一种利用电容值确定病毒生产工艺节点的方法

技术领域

本发明属于病毒学，更具体地，本发明涉及一种利用电容值确定病毒生产工艺节点的方法。

背景技术

近年来随着溶瘤病毒和病毒载体疫苗的发展，微载体培养技术日趋完善。该技术克服了传统贴壁细胞工艺依赖滚瓶/细胞工厂培养中规模有限和放大困难的缺点，成为一种兴起的大规模贴壁细胞培养技术。

在病毒生产中，收获时间是极其关键的工艺参数。特别是一些本身对反应器内的环境变化，例如剪切力，温度，pH等较为敏感的病毒产品，病毒稳定性差易失活，导致最佳收获时间区间狭窄。因此错过合适的收获时间会影响病毒滴度(Titer)和产品质量(Quality)。目前在贴壁工艺中，较为常见的收获策略主要有三种：肉眼或显微镜观察，根据培养时间，或者是两者的结合。但是，以上收获策略都有各自的缺点。

通过肉眼或者显微镜观察细胞病变(CPE)程度确定收获时间，易受到操作人员判断的影响，主观性强，观察结果可靠性低；此外，细胞病变的观察是不可连续的，无法实时反馈细胞培养状态；以上这些因素最终会影响产品批次间的稳定性。

出于大规模生产操作友好性考虑，培养时间也是一种常用的收获策略，即依据工艺开发数据，确定合适的收获时间区间。然而，由于批次间细胞培养条件的差异导致病毒侵染效率，扩增速率等都有可能出现差异，采用固定的收获时间这一收获策略风险较高，批次间产品差异大。此外，相较于传统的细胞工厂和滚瓶，微载体细胞取样及计数过程更复杂，计数结果误差更大，容易扩大批次间实际MOI误差，进而影响病毒成熟收获时间，因此固定收获时间相较于细胞工厂/滚瓶更不适用于微载体平台。两种方法结合的收获策略(显微镜观察结合培养时间)虽能实现部分互补，但并没有解决根本问题，连续性观测进而确定收获最优时机的需求需要得到满足。

因此，本领域亟待开发新的、能够有效反映和确定病毒生产的关键性节点，特别是收获节点的方法，以期实现更高效的生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用电容值确定病毒生产工艺节点的方法。

在本发明的第一方面，提供一种生产病毒的方法，包括：在培养容器中，以病毒生产细胞生产病毒，以细胞电容值确定病毒生产的工艺节点；所述的工艺节点为：病毒接种时机，病毒收获时机。

在一种或多种实施方式中，所述病毒生产细胞为哺乳动物细胞；较佳地包括(但不限于)：Vero细胞，HEK293系列细胞株，CHO细胞，MCF-7细胞等。

在一种或多种实施方式中，所述病毒包括：包膜病毒和非包膜病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)，慢病毒，流感病毒，杆状病毒等。

在一种或多种实施方式中，病毒接种时机的确定包括：根据细胞密度范围，确定所述细胞电容值的范围，在该电容值范围接种病毒。

在一种或多种实施方式中，所述细胞为Vero细胞，所述细胞密度范围为1.32-1.98E6 cells/mL。

在一种或多种实施方式中，将病毒生产细胞在微载体上贴壁培养，测定细胞电容值；对应3±2g/L、较佳地3±1g/L微载体，当电容值为50-90pF/cm、较佳地53-85pF/cm(如68pF/cm、84pF/cm)时，接种病毒，进行病毒生产。

在一种或多种实施方式中，病毒收获时机的确定包括：在接种病毒后，测定细胞电容值，记录电容峰值；当电容值降至电容峰值的10-5％、较佳地9-6％(如8％、7％、6％)时，收获病毒。

在一种或多种实施方式中，所述微载体包括2D微载体；较佳地包括葡聚糖基质的微载体；较佳地，微载体的密度为3±2g/L(更佳地3±1g/L)。

在一种或多种实施方式中，微载体表面接种细胞密度为0.05-0.5E5cells/cm

在一种或多种实施方式中，产毒MOI(病毒添加量)：0.01±0.005；较佳地为0.01±0.003(如0.01±0.002、0.01±0.001)。

在一种或多种实施方式中，以贴壁生长的培养基进行培养；较佳地，所述贴壁生长的培养基包括(但不限于)：DMEM培养基、VP-SFM培养基或Pesche培养基。

在一种或多种实施方式中，生产病毒前培养细胞时，温度为37℃；生产病毒时，温度为35±1℃(较佳地35-36℃，更佳地35℃)。

在一种或多种实施方式中，细胞接种后，搅拌速度45-80rpm；较佳地50-70rpm(如55、60、65rpm)。

在一种或多种实施方式中，pH 6.0-7.8；较佳地，pH 6.5-7.4。

在一种或多种实施方式中，反应容器的培养体积为容器总体积的40-80％(如45％，55％，65％，75％)，较佳地50-60％；

在一种或多种实施方式中，细胞接种后，DO为40±10％；较佳地40±5％(如40±5％)。

在一种或多种实施方式中，病毒接种前，停止反应器运行(包括停止搅拌、通气、温度、pH和DO控制)，将培养上清液排除、更换无血清培养基(较佳地，更换60-90％体积，如65％、70％、75％、80％、85％体积)；较佳地更换后进行润洗(搅拌5-10min)。

在一种或多种实施方式中，润洗1-3次。

在一种或多种实施方式中，所述根据细胞密度范围、确定所述细胞电容值的范围包括：根据活细胞密度与电容值的关系建立模型，计算得到接毒时目标电容值。

在一种或多种实施方式中，通过电容值和活细胞密度拟合曲线建立模型。

在一种或多种实施方式中，所述培养容器包括：生物反应器、器皿(如培养瓶、培养皿)等。

在一种或多种实施方式中，将微载体在培养基中先平衡4h或以上，使得微载体达到适宜细胞贴附的状态。较佳地，以37℃±1℃(较佳地37±0.5℃)，pH 6.0-7.8，较佳地pH6.5-7.4，适当搅拌速度(50-120rpm)下进行平衡。

在一种或多种实施方式中，在确定的单位面积上细胞密度范围的条件下，电容值范围可依据微载体密度进行调整。

在一种或多种实施方式中，所述的利用电容值确定HSV生产工艺节点，所述依据电容值进行收获的依据为当电容值达到接毒后电容峰值的一定比例后进行收获，即电容值指导收获策略，针对不同的培养条件，不同的宿主细胞，不同的病毒，该电容值指导收获策略中的百分比可进行适当调整。

在一种或多种实施方式中，所述方法独立于以分析细胞病变(CPE)程度为指标的病毒收获方法。

在一种或多种实施方式中，所述方法独立于以培养时间作为指标的病毒收获方法。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法在生产病毒中的应用。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、电容值与细胞密度(VCD)关系模型。

图2、实施例1收获电容比值与产品效价与质量的关系。

图3、实施例2收获电容比值与产品效价与质量的关系。

图4、不同收获策略对比图(时间收获vs.电容收获)。

图5、不同收获策略对比图(CPE收获vs.电容收获)。

图6、不同收获策略CPE对比图(CPE收获vs.电容收获)。

具体实施方式

针对贴壁细胞生产病毒工艺中的不稳定表现，如收获工艺锁定难、产品质量批次间差异大等问题，本发明人在深入研究和实验中发现，在病毒生产中，由于病毒侵染、扩增导致细胞病变，从而引起的细胞形态、直径、活率、密度等的变化，而这些变化可以反映在电容值变化上。在此基础上，本发明首次将电容值变化与病毒的生产节点进行关联，根据电容值变化确定病毒生产工艺节点，尤其是确定最佳的病毒接毒时间以及收获时间。本发明的方法直接根据电容值确定接毒及收获工艺节点，可方便地进行生产过程在线监测，提高了工艺的稳定性及可放大性，具有极大的应用前景。

如本文所用，除非另外说明，所述的“电容值”与“电容比值”可互换使用。在一些实施方式中，所述“电容值”由活细胞浓度测量仪测量获得。

如本文所用，除非另外说明，所述的“病毒生产细胞”与“病毒包装宿主细胞”可互换使用，有时候它们也被简称为“细胞”或“宿主细胞”，是指适用于进行病毒扩增/繁殖的细胞，其被在适当的培养基中培养，感染病毒后，可为病毒提供适当的组装环境、使得病毒得以扩繁。所述的细胞较佳地为哺乳动物细胞。

如本文所用，“贴壁细胞”是指在使用的培养条件下，贴于固体载体以便繁殖且正常发育的细胞。由于接触抑制现象，它们通常在其载体上形成单细胞层。

如本文所用，“病毒生产”可以指代活病毒、减毒病毒和/或病毒样颗粒(VLP)的生产。

如本文所用，“优选的/推荐的细胞密度范围”用于确定接毒的电容值范围，为适于进行病毒接种的核实的细胞密度，这一细胞密度可根据技术人员的生产经验而确定；较佳地，该范围如为1.32-1.98E6 cells/mL，即1.0-1.5E5cells/cm

如本文所用，所述的“接毒”与“病毒接种”可互换使用。

病毒生产细胞作为病毒的宿主，在生产病毒之前，首先进行病毒生产细胞的培养，在细胞培养至适当的阶段，进行病毒的接种。

作为本发明的优选方式，所述病毒生产细胞以贴壁培养的方法培养。将细胞引入培养容器内，所述培养容器含有培养基以及置于培养基中的微载体。

本发明中，所述的微载体通常为直径在50-500μm、适合细胞(或感染有病毒的细胞)贴壁生长的载体，一般是以天然葡聚糖或者类似类型的基质组成，贴壁细胞能够贴壁于其上而进行2D生长。优选地，所述微载体的表面特征经过优化，适于细胞高效粘附和伸展；或其大小和密度经过优化，有利于均匀悬浮，适于宽范围的细胞优良生长和高产；或其基质是生物惰性的，为搅拌培养提供了一个坚硬但是非刚性的底物；或其本身是透明的，从而贴附的细胞可基于简单的显微镜就能观察到。

本发明中，所述的培养基可以是病毒生产细胞常用的一些培养基，只要其能够为病毒生产细胞的生长以及病毒的生产/扩繁提供足够的营养成分。在优选的方式中，所述的培养基包括DMEM培养基(基础的或改良的，如Iscove改良DMEM培养基)、VP-SFM培养基或Pesche培养基。其它的培养基也可以包括例如：M199、RPMI1640、MEM OptiPro培养基、Episerf培养基、Ex-cell MDCK培养基、Ex-Cell Vero培养基、MP-BHK无血清培养基、SFC-10BHK无表达血清培养基、SFC-20BHK无表达蛋白质培养基、HyQPFVero培养基、HycloneSFM4Megavir培养基、MDSS2培养基培养基、Ham’s营养培养基、LeibovitzL-15培养基培养基、ProVero培养基或PowerMDCK培养基等。所述的培养基可以含(如10％(v/v)胎牛血清，或低浓度的胎牛血清)或不含血清。

本发明中，所述的培养容器可以是不同规模形式的，包括较小规模、普通规模或较大规模，例如，本发明的实施例中提供了两种不同规模的示范，包括3L和7L规模的培养容器(生物反应器)的培养。但主要目的是在工业规模上进行生产时，所述的培养容器可以是3升–1000升之间的生物反应器。

在优选的实施方式中，培养容器中配备搅拌系统(机械、借助于空气流等)，其允许使微载体维持悬浮于细胞培养基中，并且设有根据培养需要用于更新培养基的工具和/或用于控制且调节温度、pH、氧压力、任选排出氮或空气、和代谢产物或营养素(乳酸盐、葡萄糖、谷氨酰胺、铵离子等)的工具。这些装置可以采取本领域已知的运行模式，本领域技术人员知道如何根据使用的器皿大小和构造来使用它们。例如，根据本发明的培养器皿可以为摇瓶形式(旋转器)或生物反应器的形式。

基于本发明人的新发现，揭示了一种生产病毒的方法，包括：在培养容器(如生物反应器)中，以病毒生产细胞生产病毒，以电容值确定病毒生产的工艺节点；所述的工艺节点为：病毒接种时机，病毒收获时机。

作为一种优选实施方式，本发明提供一种利用电容值确定病毒(如HSV)生产工艺节点的方法包括如下：(1)根据工艺开发规定的接毒时细胞密度以及推荐范围，结合已建立的反应容器中细胞培养阶段的活细胞密度与电容值的数据关系模型计算得出接毒时电容值以及可操作的范围；(2)电容值达到范围后向反应器中接入毒种；(3)根据接毒后电容值峰值，并结合细胞病变确定收获电容值及其范围；(4)在本发明规定的基于电容值的节点进行收获。

作为本发明的优选方式，所述方法包括：(1)在培养容器中，将病毒生产细胞在微载体上贴壁培养，测定细胞电容值；对应3±2g/L微载体，当电容值为50-90pF/cm时，接种病毒，进行病毒生产；(2)测定细胞电容值，记录电容峰值；当电容值降至电容峰值的10-5％，优选地9-6％(如8％、7％、6％)时，收获病毒。

作为本发明的优选实施例，提供一种利用微载体培养Vero细胞的工艺。本工艺中使用的微载体为葡聚糖基质的Cytodex系列微载体，密度3.0-5.0g/L，培养容器为搅拌釜式生物反应器，培养体积为反应罐容器的50％-60％，所用培养基为适用于Vero细胞贴壁生长的培养基。所述方法包括如下1.1-1.2的方法：

1.1将微载体在培养基中，以37℃，pH 6.5-7.4，适当搅拌速度(50-120rpm)下平衡4h及以上，使得微载体达到适宜细胞贴附的状态；

1.2接着以0.15±0.10E5 cell/cm

作为本发明的优选实施例，提供利用电容值确定微载体上HSV生产工艺的接毒节点的方法。所述方法包括如下2.1-2.3的方法：

2.1通过所述1.2方式进行多频取测并记录活细胞密度(VCD)与电容值，建立细胞密度和电容值的线性关系模型；

2.2接着，根据在线读取的电容值即可推算当前反应器中的细胞密度，进而实现在线监测细胞密度。

2.3结合工艺开发中确定的HSV病毒生产工艺中最佳接毒时细胞密度(CCI)，即可计算出接毒时目标电容值，通过在线电容值快速判断是否满足接毒要求。

作为本发明的优选实施例，提供利用电容值确定微载体上HSV生产工艺的收获节点的方法，包括：在完成接毒操作后，电容值将出现上升并在一定时间内达到Peak，当病毒开始扩增引起细胞发生病变后，部分细胞的细胞膜完整性受到破坏，电容值会随之下降。当电容值达到接毒后电容值峰值的7％时，即可收获。本发明该优选实施例中涉及的收获策略为：收获节点为电容值达到接毒后电容值峰值的7％-6％。

本发明的方法制备获得的病毒，可进一步用于制备疫苗或药物。

基于本发明的技术方案，也可进行培养容器的自动化改造，例如在培养容器中设置自动或定时定点检测电容器的仪器/装置，对于既定的待培养细胞以及待生产的病毒，进行电容值、电容峰值的监测和输出。同时，也可设置基于该仪器/装置的测定结果进行自动病毒接种和/或病毒收获的装置，其能够接收所述电容器的仪器/装置输出的信号，在适于病毒接种和/或适于病毒收获的时间节点进行自动操作。此类基于本发明的技术方案所改造的装置也被涵盖在本发明的范围内。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

在微载体工艺中，取测误差和计数误差会导致MOI偏差，最终影响病毒侵染后工艺表现和产品产量及质量的批次间稳定性。特别是在接毒细胞密度(CCI)范围小的病毒类生产工艺中，在接毒前需频繁取测，工艺不友好。同时，现有的微载体病毒生产工艺中，主流工艺仍然是根据培养时间或根据取测进行显微镜观察细胞病变(CPE)程度确定收获节点。这类工艺存在的潜在风险主要是：1.固定培养时间无法及时根据工艺过程中由于细胞监测误差，放大过程中参数控制的细微差异等引起的工艺表现差异进行调整，进而影响最终产品的产量及质量；2.显微镜观察虽然比较直观，但是主观性大，且在微载体生产病毒的工艺上因显微镜视野的局限性导致以CPE确定收获时间的工艺更具挑战。

而本发明中，基于电容电极在体现完整细胞密度和细胞直径的变化上的应用推断在病毒生产中，由于病毒侵染、扩增导致细胞病变，从而引起的细胞形态、直径、活率、密度等的变化也能反映在电容值变化上。本发明利用电容电极值确定微载体上HSV病毒生产工艺中的接毒和收获两大重要工艺节点。电容电极能够监测工艺全过程，在得到电容值与VCD的关系模型后即可结合接毒工艺确定接毒的电容值及范围，进而实现最多一次取测即可完成接毒操作；将侵染后细胞病变的程度以电容值与接毒后峰值比值的形式进行反馈，这大大提升了收获工艺和产品质量的稳定性，实现在无需取样观察的情况下，即可在病毒生产工艺中进行收获操作，以实现工艺控制。

本发明的方法可方便地进行生产过程在线监测，通过电容值和细胞密度拟合曲线，主要用于检测培养液中细胞密度，具有拟合度高、操作便捷、成本低等优点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下为本发明具体实施方式的详细说明。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1、电容值指导病毒接种以及病毒收获(3L生物反应器)

一、设备、材料和方法

本实施例中，所用的通用材料和方法如下：

电容电极：ABER FUTURA system。

细胞计数设备：ChemoMetec NC-200。

细胞：Vero细胞。

细胞培养基：含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。

生物反应器：Applikon 3L搅拌釜式生物反应器。

生物反应器中培养体积：1800mL。

微载体：葡聚糖基质的Cytodex-1。

生物反应器中微载体密度：3.0g/L。

生物反应器中微载体表面接种细胞密度为0.24E5 cells/cm

产毒时的毒种的滴度：1.10E7 pfu/mL。

产毒MOI(病毒添加量)：0.01。

接毒时细胞密度目标值：1.98E6 cells/mL，即1.5E5 cells/cm

病毒收获方法：接毒后以CPE 90％或者接毒后48h为收获标准进行收获(优化前)。

二、接毒和收获时的电容值分析

1、接毒时的电容值分析

本发明人通过前期很多次的生物反应器的实验、生产结果，分析了一系列的反应参数。之后，获得生物反应器中活细胞密度与电容值关系模型，如图1所示。

根据该模型，结合接毒时的最适细胞密度范围(1.32-1.98E6 cells/mL)，得到接毒时的操作电容值范围为53-84pF/cm。计算得到接毒时目标电容值为84pF/cm。

2、收获时的电容值分析

本发明人通过前期很多次的生物反应器的实验、生产结果，根据病毒收获情况，分析得出，电容值下降至接毒后电容值峰值(peak)的7％-6％范围，此时进行病毒收获最为理想。

三、电容值指导下的病毒接种以及病毒收获

1、细胞培养、接种病毒(接毒)

(1)按照前述“设备、材料和方法”中所述进行细胞培养。生物反应器内先加入培养液和微载体，以37℃，pH控制范围6.5-7.4，搅拌速度50-120rpm下平衡4h，使得微载体达到适宜细胞贴附的状态。

(2)以0.15E5 cell/cm

(3)电容值达到53-84pF/cm范围(本实施例中接毒时电容值为84pF/cm)后，对反应器进行取样测定细胞密度。并根据MOI 0.01进行毒种添加量计算，毒种融化方式：常温水浴6-10min。取对应体积毒种加入DMEM基础培养基中，混匀获得毒种稀释液，毒种稀释液总体积为80％当前培养体积。

(4)停止反应器的搅拌、通气、温度、pH和DO控制，使所述贴附有Vero细胞的微载体自然沉降。除去反应器中80％当前培养体积的上清液(利用压力装置泵出溶液)，加入80％当前培养体积的DMEM基础培养基。开启搅拌5-10min进行润洗。此润洗步骤进行2次。

(5)停止搅拌，使微载体自然沉降。除去反应器中80％当前培养体积的上清液(利用压力装置泵出溶液)，加入毒种稀释液。开启反应器的搅拌、通气、温度、pH和DO控制，在35℃继续培养及进行病毒生产。

2、病毒生产、收获

上述“(5)”后，培养及病毒生产持续进行，期间观测电容值，检测不同电容值下收获的样品的滴度；记录接毒后的电容峰值为77pF/cm。

将测定所得效价与最佳感染效价进行比较，将测定所得的颗粒数与最佳颗粒数比较，将收获产物的质量与最佳收获产物的质量比较，最佳感染效价、颗粒数以及收获产物的质量均通过分析本批次的多批收获液得出。其中，产品效价为活性滴度(pfu/mL)，检测方法为空斑法；产品质量为活性滴度(pfu/mL)/颗粒数(copies/mL)，颗粒数检测方法为荧光定量PCR法。

最高滴度和质量出现在收获电容比值为7％时(即：电容峰值的7％时)，符合本实施例的收获策略。

如图2，值得注意的是，电容比值在7％-6％(即：电容峰值的7％-6％时)范围内时，收获较为合适；收获电容比值不在7％-6％的范围内时，滴度和质量均发生了下降现象，证明已不属在最佳收获区间。

根据图2，所述利用电容值确定微载体上HSV生产工艺的收获节点策略、即收获Target为电容值达到接毒后电容值峰值的7％-6％时，是显著优异的。

作为验证，本发明人进行了与传统收获策略(根据细胞病变(CPE)收获)的对比。其它条件均不变化，仅改变收获病毒时的策略，在接毒后观测培养体系，通过显微镜观察细胞病变程度确定收获工艺，当观测到发生90％CPE时收获病毒；根据电容值收获则是在接毒后电容值峰值的7％时进行收获。

如图6，当按照传统的根据细胞病变(CPE)判断收获的方法，发生90％CPE时收获病毒，经测定此时的电容值为14％，还未达到最佳效价、最佳颗粒数和最佳质量；而当电容值7％时，其效价、颗粒数及质量显著更优。

实施例2、电容值指导病毒接种以及病毒收获(7L生物反应器)

一、设备、材料和方法

本实施例中，所用的通用材料和方法如下：

电容电极：ABER FUTURA system。

细胞计数设备：ChemoMetec NC-200。

细胞：Vero细胞(ATCC)。

细胞培养基：含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。

微载体：Cytodex-1。

生物反应器：Applikon 7L搅拌釜式生物反应器。

生物反应器中培养体积：4200mL。

生物反应器中微载体密度：3.0g/L。

生物反应器中微载体表面接种细胞密度：0.14E5 cells/cm

产毒时的毒种的滴度：1.10E7 pfu/mL。

产毒MOI(病毒添加量)：0.01。

接毒时细胞密度范围：1.32-1.98E6 cells/mL。

病毒收获方法：接毒后以CPE 90％或者接毒后48h为收获标准进行收获(优化前)。

二、电容值指导下的病毒接种以及病毒收获

1、细胞培养、接种病毒(接毒)

(1)按照前述“设备、材料和方法”中所述进行细胞培养。生物反应器内先加入培养液和微载体，以37℃，pH控制范围6.5-7.4，搅拌速度50-120rpm下平衡4h，使得微载体达到适宜细胞贴附的状态。

(2)以0.15E5 cell/cm

(3)电容值达到53-84pF/cm范围(本实施例中接毒时电容值为68pF/cm)后，对反应器进行取样测定细胞密度。根据MOI 0.01进行毒种添加量计算，毒种融化方式：常温水浴6-10min。取对应体积毒种加入DMEM基础培养基中，混匀获得毒种稀释液，毒种稀释液总体积为80％当前培养体积。

(4)停止反应器的搅拌、通气、温度、pH和DO控制，使所述贴附有Vero细胞的微载体自然沉降。除去反应器中80％当前培养体积的上清液(利用蠕动泵泵出溶液)，加入80％当前培养体积的DMEM基础培养基。开启搅拌5-10min进行润洗。此润洗步骤进行2次。

(5)停止搅拌，使微载体自然沉降。除去反应器中80％当前培养体积的上清液(利用蠕动泵泵出溶液)，加入毒种稀释液。开启反应器的搅拌、通气、温度、pH和DO控制，在35℃继续培养及进行病毒生产。

2、病毒生产、收获

上述“(5)”后，培养及病毒生产持续进行，期间观测电容值，检测不同电容值下收获的样品的滴度；记录接毒后的电容峰值为64pF/cm。

通过检测不同电容值下收获的样品的滴度，本实施例中收获的电容值涉及接毒后电容峰值的13％-5％(图3)，最高滴度和质量出现在收获电容比值为6％时(即：电容峰值的6％时)。

如图3，值得关注的是，电容比值在7％-6％(即：电容峰值的7％-6％时)范围内时，收获较为合适；收获电容比值不在电容峰值的7％-6％范围内时，滴度虽可维持在接近的水平，但颗粒数已呈现下降趋势，证明已不属最佳收获点。

作为验证，本发明人将上述根据电容值进行收获的策略与传统收获策略(根据时间收获)进行对比。传统收获策略中，其它条件均不变化，仅改变收获病毒时的策略，在固定的时间收获(接毒后48小时，hpi)；根据电容值收获则是在接毒后电容值峰值的7％时进行收获。

如图4所示，将本发明的收获策略与传统收获策略(依据时间收获)相比较，依据本发明的收获策略进行收获，收获时病毒活性滴度相当但病毒颗粒效价提升了37％，对比传统按照时间策略收获更早，更好保留病毒颗粒完整性。

传统收获策略的收获时间区间为48h；而实验数据表明对应电容比值7％时43h时已经出现了滴度和质量最佳，随后逐渐出现了产品质量下降的前兆，病毒颗粒数下降。所以，采用本发明策略可以很好的克服批次间产品的稳定性差这一挑战。

作为验证，本发明人进行了与传统收获策略(根据细胞病变(CPE)收获)的对比。其它条件均不变化，仅改变收获病毒时的策略，在接毒后观测培养体系，通过显微镜观察细胞病变程度确定收获工艺，当观测到发生90％CPE时收获病毒；根据电容值收获则是在接毒后电容值峰值的7％时进行收获。

图5为不同收获策略对比图(CPE收获vs.电容收获)，若通过显微镜观察细胞病变程度确定收获工艺，预期的最佳收获CPE为90％，而此时病毒效价与质量并不在最佳状态。采用本发明策略，不仅可以简化收获工艺，还可以提升批次间产品稳定性。将本发明的收获策略与传统收获策略(CPE收获)相比较，依据本发明的收获策略进行收获，收获时病毒效价提升了29％。

如图6，当按照传统的根据细胞病变(CPE)判断收获的方法，发生90％CPE时收获病毒，经测定此时的电容值为13％，还未达到最佳效价、最佳颗粒数和最佳质量；而当电容值7％时，其效价、颗粒数及质量显著更优。

以上实施例1(3L生物反应器)和实施例2(7L生物反应器)表明，本发明的收获策略在微载体工艺的稳定性和可放大性上表现优异。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。