一种人壳多糖酶3样蛋白1的抗原模拟表位肽及制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种人壳多糖酶3样蛋白1的抗原模拟表位肽及制备方法。

背景技术

壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)，又称为YKL-40蛋白，是由CHI3L1基因编码的一种分泌型糖蛋白。有研究发现，人血清中CHI3L1水平在酒精性肝硬化病人中升高，并且血清中CHI3L1蛋白水平与丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关。

现有技术未发现有关于壳多糖酶3样蛋白1的抗原模拟表位肽的报道。

发明内容

本发明以抗人CHI3L1兔抗为靶分子，将靶分子以链霉亲和素-生物素定向连接的方式固定于磁珠上，投入噬菌体随机展示双环肽库，通过优化的液相磁珠亲和淘选条件，获得了一种可特异性结合抗人CHI3L1兔抗的多肽分子(抗原模拟表位肽)，其氨基酸序列为C-K-H-N-F-G-L-E-C-R-F-F-L-F-E-F-C（SEQ ID NO .1）。

上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即C代表半胱氨酸残基，K代表赖酸残基，H代表组氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，F代表苯丙氨酸残基，G代表甘氨酸残基，L代表亮氨酸残基，E代表谷氨酸残基，R代表精氨酸残基。

本发明还涉及编码上述氨基酸序列的核苷酸，该核苷酸的序列为: TGT AAG CATAAT TTT GGT CTG GAG TGT CGG TTT TTT TTG TTT GAG TTT TGT（SEQ ID NO .2）。

本发明提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的多肽氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。

本发明的有益效果是：本发明所提及的多肽分子（抗原模拟表位肽）可作为天然的人CHI3L1、通过基因工程技术制备的重组人脂联素蛋白的替代物应用于免疫分析体系，避免了传统的人CHI3L1所面临的复杂的提取、纯化过程；也避免了传统的重组CHI3L1制备过程中所面临的基因序列优化、表达载体构建、原核/真核表达条件优化等复杂的制备过程，具有制备简单、快速、高效等优势。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳鉴定酶联后的菌落PCR产物的示意图，其中，泳道1-30分别为随机挑取的酶联产物的单克隆菌落PCR产物，泳道M为DNA marker；

图2为间接ELISA鉴定噬菌体展示双环多肽阳性克隆的结合特异性的结果示意图；

图3为基于抗原模拟表位肽的间接竞争ELISA测定CHI3L1的结果示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

实施例1噬菌体展示双环肽库的构建

1）随机双环肽序列的设计

通过设计两个引物的方式，构建双环肽的随机序列。

引物1的序列为：

5'-TGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGTATGAGGGCTGTCTGTGGAATG-3'（SEQ ID NO .3）。

引物2的序列为：

5'-CTGCAGCTTCACCTGGGC-3'（SEQ ID NO .4）。

2）全质粒PCR

选取pCANTAB 5E质粒，进行PCR扩增，具体的反应组分及浓度如表1所示。PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸2.5min，循环25次；再72℃延伸7min。配制1.5%琼脂糖凝胶跑电泳观察PCR扩增结果，并将PCR产物按照天根胶回收试剂盒说明书进行割胶回收。

表1

3）构建重组质粒

按表2所示的体系用金属浴对回收的全质粒PCR产物进行消化。酶切12小时，用50μL无菌的液体石蜡封液。酶切结束后跑1.5%的琼脂糖凝胶观察实验结果并用PCR片段回收试剂盒对消化产物进行回收，用nanodrop测纯化后DNA浓度。

表2

按表3所示的体系用金属浴对消化后的线性化质粒进行酶连，100μL体系，并分别设置空白对照，即把连接酶换成无菌水，16℃酶连16h，酶连结束后跑1.5%的琼脂糖凝胶观察结果。

表3

4）噬菌体展示双环肽库的组装

取100μL

取10μL菌液用于滴度验证，其余菌液全部涂布至LB-A(amp终浓度100μg/mL，1/1000)平板（15cm），37℃恒温培养箱倒置培养过夜。隔天用2mL LB培养基将平板上的菌落轻轻刮至一起，收集起来。体积较多可短暂低速离心去除部分培养基。

取10μL电转后复苏的菌液进行梯度稀释，用LB培养基稀释至10

从进行滴度验证后的平板中随机挑取单克隆菌落至含有1mL LB-A培养基的离心管中进行摇菌（37℃、220rpm），菌液摇至OD

实施例2 CHI3L1多克隆抗体的制备

取新西兰白兔，选取CHI3L1重组蛋白进行三次动物免疫，第一次采用弗氏完全佐剂进行乳化，第二、三次采用弗氏不完全佐剂进行乳化，三次动物免疫的免疫原的量分别为200μg/每只、100μg/每只、150μg/每只。免疫完成后耳静脉取血，分离血清。采用ELISA方法测定多克隆抗体的效价及特异性。

实施例3 人CHI3L1抗原模拟表位肽的亲和淘选及其鉴定

1）液相亲和淘选与抗人CHI3L1抗体特异性结合多肽分子的具体方法为：取500μg抗人CHI3L1兔多克隆抗体，采用EDC/NHS方法标记生物素，随后投入表面修饰有链霉亲和素的磁珠溶液中，将兔多克隆抗体标记于磁珠表面，再用3%BSA封闭未结合位点；取标记有抗人CHI3L1兔多克隆抗体的磁珠溶液， 投入构建的噬菌体随机展示双环肽库（约5.0×10

2）加入洗脱液(Gly-HCL，pH2.2)，37ºC下轻摇震荡10 min以洗脱与兔多克隆抗体结合的噬菌体。吸出洗脱液，加入15μL 、1M Tris-HCl（pH 9.1）中和缓冲液。取10 μL中和液进行噬菌体滴度测定，其余的用于感染20 mL生长至对数前期的

3）然后依次进行第2轮和第3轮淘选，淘选步骤与第一轮大体相同，每次加入的噬菌体量均为5×10

4）阳性噬菌体克隆的鉴定：从第3轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取100个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗人CHI3L1兔多克隆抗体，2μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) )洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100 μL噬菌体斑扩增液（1.0×10

5）特异性结合抗人CHI3L1抗体的多肽分子鉴定：采用ELISA的方法进行多肽分子与抗人CHI3L1抗体结合能力及特异性的鉴定，具体方法为：用10 mM PBS (pH 7.4) 分别包被鼠源抗CHI3L1单克隆抗体（100μL/孔，1μg/mL）、抗人CHI3L1兔多克隆抗体（100μL/孔，1μg/mL）、牛血清白蛋白（100μL/孔，1μg/mL）、羊抗兔IgG（100μL/孔，1μg/mL）、鼠抗人IgG（100μL/孔，1μg/mL）于酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v)) 洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；洗板后，投入100μL经ELISA鉴定为阳性的噬菌体克隆（1.0×10

6）间接竞争ELISA测定人CHI3L1抗原模拟表位肽：具体方法为：包被抗人CHI3L1兔抗（5μg/mL）于酶标板孔，4℃孵育过夜；第二天用PBST洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；洗板后加入50μL人CHI3L1抗原模拟表位肽与50μL不同浓度的CHI3L1抗原，37℃孵育30min；洗板后加入1：5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μL，37℃孵育1小时；加入100μLTMB底物液，避光显色5min，终止反应后，读取OD

实施例4多肽分子编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

将经ELISA鉴定展示有抗原模拟表位肽的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。依据DNA测序结果及密码子表可获得多肽分子的氨基酸序列为：C-K-H-N-F-G-L-E-C-R-F-F-L-F-E-F-C（SEQ ID NO .1）。

实施例5人CHI3L1抗原模拟表位肽的大量制备

1）以噬菌体扩增的方式

将展示有人CHI3L1抗原模拟表位肽的噬菌体粒子加入 M13KO7 辅助噬菌体，于37℃恒温培养箱静置 15 min，恒温震荡培养箱中培养 45 min，培养条件为 37℃、220rpm；将上述培养物进行离心，离心条件为 4℃、1000 g、10 min，弃去上清，用 50 mL 2×YT-Amp-Kana 液体培养基重悬沉淀的菌体，恒温震荡培养箱中培养 5 h，培养条件为 30℃、250 rpm；上述培养物进行离心，离心条件为 4℃、8000 rpm、20 min，收集上清液转移至新 100 mL灭菌离心管中，向上清液加入 1/5体积的 20%PEG-NaCl溶液，多次颠倒混匀后于4℃静置 12h，即为噬菌体扩增液。

2）以化学合成的方式

依据解析出的抗原模拟表位肽的多肽氨基酸序列，基于多肽固相合成法进行多肽的大量化学合成。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。