一种仿神经微结构脱细胞植物神经导管及其制作方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料合成及应用领域，具体涉及一种基于脱细胞技术制作仿神经微结构的脱细胞植物神经导管及其制作方法和应用。

背景技术

周围神经损伤（Peripheral Nerve Injury，PNI）是由于战争、自然灾害、事故创伤及医源性损伤引起的周围神经结构受损，通常引起患者感觉和运动功能的部分或完全丧失，严重影响患者的生活质量和生产力。在临床实践中，自体神经移植术是治疗PNI的“金标准”，但自体神经移植不仅造成供体神经的二次损伤，还面临供体有限、供受体尺寸不匹配等限制。人工神经导管（Nerve Guidance conduits，NGCs）移植是治疗周围神经损伤的有效治疗方式，被视为自体神经移植术的理想替代品。

天然的神经组织由大量平行排列的微管道结构组成。受此启发，研究人员已开发基于生物材料的多通道NGCs。这些仿神经结构的微管道NGCs虽然能够有效改善单通道空心面临的轴突分散和靶器官错配问题，但由于其通道数量和尺寸与天然神经差异巨大，因此无法真实模拟神经的物理导向信号，导致神经功能恢复效果不佳。另外，基于3D打印技术的多通道NGCs设计方法因缺乏理想的生物墨水而难以转化。因此，开发一种仿天然神经微结构的新型人工神经导管有望提升PNI损伤修复效果。

自然界中的植物根茎中存在大量纵向排列的筒状维管束，为植物输送水和营养成分。不难发现，植物根茎平行排列的脉管结构与天然神经的微管结构极为相似。申请人在先前研究中对多种植物根茎组织结构与天然神经纤维进行对比，并发现蒜苔根茎维管束的孔径与单根神经纤维直径尺寸十分接近。这为开发一种基于仿天然神经微结构的植物神经导管提供了理论基础。

天然植物作为异种异体组织具有较强的免疫原性。因此，需要通过脱细胞处理对其组织和细胞成分进行去除。脱细胞技术是常见的组织工程支架制备技术，主要通过物理、化学以及生物酶学方法去除动物或植物组织中的组织和细胞成分，保留其由细胞外基质组成的支架结构。脱细胞技术不仅降低了异体组织的免疫原性，还为制备结构均一、更经济、更容易获得的组织工程支架提供了新方法。目前为止，研究人员相继开发脱细胞洋葱心血管补片、脱细胞菠菜人工心脏、猪脱细胞神经组织支架等脱细胞支架，证明了它们在多个组织损伤模型中的修复效果。但仿神经微结构的脱细胞植物导管的制备方法及其在PNI治疗中的应用目前尚无报道。

基于以上，我们通过仿生理念，以植物组织为来源、脱细胞技术为手段，成功去除天然植物根茎的细胞成分，制备出了保留完整纵向排列微结构的脱细胞植物导管。该方法具有原材料来源充足、制作工序简单易行等优势。进一步，为便于导管的体内缝合和提高其机械性能，利用具有良好生物相容性和神经再生能力的丝胶蛋白制备丝胶膜，并将其包裹在导管表面，制备出丝胶膜包被的脱细胞植物神经导管。该新型脱细胞植物神经导管在周围神经损伤修复领域中具有重要的应用价值和前景。

发明内容

本发明为实现对周围神经损伤的修复，提供了一种利用脱细胞技术制作仿神经微结构的脱细胞植物神经导管的制作方法。具体为制备脱细胞植物导管，制备丝胶膜，使用丝胶膜包被脱细胞植物导管，实现可体内移植的丝胶膜包被的脱细胞植物神经导管的制备，为周围神经再生提供支持和引导线索。

本发明的技术方案如下：

一种利用脱细胞技术的脱细胞植物神经导管的制作方法，过程为对植物根茎组织进行脱细胞处理，包裹丝胶膜，制备可体内移植的丝胶膜包被的脱细胞植物神经导管。具体步骤为：

第一步：制备脱细胞植物导管

取植物根茎，洗净后用己烷浸泡除去角质层，PBS洗涤；再用十二烷基硫酸钠（SDS）浸泡，PBS洗涤；然后浸泡于Triton-X-100和亚氯酸钠漂白剂的去离子水溶液，去离子水洗涤后得到脱细胞植物导管备用。

进一步的，所述植物根茎来源于蒜苔。第二步：制备丝胶膜

为提高植物导管机械性能和便于其体内缝合，使用丝胶膜包被脱细胞植物导管。其中，丝胶膜的制备方法如下。

称取蚕茧，使用溴化锂溶液溶解，经过纯化、透析、浓缩后得到丝胶溶液；将丝胶溶液与京尼平溶液混合后注入模具，形成丝胶水凝胶；得到的丝胶水凝胶经过风干，冷冻后，再经充分水化、灭菌、洗涤后得到丝胶膜。

第三步：制备丝胶膜包被的脱细胞植物导管

在无菌操作台中，将丝胶膜裁剪成方形（例如1.3cm×1.3cm大小方块），包绕脱细胞植物导管进行滚动包裹；裂缝处涂布京尼平交联的丝胶溶液使其闭合。

由以上所述方法制备获得脱细胞植物神经导管。

进一步地，本发明还提供了由上述制作方法制备得到的仿神经微结构脱细胞植物神经导管。

另外，本发明还提供了所述仿神经微结构脱细胞植物神经导管作为修复材料在周围神经损伤修复的应用。

有益效果：（1）本发明首次利用脱细胞技术制备了仿神经微结构的脱细胞植物神经导管；（2）本发明制备的脱细胞植物神经导管使用丝胶膜包被，改善了其自身的机械性能和体内缝合的简便性；（3）本发明制备的脱细胞植物神经导管可以提供与神经组织类似的纵向排列微结构，为周围神经再生提供支持和拓扑引导。

附图说明

图1为天然神经纤维与植物根茎结构对比分析；

图2为脱细胞植物神经导管的制备示意图；

图3为脱细胞植物神经导管的表征；

图4a为天然蒜苔、脱细胞蒜苔纵切面扫描电子显微镜图；图4b为脱细胞植物导管进行丝胶膜包被前后抗拉强度比较图；图4c为丝胶膜的包被实现脱细胞神经导管的体内移植和缝合示意图；图4d为脱细胞植物神经导管移植大鼠坐骨神经的结构再生结果图。

实施方式

为了使本发明更好的被理解，下面结合实例和附图对本方案的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

如图1所示，将几种常见植物根茎结构与对天然神经纤维结构进行对比分析并筛选植物根茎。

截取蒜苔茎（garlic moss）、芹菜茎（celery stalk）、苋菜茎（amaranth stalk）、香菜茎（cilantro stalk）等植物组织根茎，将其沿横截面切片制备植物组织切片，并进行番红固绿染色（如图1a）。与此同时，截取大鼠坐骨神经组织，沿横截面切片进行组织染色（如图1b上图）。

统计坐骨神经和各植物横截面孔径大小分布（如图1a），计算并比较横截面圆度（如图1b，c），选择与坐骨神经纤维直径分布和横截面圆度更接近的植物根茎作为植物导管候选材料。

脱细胞植物神经导管的制备

如图2所示，本发明的脱细胞植物神经导管通过以下方法来制备：

1.植物脱细胞步骤：

（1）取直径均一的植物根茎（蒜苔根茎）并裁剪成1cm长度，用水洗净，去除表面污垢和杂质。

（2）为去除植物角质层，将步骤（1）中的植物根茎浸泡于己烷（98g/100mL），在室温摇床上摇晃一个小时。

（3）弃去己烷，使用1×PBS浸泡洗涤3次。

（4）将步骤（3）得到的植物浸泡于10g/100mL的十二烷基硫酸钠（SDS）摇晃浸泡5天。

（5）使用1×PBS浸泡洗涤3次

（6）将植物浸泡于含有0.1mL/100mL的 Triton-X-100和10g/100mL的亚氯酸钠漂白剂的去离子水溶液，室温摇床摇晃48小时。

（7）无菌去离子水浸泡摇晃48小时，每12小时换一次去离子水。

（8）将步骤（7）中得到的脱细胞植物导管浸泡无菌去离子水，4℃保存备用。

2.丝胶膜制备：

（1）称取1g蚕茧（丝素缺陷型蚕茧），剪碎用水洗净，去除水分；

（2）剪碎洗净的蚕茧在55 mL（6mol/L）的溴化锂溶液中浸泡，并于35℃水浴条件下溶解24小时；

（3）步骤（2）中溶液 3500 rpm 离心十分钟，去除不溶杂质，分离上清；

（4）将步骤（3）中获得的溶液中加入13.75mL（1mol/L）的Tris-HCl（pH=9.0）；

（5）将步骤（4）混合后的溶液装入分子量为3500Da的纤维素透析袋，置于1L去离子水透析，每4小时换一次水，共透析24小时；

（6）将步骤（5）中装有丝胶溶液的透析袋置于1L聚乙二醇（PEG-6000）溶液进行浓缩；

（7）浓缩至10% （w/v）时取出丝胶溶液，并与京尼平溶液（0.01g/mL）按6:1（V/V）比例混合交联，并注入模具；

（8）将其转入37℃培养箱，充分形成丝胶水凝胶；

（9）丝胶水凝胶连同模具放入通风橱，自然风干，待丝胶水凝胶水分完全挥干后，将其放入-80℃冰箱冷冻4小时；

（10）4小时后取出模具，充分水化后小心撕下丝胶膜；

（11）将丝胶膜浸泡于75%（V/V）乙醇30分钟灭菌；

（12）使用无菌去离子水洗涤丝胶膜3次，备用。

3.丝胶膜包被的脱细胞植物神经导管的制备

（1）在无菌操作台上，使用无菌刀片小心将步骤1（12）得到的丝胶膜裁剪成1.3cm×1.3cm；

（2）使用无菌镊将脱细胞处理后的植物导管置于裁剪好的丝胶膜上。丝胶膜包绕脱细胞植物导管，对其进行滚动包裹；

（3）包裹裂缝处涂布20μL步骤1（7）中得到的京尼平交联的丝胶溶液，并放入37℃培养箱充分成胶至裂缝处完全闭合；

（4）丝胶膜包被的脱细胞植物导管制备完成后，4℃保存或立即进行体内移植。

如图3所示，蒜苔根茎经过脱细胞处理后为透明的圆柱体导管结构。脱细胞处理后的蒜苔导管置于裁剪好的丝胶膜上。丝胶膜包绕脱细胞蒜苔导管，对其进行滚动包裹，制备得到脱细胞植物神经导管。

表征：天然蒜苔、脱细胞蒜苔纵切面扫描电子显微镜（SEM）图像显示，脱细胞处理后，天然植物根茎的纵向结构保留完整，表面变得更为光滑。丝胶膜包被的脱细胞蒜苔神经导管呈高度多孔的孔隙结构（图4a）。

由于丝胶膜优异的弹性和韧性，脱细胞植物导管进行丝胶膜包被后，其抗拉强度得到显著提高（图4b）。丝胶膜的包被实现脱细胞神经导管的体内移植和缝合（图4c）。

建立大鼠10 mm坐骨神经缺损模型。将脱细胞植物神经导管移植到坐骨神经缺损处。12周后对再生神经组织轴突（绿色）和施万细胞（红色）进行免疫荧光染色。结果表明，脱细胞植物神经导管移植成功促进了大鼠坐骨神经的结构再生（图4d）。

有益效果：（1）本发明首次利用脱细胞技术制备了仿神经微结构的脱细胞植物神经导管；（2）本发明制备的脱细胞植物神经导管使用丝胶膜包被，改善了其自身的机械性能和体内缝合的简便性；（3）本发明制备的脱细胞植物神经导管可以提供与神经组织类似的纵向排列微结构，为周围神经再生提供支持和拓扑引导。