枯病菌、小麦茎基腐病菌、小麦赤霉病菌、大豆根腐病菌、人参根腐病菌、人参黑斑病菌和烟草根腐病菌菌株进行对峙培养，28℃黑暗培养，待对照组菌丝长满培养基后，十字交叉法测量菌落生长直径，以只接种病原菌的PDA培养基为对照，重复3次，计算菌株Tr35对病原菌菌丝生长的抑制率。

由试验结果表明(表2)，非洲哈茨木霉菌株Tr35对14种供试的植物病原真菌菌丝生长均有较好的抑制效果，抑制率均达到60％以上，具有较广的抗真菌谱。其中对小麦纹枯病菌的抑制率达到84.41％，对玉米小斑病菌、人参黑斑病菌、小麦根腐病菌、麦根腐叶斑病菌和玉米穗腐病菌的菌丝抑制率都达到70％以上，抑制率分别为75.56％、74.63％、74.14％、74.00％和71.11％。

表2Tr35对供试植物病原真菌菌落生长抑制作用

实施例5

Tr35对玉米生长发育的影响

将Tr35接种于PDA平板，在28℃黑暗条件下培养4-7d，待菌落充分生长，在其边缘切取菌饼(直径0.5cm)10个，接种于PD液体培养基中(100mL PD/250mL三角瓶)，于28℃、180r/min振荡培养5d。过滤去除菌丝体，得到发酵液。将发酵液配制成1×10

试验结果表明(表3)：Tr35发酵液10倍稀释液处理后，玉米的发芽率最高，为100％，同时对玉米胚芽、胚根及侧根生长的促进作用最为明显，与对照达到差异显著水平。

表3Tr35不同浓度发酵液对玉米生长的影响

实施例6

Tr35对玉米镰孢菌茎腐病防治效果

采用实施例5的方法制备Tr35发酵液。过滤去除菌丝体，将孢子浓度稀释成1×10

苗期茎腐病分级标准：0级：整株生长正常，无病级；1级：玉米地上部地下部生长基本正常，病斑面积占根表总面积以下，根群颜色白中有褐；2级：地上地下生长明显受阻,叶色变淡,株高仅及对照的3/4，侧根少而短，无须根，病斑连片，病斑面积占根表总面积的1/4～1/2，根群颜色白、褐相当；3级：地上地下部生长极不正常，地上部可见青枯、黄枯状，株高仅及对照的1/2，侧根极小，病斑占根表总面积1/2～3/4，根群颜色褐中带白；4级：发芽但不出苗，几乎窒息而死，病斑占根表总面积3/4以上，根褐色。

病情指数及防效的计算方法如下：

病情指数＝100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)；

防治效果(％)＝(空白对照病情指数-处理病情指数)/空白对照病情指数。

试验结果表明(表4)：Tr35对3种镰孢菌引起的茎腐病都有较好的防治效果，防效都达到70％以上，其中对禾谷镰孢菌引起的禾谷镰孢茎腐病防效达到了81.99％，而对拟轮枝镰孢菌和层出镰孢菌引起的拟轮枝镰孢茎腐病和层出镰孢茎腐病的防效相当，分别为77.44％和76.88％。

表4Tr35对玉米镰孢菌茎腐病防治效果

实施例7

Tr35对玉米小斑病离体防效试验

采用实施例5的方法制备Tr35发酵液。过滤去除菌丝体，将孢子浓度稀释成1×10

病斑面积(mm

防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100。

试验结果表明(表5)：Tr35发酵液处理的叶片病斑面积为9.68mm

表5Tr35对玉米小斑病离体防效试验

上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。