一种用于治疗糖尿病肾病的川芎提取物及其制备方法

技术领域

本发明属于川芎提取物的制备技术领域，具体涉及一种用于治疗糖尿病肾病的川芎提取物及其制备方法。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病微血管病变所诱发的并发症，临床特征为不同程度的蛋白尿、肾小球硬化及肥大、肾脏纤维化等退行性改变，进而增加慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)和终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的发生风险，同时增加了患者早亡的风险，带来巨大的社会经济负担。临床治疗手段主要通过控制血糖、血压和血脂，一线用药也多为降血糖、降压药物来延缓DN病变，但无法有效阻断DN病理进展。DN发展至终末期肾脏疾病，只能采用透析和肾脏移植治疗，严重影响患者的生活质量。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种用于治疗糖尿病肾病的川芎提取物及其制备方法。通过采用特定的提取、精制和有效组分分离纯化方法，使得有效成分含量相对提高，同时保持各有效组分之间的含量比例稳定，从而显著提高药效、减少药物服用量并确保药物质量稳定。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

第一方面，本发明提供一种用于治疗糖尿病肾病的川芎提取物的制备方法，包括如下步骤：

采用65％-95％的乙醇溶液作为提取溶剂，在20-30℃下将川芎浸泡3-5h，然后在50-100℃下回流提取2-4h，得提取液；

对提取液进行精制、浓缩干燥，得川芎的乙醇提取物；

采用大孔吸附树脂柱对所述川芎的乙醇提取物进行分离纯化，收集各部分洗脱液；

将各部分洗脱液浓缩、干燥，得各部分提取物；

采用QR诱导活性实验与NO生成抑制实验对所得的各部分提取物进行筛选，得到目标组分。

65％-95％乙醇为体积百分数。乙醇浓度过小会导致糖类等水溶性成分多，而苯酞类成分等小极性化合物提取不完全。

在加热回流之前用提取溶剂浸泡后有利于各种有效的成分析出,缩短煎煮的时间。

提取温度是提取的重要环节，温度过低可能会降低药效物质的溶解和扩散速度，不利于浸出；但过高的温度也会使某些有效成分受到而失效，同时高温提取时，无效成分、辅助成分的浸出量也会增多，这不仅会增加提取物中的杂质，而且会给后期的精制造成困难。

选用大孔树脂是因为大孔树脂具有价廉、可重复利用等特点，且洗脱剂为水-乙醇，价廉、无毒、安全性高，相较于其他分离手段更适合大规模工业生产。

在一些实施例中，所述提取溶剂的质量为川芎质量的8-12倍。提取时溶剂过少会导致药效物质提取不完全，降低收率；溶剂过多会导致后续旋蒸干燥时间久，提取过程费时费力、浪费资源。

在一些实施例中，提取温度为70-90℃。

在一些实施例中，所述精制的方法为活性炭吸附澄清法或减压抽滤法。

在一些实施例中，所述大孔吸附树脂柱为D101、D201、D301、HPD-100、HPD-400、HPD-BJQH、AB-8。

优选的，所述大孔吸附树脂柱为HPD-100、HPD-400、D101。

优选的，采用大孔吸附树脂柱进行分离时，洗脱液为体积分数为60％-70％乙醇，洗脱量为3-5BV，洗脱流速为1.5-2.5BV/h；

进一步优选的，洗脱液为体积分数为67％-70％乙醇；

更进一步优选的，洗脱液为体积分数为67.5％乙醇。

在一些实施例中，所述干燥为真空干燥或冷冻干燥。

第二方面，本发明提供一种用于治疗糖尿病肾病的川芎提取物，由所述制备方法制备而成，其包括1”-乙氧基-芎萘呋内酯(1”-ethoxy-wallichilide)和3-亚丁基-6-羟基-7-乙氧基苯酞(3-butylidene-6-hydroxy-7-ethoxy-phthalide)，其中，1”-乙氧基-芎萘呋内酯(1”-ethoxy-wallichilide)和3-亚丁基-6-羟基-7-乙氧基苯酞(3-butylidene-6-hydroxy-7-ethoxy-phthalide)的结构式分别如下所示：

优选的，所述川芎提取物的活性成分包括ligusticumolide C、川芎内酯A、6S,7S-3-丁基-3,6,7-三羟基-4,5,6,7-四氢苯甲酰胺、川芎内酯L3、洋川芎内酯M、硫代洋川芎内酯A、洋川芎内酯E、川芎内酯L2、洋川芎内酯C、(-)-all0aromadendrane-4β,10α,13,15-tetrol、洋川芎内酯A、Z-藁本内酯、东当归内酯B和欧当归内酯A。

第三方面，本发明提供一种糖尿病肾病药物，其活性成分包括所述川芎提取物。

剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液中的一种。

上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：

为了从川芎中发现活性组分，采用大孔树脂对川芎进行分离制备，采用QR诱导活性实验与NO生成抑制实验检测每个组分的体外抗炎抗氧化能力，最终选择出活性最强的有效组分，采用UPLC-MS/MS和HPLC对该组分进行成分鉴定，鉴定出其包含苯酞类、酚酸类等化合物，还鉴定出两种新化合物。随后探究该组分对糖尿病肾病的体内有效性，并开发出具有治疗或预防糖尿病肾病的药物或保健品。

制备得到的提取物可以减轻糖尿病肾病小鼠肾小球肥大，肾脏肥大以及炎症细胞聚集；可以减轻糖尿病肾病小鼠肾脏纤维化与基质扩张。在糖尿病诱发神经病变中，提取物可以降低糖尿病肾病小鼠大脑中氧化应激水平，增加DN小鼠脑组织中SOD、CAT活性，减少脂质过氧化物MDA产生，通过这一抗氧化作用起到神经保护作用。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明川芎提取条件工艺优化流程图；

图2是本发明实施例2中，各组分的NO生成抑制活性(a)与QR诱导活性(b)；

图3是本发明实施例2中有效组分成分液质分析图谱；

图4是本发明实施例4中有效组分对DN小鼠体重(a)、血糖(b)的影响曲线对比图。其中，空白组为正常野生C57BL/6对照小鼠，模型为DN模型小鼠，阳性药组为DN小鼠灌胃卡托普利组，有效组分低剂量组为DN小鼠灌胃10mg/kg组，有效组分高剂量组为小鼠灌胃20mg/kg组，川芎提取物为DN小鼠灌胃川芎乙醇提取物20mg/kg组。

图5是本发明实施例6中DN小鼠肾脏HE染色图，可以看出有效组分能减轻DN小鼠肾小球肥大和肾脏肥大。其中空白组为正常野生C57BL/6对照小鼠，模型为DN模型小鼠，阳性药组为DN小鼠灌胃卡托普利组，有效组分低剂量组为DN小鼠灌胃10mg/kg组，有效组分高剂量组为小鼠灌胃20mg/kg组，川芎提取物为DN小鼠灌胃川芎乙醇提取物20mg/kg组。

图6为本发明实施例6中DN小鼠肾脏PAS染色图，可以看出有效组分能减轻DN小鼠基质扩张。其中空白组为正常野生C57BL/6对照小鼠，模型为DN模型小鼠，阳性药组为DN小鼠灌胃卡托普利组，有效组分低剂量组为DN小鼠灌胃10mg/kg组，有效组分高剂量组为小鼠灌胃20mg/kg组，川芎提取物为DN小鼠灌胃川芎乙醇提取物20mg/kg组。

图7为本发明实施例7中有效组分对DN小鼠肾组织中纤维化指标TGF-β1、α-SMA以及抗氧化经典通路Nrf2及其下游蛋白NQO1、GCLM的影响对比图。其中，空白组为正常野生C57BL/6对照小鼠，模型为DN模型小鼠，阳性药组为DN小鼠灌胃卡托普利组，有效组分低剂量组为DN小鼠灌胃10mg/kg组，有效组分高剂量组为小鼠灌胃20mg/kg组，川芎提取物为DN小鼠灌胃川芎乙醇提取物20mg/kg组。

图8是本发明实施例8中有效组分在细胞水平抑制LPS所诱导的NF-κB信号通路的激活。其中空白组为正常的RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)，阳性对照药为Didox，3、6、12、24为有效组分加药浓度(μg/mL)。

图9是新化合物1”-乙氧基-芎萘呋内酯(1”-ethoxy-wallichilide)的表征图，其中，a为质谱图；b为

图10是新化合物3-亚丁基-6-羟基-7-乙氧基苯酞的表征图，其中，a为质谱图；b为

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1有效组分的制备

10kg川芎药材(原料质量符合《中华人民共和国药典》2020版(一部)的规定)粉碎，室温浸泡4小时，提取溶剂用量为药材重量的10倍，用单因素实验考察提取乙醇浓度、提取温度、提取时间以及回流次数的影响，具体考察参数如图1，通过对以上几个变量的考察，最终选择出最佳工艺：每次溶剂用量为药材重量的10倍，每次提取时间为3小时，回流两次，乙醇浓度为75％，提取温度85℃；合并提取液，采用活性炭吸附澄清法与减压抽滤法对提取液进行精制，得精制液，将精制液浓缩干燥，得川芎乙醇提取物。

考虑到大孔树脂具有价廉、可重复利用的特点，适合大规模工业生产，因此选用大孔树脂进行粗分，选用了7种类型的大孔树脂进行分离，分别为D101、D201、D301、HPD-100、HPD-400、HPD-BJQH、AB-8，洗脱剂为乙醇-水(0-100％)，将所得到的流分用QR活性诱导实验与NO生成抑制实验初步评测不同类型大孔树脂对于抗炎抗氧化组分的富集程度，再结合每种大孔树脂的收率，得到HPD-100、HPD-400、D101等类型大孔树脂最优，随后进行了过大孔树脂柱工艺考察。

首先为最优洗脱浓度的确定：洗脱剂为乙醇-水，梯度范围根据活性追踪依次减小，筛选出最优的洗脱浓度，首先是体积百分比分别是0％、30％、50％、70％、85％、100％的乙醇溶液，根据活性筛选结果锁定活性部位集中于乙醇含量为50％-70％部分，进一步缩小洗脱比例范围，设定以下洗脱比例：50％、52.5％、55％、57.5％、60％、62.5％、65％、67.5％、70％，对这九个组分进行QR活性筛选和NO生成抑制测定，发现活性最优的部分为乙醇浓度为67.5％时洗脱下的组分，因此确定出最优洗脱浓度是体积百分比为67.5％的乙醇-水溶液，洗脱量为4BV，洗脱流速为2BV/h，收集洗脱液，取洗脱液减压浓缩至恒重，得到有效组分。

图2为大孔树脂多个流分QR活性诱导实验与NO生成抑制实验结果。在96孔板中接种Hepa 1c1c7细胞置37℃培养箱中孵育过夜。待细胞密度达到75％左右时，加入不同浓度的待测化合物，孵育24小时。将培养基吸出，加入30μL细胞裂解液(2mM EDTA溶液和0.8％毛地黄皂苷)，然后置于培养箱中孵育15分钟。之后加入170μL完全反应混合物(牛血清白蛋白，7.5mM FAD，150mM葡萄糖-6-磷酸，1.5％吐温20，50mM甲萘醌，MTT，0.5M Tris-HCl，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及50mM NAPDH)。室温放置4min后使用酶标仪在630nm波长下，测定溶液吸光度，*表示处理组与空白组比较有显著性差异(p<0.05)。

在96孔板A中接种RAW 264.7小鼠巨噬细胞。等到细胞贴壁后加入含不同浓度的待测化合物和含LPS(1μg/mL)培养基，置于培养箱中孵育24小时。取100μL上清液加进96孔板B中，然后加入100μLGriess试剂(0.1％萘乙二胺、5％磷酸、1％磺胺)孵育15分钟。使用酶标仪在570nm波长下测定溶液吸光度。并用MTT实验检测96孔板A中细胞生存率。在本实验中，Didox(100μM)作为阳性对照药，用NaNO

实施例2对有效组分进行定性分析

表1液质分析结果成分指认

此处有效组分是按照上述实施例1中制备工艺所得，接下来对有效组分进行定性分析：

BEH Shield RP18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm，Waters)。

流动相：乙腈(A)-水(B)，洗脱条件：0-2min，2-15％A；2-20min，15-55％A；20-45min，55-100％A。

结果：如图3、图9、图10和表1所见，主峰共有14个，成功鉴别出来，其中绝大多数为苯酞类化合物，也有少量酚酸类化合物；在小峰、杂峰中还鉴定出了两个新化合物：1”-乙氧基-芎萘呋内酯(1”-ethoxy-wallichilide)、3-亚丁基-6-羟基-7-乙氧基苯酞(3-butylidene-6-hydroxy-7-ethoxy-phthalide)，结构如下所示1”-乙氧基-芎萘呋内酯在浓度为50μM时QR诱导活性与阳性对照药物相当，比空白组高2倍，对NO最大抑制率为67.8％；3-亚丁基-6-羟基-7-乙氧基苯酞的在浓度为100μM左右时与QR阳性对照药物相当，较空白组高1.5倍，NO最大抑制率为52.7％。

表21”-ethoxy-wallichilide的

表3

3-butylidene-6-hydroxy-7-ethoxy-phthalide的

实施例3糖尿病肾病小鼠模型的建立与给药

C57BL/6种系雄性小鼠(六周龄，17-19g)购自维通利华。小鼠以灭菌后饲料和煮沸后的纯净水进行饲养，自由取食。饲养室12小时光照/黑暗循环，室温22±20℃。小鼠经一周适应性饲养后，连续5天接受腹腔注射(i.p.)柠檬酸钠溶液(pH 4.5对照组)或50mg/kg链脲霉素(STZ溶于柠檬酸钠，pH 4.5)以诱导糖尿病模型。两周后，6h空腹血糖水平(6小时禁食)高于11.9mmol/L的小鼠被用于后续实验，所有动物实验均在山东大学伦理委员会和机构动物护理与使用委员会的批准下进行。同批C57BL/6雄性小鼠共分为六组，分别为空白对照组，链脲霉素组(模型组)，临床抗DN药卡托普利阳性对照组(阳性药组100mg/kg)，有效组分低剂量组(10mg/kg)，有效组分高剂量组(20mg/kg)和川芎乙醇提取物组(20mg/kg)。除空白对照组，其余5组采用上述造模成功小鼠。在全部饲养过程内，每日给药(空白对照和STZ组给予生理盐水)。每天观察小鼠的精神状态，活动，头发和四肢情况。每周测量一次体重、血糖、饮食、饮水和尿量，并使用小鼠代谢笼收集小鼠24h尿液进行进一步分析。结果如图4所示，有效组分增加DN小鼠体重，降低DN小鼠血糖。

实施例4小鼠血液、尿液的收集及肾脏、大脑的摘取检测

处死小鼠通过颈椎脱臼法处死小鼠，收集两个肾脏，称重，检测DN小鼠肾脏肥大程度，后期HE染色也可以看出其减轻肾小球肥大。双肾称重后将其中一个放入4％多聚甲醛中以制作石蜡切片，另一个由生理盐水制成10％组织匀浆。提取大鼠脑组织，采用0.9％氯化钠溶液冲洗后，将黏附在其表面的异物清除干净，以干净纱布将表面水分吸干后放入干净离心管中，保存在-80℃下，用于测试生物标志物。

实施例5小鼠肾脏苏木精伊红(HE)/PAS染色

取小鼠肾脏组织，置于福尔马林液中，固定，洗涤，酒精脱水，石蜡包埋并切片；取组织切片依据HE染色流程进行脱蜡、洗涤、苏木精染色/PAS染色、洗涤、伊红染色、封片，显微镜下观察并拍照。结果如图5和图6所示，有效组分可以降低炎症细胞聚集，减轻肾小球肥大，改善肾脏纤维化水平。

实施例6有效组分对Nrf2及下游基因蛋白、纤维化相关蛋白TGF-β1、α-SMA的影响

方法：蛋白质印迹分析(Western blot)检测小鼠肾脏中蛋白水平的变化

将肾脏组织样品从-80℃冰箱中取出，称取适量样品至1.5mL EP管中，用剪刀剪碎。按照比例加入Sample buffer，将组织样品用电动研磨器研磨破碎至无明显组织团块，置于冰上静置30分钟，使用离心机(10000rpm，15min，4℃)离心，取上清液于100℃金属加热器加热5分钟，超声破碎36秒，得样品。将处理好的肾组织样品采用SDS凝胶电泳分析后，转膜、封闭、加入相应抗体，4℃孵育过夜，PBST洗涤，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1h，增强型ECL化学发光进行蛋白分析。结果如图7所示，有效组分能够上调Nrf2及以下游基因蛋白水平的表达、降低纤维化相关蛋白TGF-β1、α-SMA的水平。

实施例7有效组分对NF-κB信号通路的影响

将HK-2细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％～80％后，加入不同浓度的与有效组分，用含LPS(1μg/mL)培养基，处理24h，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液，收集蛋白。再采用上述免疫印迹检测方法检测相应蛋白，结果如图8所示，细胞经有效组分处理后，可以有效降低由LPS所诱导的NF-κB信号通路的激活。

实施例8有效组分对DN小鼠脑组织氧化应激水平影响

糖尿病肾病是糖尿病微血管病变所诱发的并发症，大脑中微血管分布集中，密集而复杂，因此糖尿病对于脑组织损伤也较为严重，主要表现在氧化应激及炎症因子水平上升。当脑组织血氧不足，就会产生大量的氧自由基，导致SOD、CAT还原酶过度消耗，氧自由基过剩会促进生成具有细胞毒性的MDA。通过对DN小鼠脑组织ELISA检测，发现有效组分改善模型大鼠SOD、CAT和MDA水平，从而抑制大鼠脑组织氧化应激损伤，增加DN小鼠脑组织中SOD、CAT活性，减少脂质过氧化物MDA产生，通过这一抗氧化作用起到神经保护作用，降低神经细胞凋亡。

实施例9片剂的制备

有效组分(实施例1制备)30g，加入玉米淀粉40g，糊精20g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加适量滑石粉，压片，即得。

实施例10胶囊剂的制备

有效组分(实施例1制备)30g，加入淀粉30g、糊精15g，微晶纤维素10g，充分混匀，制颗粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，装胶囊，即得。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。