一种EPI辅助定性的同时测定烟用香精香料中小分子糖和有机酸的分析方法

技术领域

本发明属于烟用香精香料的成分分析技术领域，主要涉及烟用香精香料中糖和有机酸的同时定性定量分析。具体说是一种无需衍生的，可以同时测定烟用香精香料中糖和有机酸两类组分的LC-MS/MS分析方法。

背景技术

部分烟用香精香料中含有较高含量的小分子糖、有机酸等组分，虽然这些组分挥发性较弱对于卷烟嗅香的影响不大，但在卷烟燃吸后对于提高烟气舒适性、改善吃味品质等方面起到了不可替代的作用，因此，有必要对香精香料中的糖和有机酸进行精确定量分析。

现有的方法对于糖和有机酸两类物质一般单独分析。其中糖类一般用液相色谱直接分析或两步衍生处理后GC-MS分析，有机酸一般需要酯化衍生后用GC-MS分析，复杂的衍生步骤导致分析工作耗时耗力，对操作人员的要求也更高。如行业标准YC/T 447-2012

基于此，我们依托LC-MS/MS技术，通过不同类型色谱柱和流动相的考察，建立了一种EPI二级质谱辅助定性，且满足同时测定烟用香精香料中小分子糖和有机酸组分的定量分析方法，其前处理无需衍生，操作简单，为香精香料成分分析工作提供一种快速的糖和有机酸组分的定性定量分析方法。

YC/T 447-2012烟草及烟草制品麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的测定高效液相色谱蒸发光检测器法[S]

潘科,方仕茂,刘忠英,等.基于GC-MS/MS分析加工对古茶树红茶可溶性糖含量的影响[J].福建农林大学学报(自然科学版),2021,50(04):490-496.

YC/T 288-2009烟草即烟草制品多元酸(草酸、苹果酸、柠檬酸)的测定气相色谱法[S]

汤晓东,苏燕,张丽娜,等.GC-MS法分析烟用香精中10种有机酸[J].烟草科技,2021,54(04):49-56.

发明内容

本发明旨在提供一种可同时测定烟用香精香料中糖和有机酸组分的LC-MS/MS分析方法，该方法无需衍生化操作，能快速、准确、同时测定烟用香精香料中的小分子糖和有机酸，测定结果准确，操作简单易推广。

本发明的技术方案如下：

一种烟用香精香料中糖和有机酸的同时测定方法，包括以下步骤：

A、样品制备：取烟用香精香料样品，加入水超声提取，静置取上清液，过0.22μm水相滤膜后用水稀释，得到样品提取液储存于色谱小瓶中备用；

优选烟用香精香料样品与超声提取用水的质量体积比为1：200，g/mL；优选超声提取的时间为30min；

优选上清液过0.22μm水相滤膜后分别用水稀释5、50、500倍；

B、标准工作溶液制作：称取各种糖和有机酸的标准品，置于同一容量瓶中，用甲醇溶解并定容，然后用水稀释并最终配制成具有浓度梯度的各种糖和有机酸的标准工作溶液；

具体的，糖为如下7种小分子糖：葡萄糖、山梨糖醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖；有机酸为如下10种：苹果酸、丙二酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸、乙酰丙酸、己二酸、香草酸；

优选标准工作溶液的配制方式如下：分别称取0.010g(精确至0.1mg)各种糖和有机酸标准品，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容得到浓度为1mg/mL的混合标准溶液A；准确移取0.1mL混合标准溶液A于10mL容量瓶中，用水定容，配制成各目标物浓度为10μg/mL的混合标准溶液B；准确移取0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL和2mL的混合标准溶液B，置于10mL容量瓶中，用水定容，即得系列标准工作溶液；配制的系列标准工作溶液的浓度为0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL；

C、LC-MS/MS测定：吸取配制好的不同浓度的标准工作溶液和样品提取液，进LC-MS/MS分析，扫描方式MRM-IDA-EPI，以定量子离子进行定量分析，以EPI二级质谱库进行辅助定性；

在LC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：Synergi Hydro-RP液相色谱柱(250×4.6mm，4μm)；流动相：0.1％(v/v)甲酸水溶液(A)，0.1％(v/v)甲酸甲醇(B)；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL；梯度洗脱程序：0～3min，97％A；3～4.5min，97％～88％A；4.5～5.5min，88％A；5.5～9min，88％～50％A；9～10min，50％A；10～13min，50％～10％A；13～15min，10％A；15～15.5min，10％～97％A；15.5～20min，97％A；

采用的质谱条件为：离子源：ESI源，负离子模式；喷雾电压：-4500V；离子源温度：500℃；雾化气压力60psi，气帘气压力35psi，辅助加热气压力60psi；碰撞气浓度设置为High；扫描方式：MRM-IDA-EPI，多反应监测-信息依赖采集-增强子离子扫描；

7种小分子糖和10种有机酸的保留时间、MRM定量离子质谱参数见表1：

表1 7种小分子糖和10种有机酸的保留时间和MRM定量离子参数

7种小分子糖和10种有机酸的EPI二级质谱图如图1～图17所示，样品测定时目标物定性依靠保留时间和EPI二级质谱库进行；

D、糖和有机酸测定结果的计算：以外标法进行糖和有机酸目标物的定量分析，即：以目标物定量子离子的峰面积和其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对不同稀释倍数的样品提取液进行测定，根据实际响应选择合适的样品提取液中目标物的峰面积，代入标准曲线，求得样品中糖和有机酸的含量。

本发明方法的定量限：

取标准工作溶液最低点，LC-MS/MS连续进样10针，计算各个目标物峰面积响应的标准偏差(SD)，以10倍标准偏差对应的浓度记为定量限(LOQ)，定量检出限在0.015μg/mL～0.037μg/mL之间。

本发明方法的重复性和加标回收率：

在烟用香精香料样品中加入糖和有机酸标准溶液(实际加标浓度为0.5μg/mL)，然后对香精样品原样和加标样品分别进行前处理和LC-MS/MS分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可知，小分子糖和有机酸的回收率在71.2％～108.2％之间，相对标准偏差(RSD)在1.3％～8.3％之间，说明本方法的回收率高、重复性好。

表2小分子糖和有机酸的定量限、回收率和重复性(n＝6)

本发明的方法利用LC-MS/MS实现了烟用香精香料中小分子糖和有机酸的同时检测，与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：

a)本发明方法首次公开了一种同时分析烟用香精香料中小分子糖和有机酸的LC-MS/MS定性定量分析方法，一次进样可同时分析7种小分子糖和10种有机酸(包含烟用香精香料中检出率较高且含量较高的目标物，如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、苹果酸、柠檬酸、乳酸等)。

b)本发明方法采用EPI二级质谱库辅助定性，比MRM方法定性更全面。

c)本发明方法前处理步骤简单，无需衍生，提升了烟用香精香料成分分析的检测效率。

d)本发明方法中针对鼠李糖、阿拉伯糖等响应偏低的糖类化合物，选择其[M+HCOOH-1]

e)本发明方法前处理过程中对提取液分别稀释5-500倍后进样，并通过实际响应选择合适的稀释倍数进行定量分析，有效解决了部分目标物含量过高、目标物相互之间含量差异较大的问题。

附图说明

图1～图17：7种小分子糖和10种有机酸的EPI二级质谱图。

图18：EPI辅助定性的同时测定烟用香精香料中糖和有机酸的分析方法的流程示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：

1、仪器与试剂

糖和有机酸标准品：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨糖醇、苹果酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、富马酸、丙二酸、丁二酸、己二酸、乙酰丙酸、香草酸，均为标准品(纯度>95％)；甲醇、甲酸，均为色谱纯试剂；纯水，符合GB/T 6682中一级水的要求。

美国Agilent 1260HPLC接美国AB公司Qtrap5500线性离子阱-三重四极杆质谱仪(LC-MS/MS)；昆山KQ-500DB型超声波发生器；德国Sigma高速冷冻离心机。

2、样品制备

称取0.1g烟用香精香料样品A于50mL锥形瓶中，加入20mL水后超声提取30min，静置取上清液，过0.22μm水相滤膜后分别用水稀释5、50和500倍，储存于2mL色谱小瓶中备用；

3、准备标准工作溶液

称取0.010g(精确至0.1mg)各种糖和有机酸标准品，置于同一10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容得到浓度为1mg/mL的混合标准溶液A；准确移取0.1mL混合标准溶液A于10mL容量瓶中，用水定容，配制成各目标物浓度为10μg/mL的混合标准溶液B。准确移取0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL和2mL的混合标准溶液B，置于10mL容量瓶中，用水定容，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL。

4、LC-MS/MS测定

将配制好的不同浓度的标准工作溶液进LC-MS/MS，以EPI二级质谱库进行辅助定性，以外标法进行糖和有机酸的定量分析，即以目标物定量子离子的峰面积和其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对不同稀释倍数的样品提取液进行测定，根据实际响应选择合适的样品提取液中目标物的峰面积，代入标准曲线，求得样品A中糖和有机酸的含量见表3。

表3烟用香精香料样品A中小分子糖和有机酸的检测结果

注：“——”表示未检出。

在LC-MS/MS测定时，采用的色谱条件为：色谱柱：Synergi Hydro-RP液相色谱柱(250×4.6mm，4μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，0.1％甲酸甲醇(B)；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL；梯度洗脱程序：0～3min，97％A；3～4.5min，97％～88％A；4.5～5.5min，88％A；5.5～9min，88％～50％A；9～10min，50％A；10～13min，50％～10％A；13～15min，10％A；15～15.5min，10％～97％A；15.5～20min，97％A。

采用的质谱条件为：离子源：ESI源，负离子模式；喷雾电压：-4500V；离子源温度：500℃；雾化气压力60psi，气帘气压力35psi，辅助加热气压力60psi；碰撞气浓度设置为High；扫描方式：MRM-IDA-EPI，多反应监测-信息依赖采集-增强子离子扫描。

7种小分子糖和10种有机酸的保留时间、MRM定量离子质谱参数见表1，EPI二级质谱图见图1～图17。

实施例2：

如实施例1所述，选择另一烟用香精香料样品B，测定其小分子糖和有机酸的含量见表4。

表4烟用香精香料样品B中小分子糖和有机酸的检测结果

注：“——”表示未检出。

实施例3：

如实施例1所述，选择另一烟用香精香料样品C，测定其小分子糖和有机酸的含量见表5。

表5烟用香精香料样品C中小分子糖和有机酸的检测结果

注：“——”表示未检出。