环肽抗生素缬氨霉素高产菌株及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株环肽抗生素缬氨霉素高产菌株——链霉菌 IFE-v1m38(Streptomyces sp.IFE-v1m38)，及其在微生物发酵制备缬氨霉素(Valinomycin)中的应用。

(二)背景技术

油菜菌核病是由致病真菌油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一种世界性的真菌自然病害，它兼具土传病害和气传病害的特点，地理分布极广，在五大洲多个国家皆有流行发生。油菜核盘菌最早是在1915 年由印度的Shaw等人报道，1932年朱凤美也首次发表了我国油菜菌核病相关报道。油菜菌核病是我国油菜三大病害(油菜菌核病、霜霉病和病毒病)之首，一般发病率为10～30％，病害严重时可达到80％，病株一般减产10-70％，严重时甚至绝收。油菜菌核病主要集中在我国长江中、下游及东南沿海等油菜产区，严重影响了我国的油菜生产。因此，油菜菌核病的研究一直倍受重视。在过去40多年，我国主要依靠多菌灵和菌核净等化学药剂来防治油菜核盘菌，但此类杀菌剂的作用机制比较单一，且长期连续、大面积、过量使用，加快了核盘菌对杀菌剂产生抗性。目前，在我国长江流域如安徽，江苏，浙江等省份已经出现了油菜菌核病菌对多菌灵抗药性的报道。因此，需要寻找一种农药来替代多菌灵和菌核净等杀菌剂，应用于油菜菌核病的防治。

放线菌是革兰氏阳性菌，它是兼性或强制性厌氧菌。放线菌的菌落呈放线状，种类繁多，分布广泛，主要以菌丝或孢子存在于土壤、空气和水中。放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物，目前从微生物中发现的 22,000多种已知的微生物次生代谢产物，其中70％来自放线菌，且大部分是抗生素。从放线菌中筛选生物活性物质一直是微生物抗生素研究的热点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株环肽抗生素缬氨霉素高产菌株——链霉菌 IFE-v1m38(Streptomyces sp.IFE-v1m38)，及其在微生物发酵制备缬氨霉素(Valinomycin)中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一株环肽抗生素缬氨霉素高产菌株——链霉菌IFE-v1m38 (Streptomycessp.IFE-v1m38)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号 CGMCC No.20046，保藏日期：2020年06月08日。

该菌株是从土壤收分离筛选获得，具体方法如下：

取1g实验室保存的土壤，在110℃烘烤30min后，加入到含有9mL 生理盐水和适量玻璃珠的50mL三角瓶中，28℃、200rpm的摇床中震荡30min后，室温下静置1h，取上清液，按照10倍梯度稀释至10

本发明还涉及所述链霉菌IFE-v1m38在微生物发酵制备油菜菌核病菌抗菌剂中的应用。该菌株发酵培养物对核盘菌菌丝生长有显著抑制作用，提示可用于制备油菜菌核病菌抗菌剂。

或者更为具体的，所述链霉菌IFE-v1m38在微生物发酵制备缬氨霉素(Valinomycin)中的应用，所述缬氨霉素结构如下式所示：

本发明还涉及一种利用所述链霉菌IFE-v1m38微生物发酵制备缬氨霉素的方法，其特征在于所述方法包括：将链霉菌IFE-v1m38 (Streptomyces sp.IFE-v1m38)接种至发酵培养基，在温度26～30℃、转速150～500rpm、通气量0～4.0vvm条件下，氨水调控pH 7.0～7.4，进行发酵培养48～192h，获得含有缬氨霉素的发酵液、经分离纯化获得所述缬氨霉素。

具体的，所述发酵培养基组成如下：黄豆饼粉5～30.0g/L，可溶性淀粉5～20.0g/L，葡萄糖5～30g/L，胰蛋白胨1～10.0g/L，酵母提取物1～10.0 g/L，牛肉浸膏0.5～5.0g/L，NaCl 0.1～5.0g/L，MgSO

优选的，所述链霉菌IFE-v1m38(Streptomyces sp.IFE-v1m38)先接种至种子培养基进行培养获得种子液，种子液再接种至发酵培养基进行发酵培养，所述种子培养基组成如下：酵母提取物5～20.0g/L，牛肉膏1～15.0 g/L，NaCl 0.1～2.0g/L，MgSO

将链霉菌IFE-v1m38(Streptomyces sp.IFE-v1m38)接种到含有 50～100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，28～30℃，200rpm培养24～72h后得到发酵种子液；将菌种液以5～10％接种量接入到5～L发酵罐，在在温度26～30℃、转速150～500rpm、通气量0～4.0vvm条件下，氨水调控pH 7.0～7.4，进行发酵培养48～192h，获得含有缬氨霉素的发酵液。

具体的，所述分离纯化方法如下：含有缬氨霉素的发酵液加1～3‰絮凝剂聚氯化铝，真空泵抽滤固液分离，得到菌丝体用纯甲醇反复浸泡抽提 3～5次，抽提物浓缩后，再用乙酸乙酯反复萃取2～4次、饱和NaCl溶液水洗1～3次、分液漏斗静置分层，真空旋转蒸发仪浓缩有机相，样品用真空干燥仪除水；采用200～300目的硅胶柱层析，样品的上样量与硅胶用量比例为1.0：30～60，用0～100％的MeOH-CHCl

缬氨霉素能显著抑制核盘菌菌丝生长，此外通过查阅文献，缬氨霉素对辣椒疫霉病菌、水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌等真菌都有较好的抑菌效果，可作为一种潜在农药抗真菌剂。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株环肽抗生素缬氨霉素高产菌株——链霉菌IFE-v1m38，其产缬氨霉素的量达到2279μg/m，远远高于已报到产缬氨霉素的菌株，利用该菌株产缬氨霉素抑制油菜菌核病菌的菌丝生长的半数抑菌浓度(MIC

(四)附图说明

图1为链霉菌IFE-v1m38(Streptomyces sp.IFE-v1m38)的菌落图；

图2为链霉菌IFE-v1m38(Streptomyces sp.IFE-v1m38)的亚甲基蓝染色图(10×100)；

图3为缬氨霉素的1H NMR谱图；

图4为缬氨霉素的13C NMR谱图；

图5为缬氨霉素的1H-1H COSY谱图；

图6为缬氨霉素的HSQC谱图；

图7为缬氨霉素的HMBC谱图；

图8为缬氨霉素NOSEY谱图；

图9为缬氨霉素DEPT谱图；

图10为缬氨霉素HRESIMS谱图([M-Na]+)；

图11为缬氨霉素TOF-MS/MS谱图；

图12为缬氨霉素的IR谱图；

图13为缬氨霉素的UV吸收光谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：土壤中分离具有抗油菜菌核病菌的链霉菌(Streptomyces sp. IFE-v1m38)的方法

取1g实验室保存的土壤，在110℃烘烤干燥30min后，加入到含有9mL生理盐水和适量玻璃珠的250mL三角瓶中，28℃、200rpm的摇床中震荡30min后，室温下静置1h，取上清液，按照10倍梯度稀释至10

实施例2：菌株分类鉴定——16S rDNA序列测定

2.1放线菌DNA提取

放线菌在含有高氏一号固体培养基的90mm玻璃培养皿上划线培养， 28℃恒温箱生长7d，用接种环挑取孢子转移到含有2g/L的CaCO

2.2PCR扩增

2.2.1扩增引物

参考Weissburg等报道的文献，PCR扩增采用通用引物27F和1541R (或者1492R 5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT)

上游引物(27F)：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’

下游引物(1541R)：5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3’

2.2.2反应体系

PCR扩增反应体系

2.2.3反应程序

2.2.4凝胶电泳鉴定PCR产物

扩增结束后，配置0.8％的琼脂糖H凝胶，采用BIO-RAD凝胶电泳仪，在110v电压条件下运行30min，以DNA分子量标准Marker(100-5000 bp)作为对照，检测PCR产物的分子量。

2.3序列测定

凝胶电泳结果确定目标产物后，将扩增的PCR产物移交给上海生物工程有限公司进行测序。测序完成后，将所得结果利用DNAman 8进行拼接，再在NCBI的Blast工具比对同源序列，选择同源性高的菌株，进行序列比对。

2.4序列结果与分析

表1：序列比对结果

根据序列对比结果，将其命名为链霉菌IFE-v1m38(Streptomyces sp. IFE-v1m38)。

实施例3：链霉菌(Streptomyces sp.IFE-v1m38)的发酵液的制备

链霉菌(Streptomyces sp.IFE-v1m38)接种到含有50mL液体种子培养基(酵母提取物10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，NaCl 2.0g/L，MgSO

实施例4：缬氨霉素(Valinomycin)的分离纯化和鉴定

实施例3得到的链霉菌发酵液加3‰絮凝剂聚氯化铝，真空泵抽滤固液分离，菌丝体用2L的纯甲醇反复浸泡抽提4次。抽提物浓缩后，再用乙酸乙酯反复萃取3次、饱和NaCl溶液水洗2次、分液漏斗静置分层，真空旋转蒸发仪浓缩有机相，样品用真空干燥仪除水。采用200～300目的硅胶柱层析，样品的上样量与硅胶用量比例是1.0：30～60，用0～100％的MeOH-CHCl

表2：缬氨霉素

实施例5：HPLC检测链霉菌(Streptomyces sp.IFE-v1m38)产缬氨霉素的含量

20mg缬氨霉素(市购)定溶于10mL容量瓶，配置成2，1，0.5，0.25 mg/mL的梯度的标准样品。取1mL实施例3发酵液样品摇匀，加入9mL甲醇在37℃下浸提过夜，10000r/min离心10min，0.22μm微孔有机滤膜过滤上清液，滤液4℃保存待测。缬氨霉素测定采用HPLC法测定，色谱条件：C18色谱柱(250mm×4.6mm)，流动相为V(甲醇)：V(水，1‰TFA)＝90:10，流速：1mL/min，检测波长λ＝210nm。

经检测，得到发酵液中缬氨霉素的含量为2279μg/mL。

实施例6：缬氨霉素对油菜菌核病菌的抑制作用

取16.0mg的缬氨霉素样品(实施例4得到白色固体)加入到10.0mL 的容量瓶，用DMSO溶解后定容，得到浓度为1.6mg/mL的样品；再用 DMSO梯度稀释到0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、50.0 μg/mL、25.0μg/mL、12.5μg/mL和6.25μg/mL，3.125μg/mL。取6.25μg/mL～1.6mg/mL这9种不同浓度的溶液0.1mL与9.9mL的PDA在90 mm玻璃培养皿上混合均匀制成平板。无菌条件下，将600mm油菜菌核病菌的小菌饼接种在含有不同浓度缬氨霉素的PDA上，空白对照组采用0.1mL的DMSO与9.9mL的PDA混合均匀(v/v，1％DMSO)，每组实验设置3个平行对照组。平板静置l h后，放入23℃恒温培养箱倒置培养48h，观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度，并用十字交叉法测量抑菌圈直径，记录结果并按下式计算抑制率：

菌落直径＝相垂直的两直径的算术平均值—菌饼直径(600mm)

采用

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 环肽抗生素缬氨霉素高产菌株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

<400> 1

tcgccagtcc caccttcgac agctccctcc cacaaggggt tgggccaccg gcttcgggtg 60

ttaccgactt tcgtgacgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca 120

gcaatgctga tctgcgatta ctagcaactc cgacttcatg gggtcgagtt gcagacccca 180

atccgaactg agaccggctt tttgagattc gctccgcctc gcggcatcgc agctcattgt 240

accggccatt gtagcacgtg tgcagcccaa gacataaggg gcatgatgac ttgacgtcgt 300

ccccaccttc ctccgagttg accccggcag tctcctgtga gtccccatca ccccgaaggg 360

catgctggca acacagaaca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg 420

acacgagctg acgacagcca tgcaccacct gtataccgac cacaaggggg gcaccatctc 480

tgatgctttc cggtatatgt caagccttgg taaggttctt cgcgttgcgt cgaattaagc 540

cacatgctcc gctgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc 600

gtactcccca ggcggggaac ttaatgcgtt agctgcggca ccgacgacgt ggaatgtcgc 660

caacacctag ttcccaacgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc 720

cccacgcttt cgctcctcag cgtcagtaat ggcccagaga tccgccttcg ccaccggtgt 780

tcctcctgat atctgcgcat ttcaccgcta caccaggaat tccgatctcc cctaccacac 840

tctagctagc ccgtatcgaa tgcagacccg gggttaagcc ccgggctttc acatccgacg 900

tgacaagccg cctacgagct ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gcgccctacg 960

tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc ccggcgcttc ttctgcaggt accgtcactt 1020

tcgcttcttc cctgctgaaa gaggtttaca acccgaaggc cgtcatccct cacgcggcgt 1080

cgctgcatca ggctttcgcc cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc 1140

tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccgg tcgccctctc aggccggcta cccgtcgtcg 1200

ccttggtagg ccattacccc accaacaagc tgataggccg cgggctcatc cttcaccgcc 1260

ggagctttta accccgtccc atgcgggaca gagtgttatc cggtattaga ccccgtttcc 1320

agggcttgtc ccagagtgaa gggcagattg cccacgtgtt actcacccgt tcgccactaa 1380

tccaccccga aaggcttcat cgttcgactg cat 1413

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

aaggaggtga tccagccgca 20