用于二聚物或聚合物染料中亮度增强的间隔连接基设计
文献发布时间：2024-04-18 19:58:53
背景技术
技术领域
本公开内容总体上涉及具有用于亮度增强的间隔基的二聚物和聚合物荧光或着色染料，以及它们的制备方法和在各种分析方法中的用途。
相关技术描述
已知荧光和/或着色染料特别适用于需要高灵敏度检测试剂的应用。能够优先标记样品中的特定成分或组分的染料使得研究人员能够确定该特定成分或组分的存在、数量和/或位置。此外，可以监测特定系统在不同环境中的空间和时间分布。
荧光和比色方法在化学和生物学中非常广泛。这些方法提供关于生物分子的存在、结构、距离、取向、络合和/或位置的有用信息。此外，时间分辨方法越来越多地用于动态和动力学的测量。结果，已经开发了许多用于生物分子(例如核酸和蛋白质)的荧光或颜色标记的策略。因为生物分子的分析通常发生在水性环境中，所以重点是开发和使用水溶性染料。
高度荧光或着色染料是期望的，因为使用此类染料增加了信噪比并提供了其它相关益处。因此，已经尝试增加来自已知荧光和/或着色结构部分的信号。例如，已经制备了包含两个或更多个荧光和/或着色结构部分的二聚物和聚合物化合物，预期这些化合物将产生更亮的染料。然而，作为分子内荧光猝灭的结果，已知的二聚体和聚合物染料尚未实现所需的亮度增加。
因此，本领域需要具有增加的摩尔亮度的水溶性染料。理想地，这样的染料和生物标志物应该是强烈着色的或荧光的，并且应该以各种颜色和荧光波长可用。本公开满足了这种需要并提供了其它相关优点。
发明内容
发明概述
简而言之，本公开的实施方案通常涉及可用作水溶性、荧光和/或着色染料和/或探针的化合物，其能够目视检测分析物分子，例如生物分子，以及用于其制备的试剂。还描述了使用染料目视检测分析物分子的方法。
本发明公开的染料的实施方案包括通过具有以下结构的连接基共价连接的两个或更多个荧光和/或着色结构部分：
其中L
在一些实施方案中，本公开内容的化合物是有用的，因为它们能够实现与其相关的FRET荧光发射。还描述了使用染料目视检测分析物分子的方法。
本发明公开的染料的实施方案包括通过连接基(例如，"L
本公开的实施方案的水溶性、荧光或着色染料是强烈着色的和/或荧光的，能够实现FRET过程(例如，吸光、发射、斯托克位移(Stoke's shift))，并且可以通过目视检查或其它手段容易地观察到。在一些实施方案中，可以在没有预先照射或化学或酶促活化的情况下观察化合物。如本文所述，通过适当选择染料，可以获得具有各种颜色的视觉上可检测的分析物分子。
在一些实施方案中，提供了具有以下结构(I)的化合物：
或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R
在一些其它实施方案中，提供了具有以下结构(A)的化合物：
或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R
在其它实施方案中，提供了具有以下结构(II)的化合物：
或其立体异构体、互变异构体或盐，其中R
结构(I)、(A)或(II)的化合物可用于许多应用，包括在各种分析方法中用作荧光和/或着色染料。
在还有的其它实施方案中，提供了样品的染色方法，该方法包括向所述样品中添加结构(I)、(A)或(II)的化合物，其添加量足以当所述样品经适当的波长照射时产生光学响应。
在还有的其它实施方案中，本公开提供了目视检测分析物分子的方法，其包括：
(a)提供如本文公开的化合物；和
(b)通过所述化合物的可见性质检测它。
其它公开的方法包括目视检测生物分子的方法，所述方法包括：
(a)将本文公开的化合物与一种或多种生物分子掺混；和
(b)通过所述化合物的可见性质检测它。
其它实施方案提供了目视检测分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供如本文所公开的化合物，其中R
(b)将所述化合物和分析物掺混，从而将所述靶向结构部分和所述分析物缔合；和
(c)通过所述化合物的可见性质检测它。
在还有的其它实施方案中，本公开内容提供增加染料亮度的方法，其包括：
(a)提供包含本文公开的化合物的染料溶液；和
(b)将所述染料溶液熟化一段时间。
其它实施方案涉及包含本文公开的化合物和一种或多种分析物分子(例如一种或多种生物分子)的组合物。还提供了此类组合物在用于检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。
在一些其它不同实施方案中，提供了结构(III)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中R
在一些其它不同实施方案中，提供了结构(IV)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中R
在还有的其它实施方案中，提供了标记分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将结构(III)或(IV)的化合物与分析物分子掺混，其中R
(b)形成所述化合物和分析物分子的共轭物；和
(c)使所述共轭物与式M-L
在一些不同的实施方案中，提供了另一种标记分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将结构(III)或(IV)的化合物，其中R
(b)使步骤(A)的产物与分析物分子反应，从而形成步骤(A)的产物与分析物分子的共轭物，其中R
在更多不同实施方案中，提供制备结构(I)的化合物的方法，所述方法包括将结构(III)的化合物与式M-L
在更多不同实施方案中，提供制备结构(II)的化合物的方法，所述方法包括将结构(IV)的化合物与式M-L
参考以下详细说明，本公开的这些及其它方面将是显而易见的。
附图说明
在附图中，相同的附图标记标识相似的元素。附图中的元素的尺寸和相对位置不一定按比例绘制，并且这些元素中的一些被任意放大和定位以提高附图易读性。此外，所绘制的元素的特定形状不旨在传达关于特定元素的实际形状的任何信息，并且仅是为了便于在附图中识别而选择的。
图1示出了与对照化合物相比，具有各种M结构部分的代表性化合物的染色指数(stainindex)。
图2示出了代表性化合物在NaCl和KCl溶液中随时间增加的分离效率的示意图。
图3提供了对照化合物构建体和结构(I)的代表性化合物构建体的体外分析。
图4示出了缓冲液对对照化合物构建体和结构(I)的代表性化合物构建体的亮度的影响。
发明详述
在以下说明书中，阐述了某些具体细节以便提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践本公开。
除非上下文另有要求，否则在整个本说明书和权利要求书中，词语"包括(comprise)"及其变体，例如"包括(comprises)"和"包括(comprising)"应以开放的、包含性的意义解释，即，解释为"包括但不限于"。
贯穿本说明书对"一个实施方案"或"实施方案"的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在各个地方出现的短语"在一个实施方案中"或"在实施方案中"不一定都指代相同的实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
"氨基"是指-NH
"羧基"是指-CO
"氰基"是指-CN基团。
"甲酰基"是指-C(＝O)H基团。
"羟基(Hydroxy)"或"羟基(hydroxyl)"是指-OH基团。
"亚氨基"是指＝NH基团。
"硝基"是指-NO
"氧代"是指＝O取代基。
"巯基"是指-SH基团。
“硫代”是指＝S基团。
"烷基"是指仅由碳和氢原子组成的直链或支化烃链基团，不含不饱和部分，具有1至12个碳原子(C
"亚烷基"或"亚烷基链"是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支化二价烃链，其仅由碳和氢组成，不含不饱和部分，并且具有1至12个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基、亚丙炔基、亚正丁炔基等。亚烷基链通过单键与分子的其余部分连接，并通过单键与基团连接。亚烷基链与分子的其余部分和与基团的连接点可以经过链内的一个碳或任何两个碳。除非在说明书中另有具体说明，否则亚烷基是非必要取代的。
"亚烯基"或"亚烯基链"是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支化二价烃链，其仅由碳和氢组成，含有至少一个碳-碳双键并具有2至12个碳原子，例如亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基链通过单键与分子的其余部分连接，并通过双键或单键与基团连接。亚烯基链与分子的其余部分和与基团的连接点可以经过链内的一个碳或任何两个碳。除非在说明书中另有具体说明，亚烯基是非必要取代的。
"亚炔基"或"亚炔基链"是指将分子的其余部分连接至基团的直链或支化二价烃链，其仅由碳和氢组成，含有至少一个碳-碳三键并具有2至12个碳原子，例如亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚炔基链通过单键与分子的其余部分连接，并通过双键或单键与基团连接。亚炔基链与分子的其余部分和与基团的连接点可以经过链内的一个碳或任何两个碳。除非在说明书中另有具体说明，否则亚炔基是非必要取代的。
"烷基醚"是指如上定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键被碳-氧键取代。碳-氧键可以在末端(如在烷氧基中)或碳氧键可以在内部(即C-O-C)。烷基醚包括至少一个碳氧键，但可以包括多于一个。例如，聚乙二醇(PEG)包括在烷基醚的含义内。除非在说明书中另有具体说明，否则烷基醚基团是非必要取代的。例如，在一些实施方案中，烷基醚经醇或-OP(＝R
"烷氧基"是指式-OR
"烷氧基烷基醚基"是指式-OR
"杂烷基"是指如上定义的烷基，其在烷基内或在烷基的末端包含至少一个杂原子(例如，N、O、P或S)。在一些实施方案中，杂原子在烷基基团内(即，杂烷基包含至少一个碳-[杂原子]
"杂烷氧基"是指式-OR
"亚杂烷基"是指如上定义的亚烷基，其在亚烷基链内或在亚烷基链的末端包含至少一个杂原子(例如，N、O、P或S)。在一些实施方案中，杂原子在亚烷基链内(即，亚杂烷基包含至少一个碳-[杂原子]-碳键，其中x为1、2或3)。在其它实施方案中，杂原子位于亚烷基的末端，因此用于将亚烷基连接到分子的其余部分(例如，M1-H-A-M2，其中M1和M2是分子的一部分，H是杂原子，A是亚烷基)。除非在说明书中另有具体说明，否则亚杂烷基是非必要取代的。示例性的亚杂烷基基团包括环氧乙烷(例如，聚环氧乙烷)和"C"、"HEG"、"TEG"、"PEG1K"及其变体，如下所示的连接基团：
上述C-连接基、HEG连接基和/或PEG 1K连接基的多聚体包括在亚杂烷基连接基的各种实施方案中。
在PEG 1K连接基的一些实施方案中，n是25。多聚体可以包含，例如，以下结构：
其中x是0或大于0的整数，例如，x在0-100的范围内(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
"亚杂烯基"是包含至少一个碳-碳双键的如上定义的亚杂烷基。除非在说明书中另有具体说明，否则亚杂烯基是非必要取代的。
"亚杂炔基"是包含至少一个碳-碳三键的亚杂烷基。除非在说明书中另有具体说明，否则亚杂炔基是非必要取代的。
关于"杂原子连接基"的"杂原子"是指由一个或多个杂原子组成的连接基。示例性杂原子连接基包括选自O、N、P和S的单原子和多个杂原子，例如具有式-P(O
"磷酸酯"是指-OP(＝O)(R
"磷酸烷基(phosphoalkyl)"是指-OP(＝O)(R
"磷酸烷基醚"是指-OP(＝O)(R
"硫代磷酸酯"是指-OP(＝R
"硫代磷酸烷基(thiophosphoalkyl)"是指-OP(＝R
"硫代磷酸烷基醚"是指-OP(＝R
"碳环"是指包含3至18个碳原子的稳定的3至18元芳族或非芳族环。除非在说明书中另有具体说明，否则碳环可以是单环、双环、三环或四环的环体系，其可以包括稠合或桥联环系，并且可以是部分或完全饱和的。非芳族碳环基包括环烷基，而芳族碳环基包括芳基。除非在说明书中另有具体说明，否则碳环基团是非必要取代的。
"环烷基"是指稳定的非芳族单环或多环碳环，其可以包括稠合或桥联的环系，具有3至15个碳原子，优选具有3至10个碳原子，并且其是饱和或不饱和的，并且通过单键与分子的其余部分连接。单环环烷基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7二甲基-双环-[2.2.1]庚基等。除非在说明书中另有具体说明，否则环烷基是非必要取代的。
"芳基"是指包含至少一个碳环芳族环的环系。在一些实施方案中，芳基包含6至18个碳原子。芳基环可以是单环、双环、三环或四环的环体系，其可以包括稠合或桥联的环系。芳基包括但不限于衍生自醋蒽烯(aceanthrylene)、苊烯(acenaphthylene)、acephenanthrylene、蒽、薁(azulene)、苯、
"杂环"是指包含1至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定的3至18元芳族或非芳族环。除非在说明书中另有具体说明，否则杂环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合或桥联的环系；并且杂环中的氮、碳或硫原子可以非必要地被氧化；氮原子可以非必要地被季铵化；并且杂环可以是部分或完全饱和的。芳族杂环的实例在以下杂芳基的定义中列出(即杂芳基是杂环的子集)。非芳族杂环的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异
"杂芳基"是指包含1至13个碳原子、1至6个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳族环的5至14元环系。出于本公开的某些实施方案的目的，杂芳基基团可以是单环、双环、三环或四环的环体系，其可以包括稠合或桥联的环系；并且杂芳基基团中的氮、碳或硫原子可以非必要地被氧化；氮原子可以非必要地被季铵化。实例包括但不限于氮杂卓基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二
后缀"-烯"是指通过单键与分子的其余部分连接并通过单键与基团连接的特定结构特征(例如，烷基、芳基、杂烷基、杂芳基)。换句话说，后缀"-烯"是指具有与其连接的部分的结构特征的连接基。"-烯"链与分子的其余部分和与基团的连接点可以经过链中的一个原子或链内的任何两个原子。例如，亚杂芳基是指包含如本文所定义的杂芳基结构部分的连接基。
"稠合"是指包含至少两个环的环系，其中两个环共享至少一个共同的环原子，例如两个共同的环原子。当稠合环是杂环基环或杂芳基环时，共同的环原子(一个或多个)可以是碳或氮。稠合环包括双环、三环、四环等。
本文所用的术语"取代的"是指任何上述基团(例如，烷基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚杂烷基、亚杂烯基、亚杂炔基、烷氧基、烷基醚基、烷氧基烷基醚基、杂烷基、杂烷氧基、磷酸烷基、磷酸烷基醚基、硫代磷酸烷基、硫代磷酸烷基醚基、碳环、环烷基、芳基、杂环和/或杂芳基)，其中至少一个氢原子(例如，1、2、3或所有氢原子)被与非氢原子的键代替，所述非氢原子例如但不限于：卤素原子，例如F、Cl、Br和I；基团如羟基、烷氧基和酯基中的氧原子；基团例如硫醇基团、硫代烷基、砜基团、磺酰基和亚砜基团中的硫原子；基团例如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺中的氮原子；基团例如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和各种其它基团中的其它杂原子。"取代的"还是指任何上述基团，其中一个或多个氢原子被与杂原子的高级键(例如，双键或三键)替代，所述杂原子例如氧代、羰基、羧基和酯基中的氧；和基团例如亚胺、肟、腙和腈中的氮。例如，"取代"包括其中一个或多个氢原子经以下基团替换的任何上述基团：-NR
"吸电子基团"是指比氢原子(如果它在分子中占据相同位置)更多地将电子吸引到其自身的官能团。这些术语是本领域技术人员很好理解的，并且在J.March的AdvancedOrganic Chemistry，John Wiley&Sons,New York,N.Y.,pp.16-18(1985)中进行了讨论，并且其中的讨论通过引用并入本文。吸电子基团的实例包括但不限于卤素、卤素(例如F、Cl、Br、I)、—NO
"共轭"是指一个p-轨道与另一个p-轨道沿着插入的σ键的重叠。共轭可以存在于环状或无环化合物中。"共轭度"是指至少一个p-轨道与另一个p-轨道沿着插入的σ键的重叠。例如，1,3-丁二烯具有一个共轭度，而苯及其它芳族化合物通常具有多个共轭度。荧光和着色化合物通常包含至少一个共轭度。
"荧光"是指能够吸收特定频率的光并发射不同频率的光的分子。荧光是本领域普通技术人员公知的。
"着色"是指吸收色谱(即红色、黄色、蓝色等)内的光的分子。
"FRET"是指
"供体"或"供体发色团"是指发色团(例如，荧光团)，其被或可以被诱导为激发电子态，并且可以经由长程偶极-偶极相互作用以非辐射方式将其激发或吸收能量转移到附近的受体发色团。不希望受到理论的束缚，认为发生能量转移是因为各个发色团的振荡偶极子具有相似的共振频率。具有这些相似共振频率的供体和受体称为"供体-受体对(一个或多个)"，其可与"FRET结构部分"、"FRET对"、"FRET染料"或类似物互换使用。
"受体"或"受体发色团"是指经由长程偶极-偶极相互作用通过非辐射转移将来自供体发色团的激发或吸收能量转移到其上的发色团(例如，荧光团)。
"斯托克位移"是指电子跃迁(例如，从激发态到非激发态，或反之亦然)的激发或吸收和发射光谱的带最大值的位置(例如，波长)之间的差异。在一些实施方案中，化合物的斯托克位移大于25nm、大于30nm、大于35nm、大于40nm、大于45nm、大于50nm、大于55nm、大于60nm、大于65nm、大于70nm、大于75nm、大于80nm、大于85nm、大于90nm、大于95nm、大于100nm、大于110nm、大于120nm、大于130nm、大于140nm、大于150nm、大于160nm。大于170nm、大于180nm、大于190nm或大于200nm。
"J-值"计算为供体发色团的发射光谱与受体发色团的激发或吸收光谱之间的光谱重叠的积分值。供体发色团的发射光谱是当用优选的激发或吸收波长激发供体发色团时产生的发射光谱。供体发色团的优选激发或吸收波长处于或接近本领域普通技术人员熟知的它们各自的激发或吸收最大值(例如，Pacific Blue在约401nm处具有激发或吸收最大值，FITC在约495nm处具有激发或吸收最大值)。
"连接基"是指至少一个原子(例如碳、氧、氮、硫、磷及其组合)的连续链，其将分子的一部分连接到同一分子的另一部分或连接到不同的分子、结构部分或固体载体(例如微粒)。连接基可以经由共价键或其它方式(例如离子键或氢键相互作用)连接分子。
术语"生物分子"是指多种生物材料中的任一种，包括核酸、碳水化合物、氨基酸、多肽、糖蛋白、激素、适体及其混合物。更具体地，该术语旨在包括但不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰或衍生的核苷酸、酶、受体、朊病毒、受体配体(包括激素)、抗体、抗原和毒素，以及细菌、病毒、血细胞和组织细胞。如本文进一步所述那样，通过使生物分子与具有反应性基团的化合物接触来制备本公开的可目视检测生物分子(例如，具有与其连接的生物分子的结构(I)的化合物)，所述反应性基团能够经由生物分子上的任何可用原子或官能团(例如氨基、羟基、羧基或巯基)将生物分子连接到所述化合物上。
"反应性基团"是能够与第二反应性基团(例如，"互补反应性基团")反应以形成一个或多个共价键的结构部分，例如通过置换、氧化、还原、加成或环加成反应。示例性反应性基团提供在表1中，并且包括例如，亲核试剂、亲电子试剂、二烯、亲二烯体、醛、肟、腙、炔烃、胺、叠氮化物、酰基叠氮化物、酰卤、腈、硝酮、巯基、二硫化物、磺酰卤、异硫氰酸酯、亚氨酸酯(imidoester)、活化酯、酮、α,β-不饱和羰基、烯烃、马来酰亚胺、α-卤代酰亚胺、环氧化物、氮丙啶、四嗪、四唑、膦、生物素、硫杂环丙烷等。
术语"可见"和"可目视检测"在本文中用于指在没有预先照射或化学或酶促活化的情况下通过目测检查可观察到的物质。此类可目视检测物质在约300nm至约900nm范围内的光谱区域内吸收和发射光。优选地，此类物质是强烈着色的，优选地具有至少约40,000，更优选至少约50,000，还更优选至少约60,000，还还更优选至少约70,000，并且最优选至少约80,000M-
出于本公开的实施方案的目的，术语"光稳定可见染料"是指如上文所定义的可目视检测的化学结构部，并且在暴露于光时不会显著改变或分解。优选地，光稳定可见染料在暴露于光中至少一小时后不表现出显著的漂白或分解。更优选地，可见染料在暴露于光中至少12小时，还更优选至少24小时，还更优选至少一周，最优选至少一个月后是稳定的。适用于本公开的化合物和方法的光稳定可见染料的非限制性实例包括偶氮染料、硫靛染料、喹吖啶酮(quinacridone)颜料、二
本文所使用的术语"苝衍生物"旨在包括可目视检测的任何取代的苝。然而，该术语不旨在包括苝本身。类似地使用术语"蒽衍生物"、"萘衍生物"和"芘衍生物"。在一些优选的实施方案中，衍生物(例如，苝、芘、蒽或萘衍生物)是苝、蒽、萘或芘的酰亚胺、双酰亚胺或肼酰亚胺衍生物。
本公开的各个实施方案的可目视检测分子可用于多种分析应用，例如生物化学和生物医学应用，其中需要确定特定分析物(例如，生物分子)的存在、位置或数量。因此，在另一个方面中，本公开内容提供目视检测生物分子的方法，该方法包括：(a)向生物体系提供可目视检测的生物分子，该生物分子包含与生物分子连接的具有结构(I)的化合物；和(b)通过其可见特性检测生物分子。出于本公开的目的，短语"通过其可见特性检测生物分子"是指在没有照射或化学或酶促活化的情况下，用肉眼或借助于光学基检测装置(包括但不限于吸收分光光度计、透射光显微镜、数码相机和扫描仪)观察生物分子。密度计可用于将存在的可目视检测生物分子的量加以量化。例如，可以通过测量相对光学密度来确定两个样品中生物分子的相对量。如果每个生物分子的染料分子的化学计量是已知的，并且染料分子的消光系数是已知的，则生物分子的绝对浓度也可以由光密度的测量来测定。本文所使用的术语"生物体系"用于指除可目视检测的生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。此类生物体系的非限制性实例包括细胞、细胞提取物、组织样品、电泳凝胶、分析混合物和杂化反应混合物。
"固体载体"是指本领域已知的用于分子的固相载体的任何固体基底，例如"微粒"是指可用于连接本公开化合物的许多小颗粒中的任何一个，包括但不限于玻璃珠、磁珠、聚合物珠粒、非聚合物珠粒等。在某些实施方案中，微粒包含聚苯乙烯珠。
"固体载体残基"是指当分子从固体载体裂解时保持与分子连接的官能团。固体载体残基是本领域已知的，并且可以基于固体载体的结构和将分子连接到其上的基团而容易地衍生。
"靶向结构部分"是与特定靶标(例如分析物分子)选择性结合或缔合的结构部分。"选择性地"结合或缔合是指相对于其它靶标，靶向结构部分优先与所需靶标缔合或结合。在一些实施方案中，本文公开的化合物包括与靶向结构部分的连接基，以便选择性地将化合物与所考虑的分析物(即，靶向结构部分的靶标)结合或缔合，从而允许检测分析物。示例性靶向结构部分包括但不限于抗体、抗原、核酸序列、酶、蛋白质、细胞表面受体拮抗剂等。在一些实施方案中，靶向结构部分是与细胞上或细胞中的靶特征(例如细胞膜或其它细胞结构上的靶特征)选择性结合或缔合的结构部分，例如抗体，从而允许检测所考虑的细胞。在某些实施方案中，选择性地与所需分析物结合或缔合的小分子也被认为是靶向结构部分。本领域技术人员将理解其它分析物和相应的靶向结构部分将可用于各种实施方案。
"碱基配对结构部分"是指能够经由氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)与互补杂环结构部分杂化的杂环结构部分。碱基配对结构部分包括天然和非天然碱。碱基配对结构部分的非限制性实例是RNA和DNA碱，例如腺苷、鸟苷、胸苷、胞嘧啶和尿苷及其类似物。
本文公开的本公开的实施方案还意在涵盖通过使一个或多个原子被具有不同原子质量或质量数的原子替换而被同位素标记的所有结构(I)或(II)的化合物。可以结合到所公开的化合物中的同位素的实例分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，例如
同位素标记的结构(I)或(II)的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和以下实施例中描述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前采用的未标记的试剂来制备。
"稳定的化合物"和"稳定的结构"是指足够稳固以经受得住从反应混合物中分离至有用的纯度并配制成有效的治疗剂的化合物。
"非必要"或"非必要地"是指随后描述的事件或情形可以发生或可以不发生，且该描述包括其中所述事件或情形发生的情况和其中不发生的情况。例如，"非必要取代的烷基"是指烷基可以被取代或可以没有被取代，并且说明书包括取代的烷基和没有取代的烷基。
"盐"包括酸加成盐和碱加成盐。
"酸加成盐"是指与无机酸和有机酸形成的那些盐，无机酸例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，有机酸例如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、胡萝卜酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
"碱加成盐"是指通过将无机碱或有机碱加成到游离酸中制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下物质的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
结晶可以产生本文所述化合物的溶剂化物。本公开的实施方案包括所述化合物的所有溶剂化物。本文所使用的术语"溶剂化物"是指包含一个或多个本公开化合物分子与一个或多个溶剂分子的聚集体。溶剂可以是水，在这种情况下，溶剂化物可以是水合物。或者，溶剂可以是有机溶剂。因此，本公开的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化形式。本公开的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其他情况下，本公开的化合物可以仅保留外来水或另一种溶剂，或者是水加一些外来溶剂的混合物。
本公开的化合物(例如，结构I或II的化合物)或其盐、互变异构体或溶剂化物的实施方案可以含有一个或多个不对称中心，并且因此可以产生对映异构体、非对映异构体及其它立体异构形式，其可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-或对于氨基酸定义为(D)-或(L)-。本公开的实施方案旨在包括所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术(例如色谱法和分级结晶)拆分。用于制备/离析单个对映异构体的常规技术包括从合适的光学纯前体手性合成或使用例如手性高压液相色谱(HPLC)拆分外消旋体(或盐或衍生物的外消旋体)。当本文所述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心，并且除非另有说明时，否则化合物旨在包括E和Z几何异构体。同样地，还旨在包括所有互变异构形式。
"立体异构体"是指由通过相同键键合的相同原子组成但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本公开考虑了各种立体异构体及其混合物，并且包括"对映异构体"，其是指其分子是彼此不可叠加的镜像的两种立体异构体。
"互变异构体"是指质子从分子的一个原子转移到同一分子的另一个原子。本公开包括任何所述化合物的互变异构体。本领域普通技术人员可容易地得到化合物的各种互变异构形式。
本文使用的化学命名方案和结构图是I.U.P.A.C.命名系统，使用ACD/Name版本9.07软件程序和/或ChemDraw Ultra版本11.0软件命名程序(CambridgeSoft)的修改形式。还使用本领域普通技术人员熟悉的通用名称。
如上所述，在本公开的一个实施方案中，提供了在各种分析方法中用作荧光和/或着色染料的化合物。在其它实施方案中，提供了可用作合成中间体的化合物，所述合成中间体用于制备可用作荧光和/或有色染料的化合物。一般而言，本公开的实施方案涉及荧光和/或着色结构部分的二聚体和更高级聚合物。所述荧光和/或着色结构部分通过连接基连接。不希望受到理论的束缚，据信连接基有助于在荧光和/或着色结构部分之间保持足够的空间距离，使得分子内猝灭减少或消除，从而产生具有高摩尔"亮度"(例如，高荧光发射)的染料化合物。
因此，在一些实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(A)：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M
L
L
L
L
R
R
R
R
R
R
R
R
Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向结构部分、固体载体或互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团或其受保护形式的结构部分；
L'在每次出现时独立地为包含与Q连接的共价键的连接基、包含与靶向结构部分连接的共价键的连接基、包含与分析物分子连接的共价键的连接基、包含与固体载体连接的共价键的连接基、包含与固体载体残基连接的共价键的连接基、包含与核苷连接的共价键的连接基或包含与结构(A)的另外化合物连接的共价键的连接基；
m在每次出现时独立地为0或更大的整数，条件是m的至少一次出现为1或更大的整数；
n是1或更大的整数；
q和w在每次出现时独立地为0至3的整数，条件是q或w的至少一次出现为1。
在一些实施方案中，w是0。
在一些相关实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(I)：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M
L
L
L
R
R
R
R
R
R
R
R
Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向结构部分、固体载体或互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团或其受保护形式的结构部分；
L'在每次出现时独立地为包含与Q连接的共价键的连接基、包含与靶向结构部分连接的共价键的连接基、包含与分析物分子连接的共价键的连接基、包含与固体载体连接的共价键的连接基、包含与固体载体残基连接的共价键的连接基、包含与核苷连接的共价键的连接基或包含与结构(I)的另外化合物连接的共价键的连接基；
m在每次出现时独立地为0或更大的整数，条件是m的至少一次出现为1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在一些相关实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(I)：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M
L
L
L
R
R
R
R
R
R
R
R
Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向结构部分、固体载体或互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团或其受保护形式的结构部分；
L'在每次出现时独立地为包含与Q连接的共价键的连接基、包含与靶向结构部分连接的共价键的连接基、包含与分析物分子连接的共价键的连接基、包含与固体载体连接的共价键的连接基、包含与固体载体残基连接的共价键的连接基、包含与核苷连接的共价键的连接基或包含与结构(I)的另外化合物连接的共价键的连接基；
m在每次出现时独立地为0或更大的整数，条件是m的至少一次出现为1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
结构(I)的化合物中的各种连接基和取代基(例如，M、Q、R
非必要的连接基L
因此，在一些实施方案中，L
在其它实施方案中，对于L
在更多的实施方案中，对于L
在结构(I)的其它不同实施方案中，L
在一些实施方案中，L
其中：
x
在一些实施方案中，x
在一些其它实施方案中，L
在还有的其它实施方案中，对于L
其中L
在不同的实施方案中，对于L
其中L
在前述的各种实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，结构(A)的M
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
其中：
L
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，z是1至30的整数，例如15至30或22至25。在一些实施方案中，z为23。在一些实施方案中，z为21、22、23、24或25。在一些实施方案中，z是1至10，例如3至6的整数。在一些实施方案中，z为3、4、5或6。
在一些实施方案中，L
在一些更具体的实施方案中，L
其中：
R
y
在一些实施方案中，L
其中：
x
y
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，x
在一些实施方案中，y
在一些实施方案中，z为1至6的整数。在其它实施方案中，z为15至30的整数。在其它实施方案中，z是22至25的整数。
在任何前述结构(I)的化合物的一些实施方案中，R
在一些实施方案中，q为0。在一些相关实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(II)：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M
L
L
L
L
R
R
R
R
R
R
R
Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向结构部分、固体载体或互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团或其受保护形式的结构部分；
L'在每次出现时独立地为包含与Q连接的共价键的连接基、包含与靶向结构部分连接的共价键的连接基、包含与分析物分子连接的共价键的连接基、包含与固体载体连接的共价键的连接基、包含与固体载体残基连接的共价键的连接基、包含与核苷连接的共价键的连接基或包含与结构(II)的另外化合物连接的共价键的连接基；
m在每次出现时独立地为0或更大的整数，条件是m的至少一次出现为1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在一些实施方案中，本公开的化合物具有以下结构(II)：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
M
L
L
L
L
R
R
R
R
R
R
R
Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向结构部分、固体载体或互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团或其受保护形式的结构部分；
L'在每次出现时独立地为包含与Q连接的共价键的连接基、包含与靶向结构部分连接的共价键的连接基、包含与分析物分子连接的共价键的连接基、包含与固体载体连接的共价键的连接基、包含与固体载体残基连接的共价键的连接基、包含与核苷连接的共价键的连接基或包含与结构(II)的另外化合物连接的共价键的连接基；
m在每次出现时独立地为0或更大的整数，条件是m的至少一次出现为1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
结构(II)的化合物中的各种连接基和取代基(例如，M、Q、R
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在其它实施方案中，L
非必要的连接基L
因此，在一些实施方案中，L
在其它实施方案中，对于L
在更多的实施方案中，对于L
在还有的其它实施方案中，对于L
其中L
在不同的实施方案中，对于L
其中L
在前述的各种实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在结构(I)的其它不同实施方案中，L
其中
a、b、c和d各自独立地为1-6的整数。
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
其中：
L
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，z是1-30，例如15至30或22至25的整数。在一些实施方案中，z为23。在一些实施方案中，z为21、22、23、24或25。在一些实施方案中，z是1-10，例如3至6的整数。在一些实施方案中，z为3、4、5或6。
在一些实施方案中，L
其中：
R
y
在一些实施方案中，R
在一些相关实施方案中，化合物具有以下结构(IIc)、(IId)、(IIe)或(IIf)：
其中：
L
在一些实施方案中，L
在任何结构(A)、(I)或(II)的化合物的其它实施方案中，R
/>
其中R
在任何结构(A)、(I)或(II)的化合物的其它实施方案中，R
在其它各种实施方案中，R
在任何前述结构(A)、(I)或(II)的化合物的更多不同实施方案中，R
在其它实施方案中，R
连接基L'可以是适合于将Q、靶向结构部分、分析物(例如，分析物分子)、固体载体、固体载体残基、核苷或结构(A)、(I)或(II)的另外化合物连接到结构(A)、(I)或(II)的化合物的任何连接基。有利地，某些实施方案包括使用经选择以增加或优化化合物的水溶性的L'结构部分。在某些实施方案中，L'为亚杂烷基结构部分。在一些其它某些实施方案中，L'包含环氧烷或磷酸二酯结构部分或其组合。
在某些实施方案中，L'具有以下结构：
其中：
m"和n"独立地为1至10的整数；
R
L"是R
在一些实施方案中，m"是4至10的整数，例如4、6或10。在其它实施方案中，n"为3至6的整数，例如3、4、5或6。在一些实施方案中，n"为18-28的整数，例如21-23。
在一些其它实施方案中，L"为亚烷基、亚烷基亚杂环基、亚烷基亚杂环基亚烷基、亚烷基亚环基、亚烷基亚环基亚烷基、亚杂烷基、亚杂烷基亚杂环基、亚杂烷基亚杂环基亚杂烷基、亚杂烷基亚环基或亚杂烷基亚环基亚杂烷基结构部分。在一些其它某些实施方案中，L"包含环氧烷、磷酸二酯结构部分、巯基、二硫化物或马来酰亚胺结构部分或其组合。
在某些前述实施方案中，靶向结构部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。
在一些实施方案中，抗体包括CD3、CD4、FoxP3、TNF-α、IFN-γ、克隆4S.B3、克隆206D、CD8α(D8A8Y)兔mAb、波形蛋白(D21H3)
在任何前述结构(A)、(I)或(II)的化合物的其它更具体的实施方案中，R
在任何前述结构(A)、(I)或(II)的化合物的其它更具体的实施方案中，R
结构(A)、(I)或(II)的化合物的某些实施方案可以根据与本领域已知的用于制备寡核苷酸的那些类似的固相合成方法制备。因此，在一些实施方案中，L'是与固体载体、固体载体残基或核苷连接的连接基。包含活化的脱氧胸苷(dT)基团的固体载体是容易获得的，并且在一些实施方案中，可以用作制备结构(A)、(I)或(II)的化合物的起始材料。因此，在一些实施方案中，R
本领域技术人员将理解，包括上述dT基团仅为了易于合成和经济效率，并且不是必需的。可以使用其它固体载体，并且将导致L'上存在不同的核苷或固体载体残基，或者可以在合成后除去或修饰核苷或固体载体残基。
在其它实施方案中，Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团的结构部分。在其它实施方案中，Q在每次出现时独立地为包含能够与互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团的结构部分。例如，在一些实施方案中，Q'存在于结构(A)、(I)或(II)的另外化合物上(例如，在R
Q基团的类型和Q基团与结构(A)、(I)或(II)的化合物的其余部分的连接性不受限制，条件是Q包含具有形成所需键的适当反应性的结构部分。
在某些实施方案中，Q是在水性条件下水解不敏感的结构部分，但具有足够的反应性以与分析物分子或固体载体上的相应基团(例如，胺、叠氮化物或炔烃)形成键。
结构(A)、(I)或(II)的化合物的某些实施方案包含生物共轭领域中常用的Q基团。例如，在一些实施方案中，Q包含亲核反应性基团、亲电子反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中，Q包含巯基、二硫化物、活化酯、异硫氰酸酯、叠氮化物、炔烃、烯烃、二烯、亲二烯体、酰卤、磺酰卤、膦、α-卤代酰胺、生物素、氨基或马来酰亚胺官能团。在一些实施方案中，活化酯是N-琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯或聚氟代苯基酯。在其它实施方案中，炔烃是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
Q基团可以方便地以受保护的形式提供以增加储存稳定性或其它所需性质，然后在适当的时间除去保护基团以与例如靶向结构部分或分析物共轭。因此，Q基团包括反应性基团的"受保护形式"，包括上文和下表1中所述的任何反应性基团。Q的"受保护形式"是指在预定反应条件下相对于Q具有较低反应性的结构部分，但其可以在优选不降解或不与结构(A)、(I)或(II)的化合物的其它部分反应的条件下转化为Q。本领域技术人员可以基于特定的Q和所需的最终用途和储存条件衍生出Q的适当受保护形式。例如，当Q是SH时，Q的受保护形式包括二硫化物，其可以使用通常已知的技术和试剂还原以显示SH结构部分。
示例性的Q结构部分提供在下表I中。
表1.示例性的Q结构部分
/>
/>
/>
应该指出的是，在一些实施方案中，其中Q是SH，SH结构部分将倾向于与另一个巯基形成二硫键，例如在结构(A)、(I)或(II)的另一种化合物上。因此，一些实施方案包括结构(A)、(I)或(II)的化合物，其为二硫化物二聚体的形式，其中二硫键衍生自SH Q基团。
结构(I)的化合物也包括在某些实施方案的范围内，其中R
其中：
R
L"是包含由Q结构部分与相应的Q'结构部分反应产生的官能团的连接基；和
α是大于1，例如1至100，或1至10的整数。
结构(I')的化合物可由本领域普通技术人员衍生，例如通过二聚或聚合本文提供的结构(I)的化合物。
结构(II)的化合物也包括在某些实施方案的范围内，其中R
其中：
R
L"是包含由Q结构部分与相应的Q'结构部分反应产生的官能团的连接基；和
α是大于1，例如1至100，或1至10的整数。
结构(II')的化合物可由本领域普通技术人员衍生，例如通过二聚或聚合本文提供的结构(II)的化合物。
在其它实施方案中，Q结构部分适宜地被掩蔽(例如，受保护)为二硫化物结构部分，其随后可以被还原以提供活化的Q结构部分，以便结合所需的分析物分子或靶向结构部分。例如，Q结构部分可以被掩蔽为具有以下结构的二硫化物：
其中R是非必要取代的烷基。例如，在一些实施方案中，Q作为具有以下结构的二硫化物结构部分提供：
其中n是1至10的整数，例如6。
在一些其它实施方案中，R
m的值是可以基于期望的荧光和/或颜色强度选择的另一个变量。在一些实施方案中，m在每次出现时独立地为1至10的整数。在其它实施方案中，m在每次出现时独立地为1至5的整数，例如1、2、3、4或5。
在其它实施方案中，m在每次出现时独立地为大于2的整数，并且z为15至30的整数，例如在一些实施方案中，m在每次出现时独立地为大于2的整数，例如3、4、5或6，并且z为22至25的整数。
还可以通过选择不同的n值来调节荧光强度。在某些实施方案中，n为1至100的整数。在其它实施方案中，n是1至10的整数。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，n为5。在一些实施方案中，n为6。在一些实施方案中，n为7。在一些实施方案中，n为8。在一些实施方案中，n为9。在一些实施方案中，n为10。
q的值是可以基于期望的荧光和/或颜色强度选择的另一个变量。在一些实施方案中，q在每次出现时独立地为0至3的整数。例如，在一些实施方案中，q为0。在一些实施方案中，q为1。在一些实施方案中，q为2。在一些实施方案中，q为3。
w的值是可以基于期望的荧光和/或颜色强度选择的另一个变量。在一些实施方案中，w在每次出现时独立地为0至3的整数。例如，在一些实施方案中，w为0。在一些实施方案中，w为1。在一些实施方案中，w为2。在一些实施方案中，w为3。
基于期望的光学性质，例如基于期望的颜色和/或荧光发射波长来选择M
M
在一些实施方案中，M
本公开的化合物可用作具有高量子效率的荧光和/或着色染料。这部分地归因于供体结构部分(例如，M
在一些实施方案中，提供了具有在400和800nm之间的激发最大值和在500和500nm之间的发射最大值的FRET受体。例如，在一些实施方案中，FRET受体5-羧基荧光素(FAM)具有495nm激发最大值和519nm发射最大值。在另一个实例中，在一些实施方案中，FRET受体包括具有548nm激发最大值和566nm发射最大值的Alexa
本公开的实施方案允许FRET供体/受体对的各种组合以增强亮度作为传感器。例如，在一些实施方案中，FRET供体/受体对是作为FRET供体的2,5-二苯基
在任何前述实施方案的其它实施方案中，M
在一些实施方案中，M
在任何前述结构(A)、(I)、(II)、(I')或(I")的化合物的其它实施方案中，M
在任何上述实施方案的更多实施方案中，M
在前述实施方案的一些甚至更具体的实施方案中，M
在任何前述实施方案的更多实施方案中，M
在一些实施方案中，M
在一些实施方案中，M
尽管包含羧酸基团的M
在一些实施方案中，M
/>
/>
/>
在一些具体实施方案中，结构(A)、(I)或(II)的化合物是选自表2的化合物。根据实施例中给出的程序制备表2中的化合物，并通过质谱法确认它们的身份。
表2.结构(A)、(I)或(II)的示例性化合物
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
*TBD＝待测定
如表2和整个本公开中所用那样，R
如表2和整个本公开中所用那样，Fx在每次出现时独立地是指具有以下结构之一的荧光或着色结构部分：
在一些实施方案中，Fx是荧光素。本领域众所周知，荧光素结构部分在醌型、两性离子型和乳型(lactoid)形式之间互变异构。本领域技术人员将容易理解，所述形式取决于pH，并且每种形式(例如醌型、两性离子型和乳型)也包括在本公开的实施方案的范围内。
如上表2和整个本公开中所用那样，M
FAM是指具有以下结构之一的结构部分：
AF594是指具有以下结构的结构部分：
Cy3是指具有以下结构之一的结构部分：
AF680是指具有以下结构的结构部分：
如上表2和整个本公开中所用那样，dT是指以下结构：
其中：
R是H或直接键。
一些实施方案包括与靶向结构部分(例如抗体)共轭的任何前述化合物，包括表2中提供的具体化合物。在一些实施方案中，抗体包括CD3、CD4、FoxP3、TNF-α、IFN-γ、克隆4S.B3、克隆206D、CD8α(D8A8Y)兔mAb、波形蛋白(D21H3)
本公开总体上提供相对于早期已知的化合物具有增加的荧光发射的化合物。因此，某些实施方案涉及包含Y个荧光结构部分M的荧光化合物，其中所述荧光化合物在用预定波长的紫外光激发时具有的峰值荧光发射是单个M结构部分在用相同波长的紫外光激发时的峰值荧光发射的Y倍的至少85％，并且其中Y是2或更大的整数。荧光化合物包括在用光(例如紫外光)激发时发射荧光信号的化合物。
在一些实施方案中，荧光化合物的峰值荧光发射比单个M结构部分的峰值荧光发射大Y倍的至少90％、大Y倍的95％、大Y倍的97％或大Y倍的99％。
在一些实施方案中，Y是2至100，例如2至10的整数。
在一些实施方案中，Y个M结构部分独立地具有以下结构之一：
其中
在其它实施方案中，单个M结构部分独立地具有以下结构之一：
/>
在更具体的实施方案中，荧光化合物包括Y个M结构部分，其独立地具有以下结构之一：
其中
在一些实施方案中，Y个M结构部分独立地具有以下结构之一：
/>
/>
/>
在其它实施方案中，峰值荧光发射处于约500至约550nm范围内的波长。
在更多实施方案中，荧光化合物包含至少一个环氧乙烷结构部分。
还提供了包含结构(A)、(I)或(II)中任一个的荧光化合物和分析物的组合物。
本发明公开的化合物是"可调的"，这是指通过适当选择任何前述化合物中的变量，本领域技术人员可以得到具有所需和/或预定摩尔荧光(摩尔亮度)的化合物。化合物的可调性允许用户容易地获得具有所需荧光和/或颜色的化合物，以便用于特定分析或用于识别所考虑的特定分析物。尽管所有变量可能对化合物的摩尔荧光有影响，但认为M、L
在某些实施方案中，摩尔荧光可以按照相对于母体荧光团(例如，单体)的荧光发射的倍数增加或减少来表示。在一些实施方案中，本发明化合物的摩尔荧光相对于母体荧光团为1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或甚至更高。各种实施方案包括通过适当选择L
为了便于说明，包含磷结构部分(例如磷酸根等)的各种化合物被描绘为处于阴离子状态(例如-OPO(OH)O
在各种其它实施方案中提供了包含任何前述化合物和一种或多种分析物分子(例如，生物分子)的组合物。在一些实施方案中，还提供了此类组合物在用于检测一种或多种分析物分子的分析方法中的用途。
在还有的其它实施方案中，化合物可用于各种分析方法。例如，在某些实施方案中，本公开提供了样品的染色方法，所述方法包括向所述样品中添加结构(A)、(I)或(II)的化合物，例如其中R
在前述方法的一些实施方案中，R
在前述方法的其它实施方案中，R
在甚至更多的实施方案中，所述光学响应是荧光响应。
在其它实施方案中，所述样品包含细胞，并且一些实施方案还包括通过流式细胞术(flow cytometry)观察所述细胞。
在更多实施方案中，所述方法还包括将荧光响应与具有可检测不同的光学性质的第二荧光团的荧光响应区分开。
在其它实施方案中，本公开提供了目视检测分析物分子(例如生物分子)的方法，其包括：
(a)提供结构(A)、(I)或(II)的化合物，例如，其中R
(b)通过所述化合物的可见性质检测它。
在一些实施方案中，分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在更多的实施方案中，分析物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适体或朊病毒。
在其它实施方案中，提供了目视检测分析物分子(例如生物分子)的方法，所述方法包括：
(a)将任何前述化合物与一种或多种分析物分子掺混；和
(b)通过所述化合物的可见性质检测它。
在其它实施方案中，提供了目视检测分析物分子的方法，所述方法包括：
(a)将结构(A)、(I)或(II)的化合物与分析物分子掺混，其中R
(b)形成所述化合物和分析物分子的共轭物；和
(c)通过所述共轭物的可见性质检测它。
其它示例性方法包括检测分析物的方法，所述方法包括：
(a)提供结构(A)、(I)或(II)的化合物，其中R
(b)将所述化合物和分析物掺混，从而将所述靶向结构部分和所述分析物缔合；和
(c)检测所述化合物，例如通过其可见或荧光性质检测。
在前述方法的某些实施方案中，分析物是颗粒，例如细胞，并且所述方法包括使用流式细胞术。例如，化合物可以具备靶靶向结构部分(例如抗体)，用于选择性地与所需细胞缔合，从而使细胞可通过任何数量的技术(例如可见光或荧光检测)检测。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在其它实施方案中，抗体是单克隆抗体。本领域普通技术人员可以根据所需的最终用途选择适当的抗体。用于某些实施方案的示例性抗体包括CD3(克隆UCHT1)、CD4(克隆OKT4)、FoxP3、TNF-α、IFN-γ、克隆4S.B3、克隆206D、CD8α(D8A8Y)兔mAb、波形蛋白(D21H3)
在某些实施方案中，形成包含结构(A)、(I)或(II)的化合物和分析物的共轭物的共轭效率大于约80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、98.5％或99％。
在还有的其它实施方案中，本公开提供增加染料亮度的方法，所述方法包括：
(a)提供包含结构(A)、(I)或(II)的化合物的染料溶液；和
(b)将所述染料溶液熟化一段时间。
在一些实施方案中，将染料溶液熟化至少一周。例如，在一些实施方案中，将染料溶液在使用前熟化约三周。
染料溶液可包括各种缓冲液。在一些实施方案中，染料包含ETOH。在一些实施方案中，染料溶液包含BDbrilliant。在一些实施方案中，染料溶液包含氯化钠或氯化钾。
因此，本发明化合物的实施方案可用于许多方法，包括但不限于：细胞计数；细胞分选；生物标志物检测；定量细胞凋亡；测定细胞存活力；鉴定细胞表面抗原；确定总DNA和/或RNA含量；鉴定特异性核酸序列(例如，作为核酸探针)；和诊断疾病，如血癌。
除了上述方法之外，结构(A)、(I)或(II)的化合物的实施方案可用于各种学科和方法，包括但不限于：用于鉴定癌性及其它组织的内窥镜检查程序中的成像；单细胞和/或单分子分析方法，例如在很少或没有扩增的情况下检测多核苷酸；癌症成像，例如通过在结构(A)、(I)或(II)的化合物中包括靶向结构部分，例如抗体或糖或优先结合癌细胞的其它结构部分；外科手术中的成像；用于鉴定各种疾病的组蛋白结合；药物递送，例如通过用活性药物结构部分替换结构(A)、(I)或(II)的化合物中的M结构部分；和/或牙科工作及其它程序中的造影剂，例如通过结构(I)的化合物与各种菌群和/或生物体的优先结合。
应当理解，如上所述的结构(I)的化合物的任何实施方案，以及本文对如上所述的结构(I)的化合物中的R
还应理解，如上所述的结构(II)的化合物的任何实施方案和本文对如上所述的结构(II)的化合物中的R
应当理解，在本说明书中，所描绘的式的取代基和/或变量的组合仅在这样的贡献产生稳定化合物时才是允许的。
本领域技术人员还将理解，在本文所述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要通过合适的保护基团进行保护。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的合适保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的合适保护基包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。巯基的合适保护基包括-C(O)-R″(其中R″是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据本领域技术人员已知的和如本文所述的标准技术添加或除去保护基团。保护基团的使用详细描述于Green,T.W.和P.G.M.Wutz，Protective Groups in OrganicSynthesis(1999)，第3版，Wiley中。如本领域技术人员将领会的那样，保护基团还可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯化物树脂。
此外，以游离碱或酸形式存在的本公开的所有化合物可以通过本领域技术人员已知的方法用适当的无机或有机碱或酸处理而转化为其盐。本公开化合物的盐可以通过标准技术转化为其游离碱或酸形式。
以下反应流程显示了制备本公开的结构(A)、(I)或(II)的化合物的示例性方法。应当理解，本领域技术人员能够通过类似的方法或通过组合本领域技术人员已知的其它方法来制备这些化合物。还应理解，本领域技术人员将能够按如下所述的类似方式通过使用适当的起始组分并根据需要修改合成参数来制备下文未具体显示的结构(A)、(I)或(II)的另外化合物。通常，起始组分可以从来源如Sigma Aldrch、Lancaster Synthesis，Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等获得，或根据本领域技术人员已知的来源合成(参见，例如，Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，andStructure，第5版(Wiley，2000年12月))或如本公开中所述那样制备。
反应流程I
反应方案I示出了用于制备可用于制备结构(I)的化合物的中间体的示例性方法，其中R
反应流程II
反应流程II显示了用于制备可用于制备结构(I)的化合物的中间体的替代方法。参照反应流程II，其中R
结构(I)的化合物可以由结构b或d之一通过在熟知的自动化DNA合成条件下与具有以下结构(e)的亚磷酰胺(phosphoramidite)化合物反应来制备：
其中L是非必要的连接基。
DNA合成方法是本领域熟知的。简言之，两个醇基团，例如上述中间体b或d中的R
在低聚方法中使用的亚磷酰胺的制备也是本领域公知的。例如，伯醇(例如R
根据上述公知的亚磷酰胺化学，通过中间体b或d和e的低聚制备结构(I)的化合物。通过将亚磷酰胺偶联重复所需次数，将所需数量的m和n重复单元结合到分子中。应当理解，如下所述的结构(III)的化合物可以通过类似的方法制备。
另外，本公开的化合物可以根据PCT公开号WO 2016/183185；WO 2017/173355和WO2017/177065中描述的方法制备，其各自通过引用并入本文。
在各种其它实施方案中，提供了可用于制备结构(I)的化合物的化合物。化合物可以如上所述以单体、二聚体和/或低聚形式制备，然后M结构部分经由任何数量的合成方法(例如，上述"点击"反应)与所述化合物共价连接以形成结构(I)的化合物。因此，在各种实施方案中，提供了具有以下结构(III)的化合物：
或其立体异构体、盐或互变异构体，其中：
G
L
L
L
R
R
R
R
R
R
R
R
Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向结构部分、固体载体或互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团或其受保护形式的结构部分；
L'在每次出现时独立地为包含与Q连接的共价键的连接基、包含与靶向结构部分连接的共价键的连接基、包含与分析物分子连接的共价键的连接基、包含与固体载体连接的共价键的连接基、包含与固体载体残基连接的共价键的连接基、包含与核苷连接的共价键的连接基或包含与结构(III)的另外化合物连接的共价键的连接基；
m在每次出现时独立地为0或更大的整数，条件是m的至少一次出现为1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
其中：
L
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，L
其中：
R
y
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，R
在一些实施方案中，L
其中：
x
y
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，x
在一些实施方案中，x
在一些实施方案中，y
在一些实施方案中，z是15至30的整数。在其它实施方案中，z是22至25的整数。
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，R
在一些实施方案中，L
反应流程III
反应流程III显示了制备可用于制备结构(II)的化合物的中间体的方法。参照反应流程III，其中L
结构f的化合物可以使用众所周知的亚磷酰胺化学通过低聚来制备。申请人已经发现了可用于合成结构f的化合物的中间体化合物。因此，一个实施方案提供了具有以下结构h的化合物：
其中：
n
n
X是O或直接键；
R
R
R
在化合物(h)的一些实施方案中，n
在化合物(h)的一些实施方案中，n
在化合物(h)的一些实施方案中，X为直接键。在一些实施方案中，X是O。
在化合物(h)的一些实施方案中，R
在一些实施方案中，R
其中：
R
R
在化合物(h)的一些实施方案中，R
在一些实施方案中，R
在某些具体实施方案中，R
在化合物(h)的一些实施方案中，R
在化合物(h)的一些实施方案中，R
在各种其它实施方案中，提供了可用于制备结构(II)的化合物的化合物。化合物可以如上所述以单体、二聚体和/或低聚形式制备，然后M结构部分经由任何数量的合成方法(例如，上述"点击"反应)与所述化合物共价连接以形成结构(II)的化合物。因此，在各种实施方案中，提供了具有以下结构(IV)的化合物：
其中：
G
L
L
L
L
R
R
R
R
R
R
R
Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、靶向结构部分、固体载体或互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团或其受保护形式的结构部分；
L'在每次出现时独立地为包含与Q连接的共价键的连接基、包含与靶向结构部分连接的共价键的连接基、包含与分析物分子连接的共价键的连接基、包含与固体载体连接的共价键的连接基、包含与固体载体残基连接的共价键的连接基、包含与核苷连接的共价键的连接基或包含与结构(IV)的另外化合物连接的共价键的连接基；
m在每次出现时独立地为0或更大的整数，条件是m的至少一次出现为1或更大的整数；和
n是1或更大的整数。
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在一些实施方案中，L
其中：
L
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，L
其中：
R
y
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，R
其中：
L
y
z是1至100的整数。
在一些实施方案中，z为15至30的整数。在其它实施方案中，z是22至25的整数。
在一些实施方案中，L
其中
a、b、c和d各自独立地为1-6的整数。
例如，在某些实施方案中，L
在一些特定实施方案中，L
在一些实施方案中，L
在结构(III)或(IV)的其它实施方案中，G在每次出现时独立地为包含能够与互补反应性基团形成共价键的反应性基团的结构部分。
结构(III)或(IV)的化合物中的G
在一些实施方案中，G
在其它实施方案中，G
在化合物(III)或(IV)的任何前述实施方案中，G
在化合物(III)或(IV)的一些实施方案中，G
在化合物(III)或(IV)的一些实施方案中，G
在一些实施方案中，G
在一些前述实施方案中，胺的受保护形式是三氟乙酸盐保护的胺。在一些实施方案中，胺的受保护形式是BOC保护的胺。在一些实施方案中，胺的受保护形式是Fmoc保护的胺。例如，在某些实施方案中，G
在更具体的实施方案中，G在每次出现时独立地具有以下结构之一：
/>
在一些实施方案中，R
在结构(III)或(IV)的化合物的其它各种实施方案中，R
在任何前述结构(III)或(IV)化合物的更多不同实施方案中，R
在结构(III)或(IV)的其它实施方案中，R
连接基L'可以是适合于将Q、靶向结构部分、分析物(例如，分析物分子)、固体载体、固体载体残基、核苷或结构(III)或(IV)的另外化合物连接到结构(III)或(IV)的化合物上的任何连接基。有利地，某些实施方案包括使用经选择以增加或优化化合物的水溶性的L'结构部分。在某些实施方案中，L'包含环氧烷或磷酸二酯结构部分或其组合。
在某些实施方案中，L'具有以下结构：
其中：
m"和n"独立地为1至10的整数；
R
L"是R
在某些前述实施方案中，靶向结构部分是抗体或细胞表面受体拮抗剂。在一些实施方案中，抗体包括CD3、CD4、FoxP3、TNF-α、IFN-γ、克隆4S.B3、克隆206D、CD8α(D8A8Y)兔mAb、波形蛋白(D21H3)
在任何前述结构(III)或(IV)的化合物的其它更具体的实施方案中，R
结构(III)或(IV)的化合物的某些实施方案可以根据与本领域已知的用于制备寡核苷酸的那些类似的固相合成方法制备。因此，在一些实施方案中，L'是与固体载体、固体载体残基或核苷连接的连接基。包含活化的脱氧胸苷(dT)基团的固体载体是可容易获得的，并且在一些实施方案中，可以用作制备结构(III)或(IV)的化合物的起始材料。因此，在一些实施方案中，R
在结构(III)或(IV)的化合物的其它实施方案中，Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团的结构部分。在其它实施方案中，Q在每次出现时独立地为包含能够与互补反应性基团Q'形成共价键的反应性基团的结构部分。例如，在一些实施方案中，Q'存在于结构(III)或(IV)的另外化合物上(例如，在R
Q基团的类型和Q基团与结构(III)或(IV)的化合物的其余部分的连接性不受限制，条件是Q包含具有形成所需键的适当反应性的结构部分。
在结构(III)或(IV)的化合物的某些实施方案中，Q是在水性条件下对水解不敏感的结构部分，但具有足够的反应性以与分析物分子或固体载体上的相应基团(例如，胺、叠氮化物或炔烃)形成键。
结构(III)或(IV)的化合物的某些实施方案包含生物共轭领域中常用的Q基团。例如，在一些实施方案中，Q包含亲核反应性基团、亲电子反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中，Q包含巯基、二硫化物、活化酯、异硫氰酸酯、叠氮化物、炔烃、烯烃、二烯、亲二烯体、酰卤、磺酰卤、膦、α-卤代酰胺、生物素、氨基或马来酰亚胺官能团。在一些实施方案中，所述活化酯是N-琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯或聚氟代苯基酯。在其它实施方案中，炔烃是烷基叠氮化物或酰基叠氮化物。
结构(III)或(IV)的化合物的示例性Q结构部分在上表I中提供。
与结构(A)、(I)或(II)的化合物一样，在其中Q为SH的结构(III)或(IV)的化合物的一些实施方案中，SH结构部分将倾向于与另一种结构(III)或(IV)的化合物上的另一个巯基形成二硫键。因此，一些实施方案包括结构(III)或(IV)的化合物，其呈二硫化物二聚体的形式，其中二硫键衍生自SHQ基团。
在结构(III)或(IV)的化合物的一些其它实施方案中，R
在结构(III)或(IV)的化合物的其它实施方案中，m在每次出现时独立地为0至10的整数。例如，在一些实施方案中，m在每次出现时独立地为1至5的整数，例如1、2、3、4或5。在一些实施方案中，m为0。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，m为2。在一些实施方案中，m为3。在一些实施方案中，m为4。在一些实施方案中，m为5。
在结构(III)或(IV)的化合物的不同实施方案中，n为1至100的整数。例如，在一些实施方案中，n是1至10的整数。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，n为2。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，n为5。在一些实施方案中，n为6。在一些实施方案中，n为7。在一些实施方案中，n为8。在一些实施方案中，n为9。在一些实施方案中，n为10。
在结构(III)或(IV)的化合物的一些具体实施方案中，n为3且对于每个n值，m值为1、1和0(例如，化合物IV-7)。在结构(III)或(IV)的化合物的其它实施方案中，n为2并且对于每个n值，m值为1和0(例如，化合物IV-8)。
在结构(III)或(IV)的化合物的不同实施方案中，z为1-30的整数，例如15至30或22至25。在一些实施方案中，z为23。在一些实施方案中，z为21、22、23、24或25。在一些实施方案中，z是1至10，例如3至6的整数。在一些实施方案中，z为3、4、5或6。
在其它不同的实施方案中，结构(III)或(IV)的化合物选自表3。
表3.结构(III)或(IV)的示例性化合物
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
在各种实施方案中，表3的化合物中的G
结构(III)或(IV)的化合物可以用于各种方法中，例如在实施方案中提供了标记分析物(例如分析物分子)或靶向结构部分的方法，该方法包括：
(a)将任何所述的结构(III)或(IV)的化合物与分析物分子或靶向结构部分掺混，其中R
(b)形成所述化合物和所述分析物分子或靶向结构部分的共轭物；和
(c)使所述共轭物与式M-L
M
L
G
一个不同的实施方案是标记分析物(例如分析物分子或靶向结构部分)的方法，所述方法包括：
(a)将本文公开的任何结构(III)或(IV)的化合物(其中R
(b)使步骤(A)的产物与分析物分子或靶向结构部分反应，从而形成步骤(A)的产物与分析物分子或靶向结构部分的共轭物，其中：
M
L
G
此外，如上所述，结构(III)的化合物可用于制备结构(I)的化合物，并且结构(IV)的化合物可用于制备结构(II)的化合物。因此，在一个实施方案中提供了制备结构(I)的化合物的方法，所述方法包括将结构(III)的化合物与式M-L
其中：
M
L
G'是与G互补的反应性基团。
以下实施例是出于说明而非限制目的提供的。
实施例
一般方法
使用MassLynx 4.1采集软件在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(仅MS模式)上进行质谱分析。用于染料上的LC/MS的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)、8.6mM三乙胺(TEA)，pH 8。还使用具有保持在45℃的2.1mm×50mm Acquity BEH-C18柱的Waters Acquity UHPLC系统，采用乙腈/水流动相梯度分析亚磷酰胺和前体分子。在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS系统(仅MS模式)上使用
除非另有说明，否则所有反应均在氮气气氛下在烘箱干燥的玻璃器皿中进行。可商购获得的DNA合成试剂购自Glen Research(Sterling,VA)。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基乙胺、三乙胺、乙酸、吡啶和THF购自Aldrich。所有其它化学品均购自Aldrich或TCI，并且原样使用而无需额外纯化。
实施例1
含亚烷基-聚乙二醇-亚烷基间隔基的染料的合成
如下制备具有亚烷基-聚环氧乙烷-亚烷基连接基的化合物：
寡氟苷(oligofluoroside)构建体(即，结构(I)或(II)的化合物)在AppliedBiosys tems 394DNA/RNA合成仪上以1μmol规模合成，并且具有3'-磷酸酯基团或3'-S
在标记的Eppendorf管中以0.2μmol规模在受控孔玻璃(CPG)载体上提供化合物。加入400μL 20-30％NH
通过ESI-MS、UV-吸光度和荧光光谱表征产物。
实施例2
来自流式细胞术测量的对比染色指数
根据实施例1制备包含丙烯/磷酸酯/聚乙二醇/磷酸酯/丙烯间隔物(C3-PEG-C3)和3、5、7或10个荧光团结构部分(分别称为C3-3xFAM、C3-5xFAM、C3-7xFAM和C3-10xFAM)的结构(I)的代表性化合物。进行结构(I)的代表性化合物、对照化合物PEG-5xFAM、荧光素(FITC)和Alexa
表4
/>
/>
如表4中所用那样，R
染色指数的数据显示，通过在PEG连接基团周围引入包括丙烯(C3)连接基团的连接基团，根据本公开的实施方案的化合物具有比FITC和AF488的亮度高约4-7倍的亮度。根据本公开的实施方案的化合物还显示出比含有相同量的荧光团(即染料)的相应对照化合物(PEG-5xFAM)更高的亮度。增加的亮度可能是由于通过在PEG周围引入丙烯连接基团导致荧光团结构部分之间的更多空间分离。
实施例3
随时间的对比荧光发射响应
将包含C3-PEG-C3间隔基和3、5、7或10个荧光团结构部分的结构(I)的化合物(即，表4中提供的化合物C3-3xFAM、C3-5xFAM、C3-7xFAM和C3-10xFAM)的荧光发射稳定性与相应的对照化合物FITC、AF488进行比较。结果总结在表5中。数据显示，根据本公开的实施方案的化合物具有随时间增加的荧光发射。三周后，根据本公开的实施方案的所有化合物的亮度增加，而对照化合物、FITC和AF488的亮度保持相同。随时间增加的亮度可能是由于随着结构(I)的化合物随时间"老化"而增加的分离效率(图2)。
表5
实施例4
一般流式细胞术方法
除非另有说明，否则在整个以下实施例中使用以下一般程序：
全血的裂解：
经缓冲氯化铵法.对于活细胞的染色，用氯化铵溶液(ACK)大量裂解乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的正常人血液，在室温(RT)下将15ml血液裂解至35ml 15分钟。将细胞用50％Hank的平衡盐溶液(HBSS)和50％1％胎牛血清(FBS)1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，所述PBS具有0.02％叠氮化钠。然后将细胞在供体血浆中重悬至100μl/测试/0.1-1×10e6。将血浆中的细胞加入到聚丙烯96孔HTS板中的100μL 1％牛血清蛋白(BSA)和1x DPBS与0.02％叠氮化钠的预稀释的V
裂解/固定方法.用1.0mL RBC裂解溶液(氯化铵)裂解血液，在室温下将100-15mL血液裂解至35mL 15分钟。然后将细胞用50％HBSS和50％-1％FBS1x DPBS与0.02％叠氮化钠洗涤两次。然后将细胞在供体血浆中重悬至100μl/测试/1×10e6。将预稀释的抗体加入100μL含有0.02％叠氮化钠的1％BSA和1x DPBS中。将100μL细胞加入到96孔聚丙烯HTS板(总共200μL测试尺寸)中。在室温下温育45分钟后，将细胞用50％HBSS和50％1％FBS1xDPBS与0.02％叠氮化钠洗涤两次。抗体共轭物的制备：
抗体共轭物如下制备：使包含具有以下结构的Q结构部分的结构(I)或(II)的化合物：
与所需抗体反应。化合物和抗体因此通过所述抗体上的S与所述Q结构部分的反应共轭以形成以下连接结构：
抗体共轭物由抗体名称后接化合物编号表示。例如，UCHT1-C3-3xFx指示在UCHT1抗体与包含C3连接基和三(3)个荧光团(Fx)的结构(I)的化合物之间形成的共轭物。如果引用的化合物编号不包括表1中的上述Q结构部分，则应理解安装Q结构部分并且共轭物由具有Q结构部分的所得化合物制备。
共轭物的稀释：
使抗体达到室温.将抗体共轭物在细胞染色缓冲液(1X DPBS、1％BSA、0.02％叠氮化钠)中稀释至0.1-540nM(每次测试8.0微克或更少)范围内的浓度。在一些实例中，每个样品的连续稀释开始于细胞染色缓冲液中的269nM抗体，并且抗体稀释液保持避光直至使用。在其它实验中，稀释以4.0μg抗体/测试大小开始，测试大小范围为100-200μL。以两倍或四倍稀释进行滴度以产生结合曲线。在一些情况下，在稀释系列中的第一孔中使用8.0或2.0μg/测试大小。
用共轭物的流式细胞术：
在物理表征后，测试共轭物的活性和功能性(抗体结合亲和力和染料亮度)并与参照抗体染色进行比较。然后通过使用流式细胞仪检查与自发荧光阴性对照相比的亮度及其它非特异性结合来确定分辨率的质量。全血筛选是测试共轭物的最常规方法。在形成新构建体时实施桥联研究。
进行游离染料流式细胞术：
在分子和物理表征之后，还测试了染料与参照染料染色剂相比对细胞的潜在亲和力。因为染料也具有作为细胞探针和结合细胞材料的潜力，所以通常可以在高浓度(>100nM至10,000nM)下针对血液筛选染料以确定特定特征。然后通过使用流式细胞仪与自发荧光阴性对照及其它染料对照相比评估稀释后的亮度和线性度来鉴定预期或意外的脱靶结合。
流式细胞术工作流程：
培养细胞并观察代谢应激的视觉迹象以进行染料筛选或脱靶结合(数据未显示)，或者使用新鲜的健康细胞进行共轭物筛选。定期计数细胞以检查细胞密度(1×10e5和1×10e6活细胞/mL)。稀释抗体共轭物(优选在板或管中)，然后在染色缓冲液(DPBS，0.1％BSA，0.02％叠氮化钠)中收获细胞。使用活力范围为80-85％的细胞。通过离心洗涤细胞两次，并用缓冲液洗涤细胞以除去pH指示剂，并用含于FBS中的Ig及其它蛋白封闭细胞。在染色缓冲液中将细胞密度调节至测试大小。将细胞铺板，每孔一次测试，或将染料(预稀释的)施加于板中的细胞。然后，将细胞在23℃下温育45分钟。通过离心洗涤细胞两次，并用洗涤缓冲液洗涤细胞，然后吸出板。将细胞重悬于采集缓冲液中。通过流式细胞术获得5000个完整细胞。
通过流式细胞术通过488nM蓝色激光线检测染料的荧光，其中使用525/50带通滤波器检测峰值发射(521nM)。通过流式细胞术获得至少1500个完整细胞，靶获得3000-5000个完整细胞，并分析以鉴定细胞制剂中存在的活细胞。
数据分析方法：
描述性统计.EC-800软件允许用户收集每个样品采集的许多统计数据。FL1-A通道中的平均或中值荧光强度(MFI)用于测量抗体-染料试剂在通过流式细胞术询问时和在审查噪声时的亮度。评估其它统计学以确定染料特征和试剂的总体质量，包括中值信噪比和绝对荧光(中值或几何平均值)。
直方图.流式细胞术事件通过前向散射相对于侧向散射的大小(细胞体积相对于细胞粒度)进行门控。然后通过515nm处的荧光发射门控那些细胞的平均荧光强度(MFI)。收集的数据呈现为双参数直方图，其绘制为y轴上的事件数量相对于x轴上的对数标度表示的荧光强度。数据可以通过亲和力曲线或相对荧光强度的直方图来总结。
结合曲线.选择MFI，因为它是在通过FCM询问抗体-染料试剂时最佳测量抗体-染料试剂亮度的参数，这可以表示为几何平均值、中值或平均值，并且表示绝对荧光测量值。为了比较，在噪声可以被高度表征的情况下，信噪比被报道为MFI，S/N。
二变量、双参数直方图.在一些情况下，不对FCM事件进行门控以检查定性输出，并且数据由细胞粒度(SSC)相对于染料荧光表示。该方法允许对全血中回收的所有集群进行总体评估。
实施例5
对照化合物(间隔物＝PEG)和结构(I)的化合物(间隔物＝丙烯/磷酸酯/PEG/磷酸酯/丙烯(C3-PEG-C3))序列的流式细胞术分析将各种染料上的构建体与CD4(克隆OKT4)抗体共轭，并在1x d-PBS(磷酸盐缓冲盐水)中洗脱。使用的染料包括FAM、太平洋蓝(PB)、Alexa
表6示出了具有PEG间隔基的对照化合物与具有C3-PEG-C3间隔基的结构(I)的化合物之间的染色指数(SI)的差异。具有C3-PEG-C3间隔基的结构(I)的化合物具有比具有PEG间隔基的相应对照化合物和市场上现有化合物更高的SI值。具有C3-PEG-C3间隔基的结构(I)的化合物还显示SI值随着主链上荧光团数量的增加而增加。
表6
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如表6中所用那样，R
FAM是指具有以下结构之一的结构部分：
PB是指具有以下结构的结构部分：
AF532是指具有以下结构的结构部分：
AF660是指具有以下结构的结构部分：
实施例6
CD3(克隆UCHT1)抗体与对照化合物(PEG-5x-FAM)或结构(I)的化合物(C3-3x-FAM、C3-5x-FAM、C3-7x-FAM或C3-10x-FAM)构建体共轭。将0.5μg抗体共轭物在Dulbecco 1xPBS中稀释，并使用反向移液混合，并在Synergy板阅读器上在488nm发射处分析。通过取信号强度并除以DOL来说明标记程度(DOL)，然后绘图。对照化合物(PEG-5xFAM)和结构(I)的化合物(C3-3xFAM、C3-5xFAM、C3-7xFAM或C3-10xFAM)的体外分析结果总结在图3中。如图3所示，C3-10xFAM构建体与PEG-5xFAM构建体一样明亮。随着结构(I)化合物主链上荧光团数量的增加，相应化合物的信号强度增加。C3-7xFAM和C3-10xFAM构建体如此明亮，以致信号在0.5μg时偏离刻度。
实施例7
将染料构建体与CD3(克隆UCHT1)抗体共轭，并在1x d-PBS中洗脱。使用0.5μg抗体共轭物对全血进行染色，并在光谱仪器上筛选。以前，当在水溶液中分析时，已经显示环糊精(CD)增加FAM的亮度。结构(I)的化合物构建体(C3-5xFAM和C3-7xFAM)比对照化合物构建体(PEG-5x-FAM)更亮，即使将环糊精(CD)添加到对照化合物构建体(PEG-5x-FAM)的马来酰亚胺中。缓冲液对对照化合物和结构(I)的化合物构建体的染色指数的影响总结在表7中。化合物PEG-5xFAM、C3-5xFAM和C3-7xFAM的结构提供于表6中。
表7
2mM NaPO
实施例8
亚磷酰胺和化合物的制备
使用标准固相寡核苷酸合成规程和具有以下结构的含荧光素的亚磷酰胺制备示例性化合物：
其从ChemGenes(目录号CLP-9780)购买。
通过与具有以下结构的亚磷酰胺偶联将示例性连接基(L
其也可商购。
通过与具有以下结构之一的亚磷酰胺偶联将示例性连接基(L
其也可商购。
使用根据以下方案制备的亚磷酰胺制备其它示例性化合物：
最终脱保护产生所需的Fx结构部分。适当地使用其它市售的亚磷酰胺试剂来安装化合物的各个部分。具有以下结构的Q结构部分：
通过使
与游离巯基反应而安装。根据本领域普通技术人员的知识，以类似的方式安装其它Q结构部分。
可以组合上述各种实施方案以提供进一步的实施方案。本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开，包括2020年12月7日提交的美国临时专利申请序列号63/122,285和2021年7月8日提交的美国临时专利申请序列号63/219,706通过引用整体并入本文。如果需要，可以修改实施方案的各方面以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供另外的实施方案。根据上述详细说明书，可以对实施方案进行这些及其它改变。通常，在所附权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的特定实施方案，而是应被解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。