应用线粒体RNAi沉默细胞中线粒体基因表达

技术领域

本申请属于分子生物学领域和基因治疗领域，具体地，本申请提供了应用线粒体RNAi清除细胞中突变线粒体基因表达产物以治疗相关疾病的应用、方法和药物。

背景技术

人类的很多遗传性疾病都同线粒体基因突变有关系，如Leber遗传性视神经病(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)，线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作综合征(mitochondrial encephalomyopathy，lacticacidosis，and stroke-likeepisodes，MELAS)，人类神经性肌肉衰弱症等。这些突变的线粒体基因具有遗传异质性，随着突变的积累，逐渐引起线粒体功能障碍，最终引发疾病。随着RNA干扰技术的发展，越来越多的利用RNAI治疗不同疾病案例开始走向临床，表明RNA疗法具有广阔的前景，然而目前的所有案例都是针对细胞核基因引起的疾病，而对线粒体基因突变引起的疾病束手无策。

线粒体基因突变引起的疾病之所以难于治疗，是由线粒体结构以及线粒体基因组个数决定的。线粒体是有内外双层膜组成的细胞器，对细胞内的不同分子进出线粒体具有高度的选择性。此外对于线粒体基因的表达系统还不清楚，这就导致想利用外源分子来改变线粒体基因的表达非常困难。此外，每个线粒体的基因组有多个拷贝，想要改变每个细胞所有突变的线粒体基因组非常困难。

虽然RNAi在真核细胞核基因中已经广泛应用，但是到目前为止，还没有报道利用RNAi清除线粒体转录本。

发明内容

在此基础上，发明人尝试提供一种使用RNAi，特别是siRNA沉默线粒体基因/清除细胞中突变线粒体基因转录本的技术，为相关科研和治疗线粒体疾病提供一种可能的方案。因此我们设计了特异性地靶向突变的线粒体基因的siRNA，在突变的细胞系中，可以降低突变基因的转录本。因为突变的细胞系为嵌合体，随着突变转录本的减少，野生型的转录本会逐渐占据主导地位，线粒体复合体的功能会不断增强。

一方面，本发明提供了RNAi试剂在制备沉默细胞中线粒体基因表达的试剂中的应用。

进一步地，所述沉默细胞中线粒体基因表达为清除细胞中线粒体基因表达产物。

进一步地，所述线粒体基因为突变的线粒体基因。

进一步地，所述RNAi试剂为包含miRNA，piRNA或siRNA的试剂。

进一步地，所述RNAi试剂为包含siRNA的试剂。

另一方面，本发明提供了使用RNAi技术沉默细胞中线粒体基因表达的方法，所述方法用于非诊断和非治疗目的。

进一步地，所述沉默细胞中线粒体基因表达为清除细胞中线粒体基因表达产物。

进一步地，所述线粒体基因为突变的线粒体基因。

进一步地，使用miRNA，piRNA或siRNA来实施RNAi。

进一步地，使用siRNA来实施RNAi。

另一方面，本发明提供了用于治疗突变线粒体所导致的疾病的药物，其特征在于，包含RNAi试剂。

进一步地，所述RNAi试剂为包含miRNA，piRNA或siRNA的试剂。

进一步地，所述RNAi试剂为包含siRNA的试剂。

进一步地，突变的线粒体基因为ATP6基因的m8993T>G突变。

进一步地，siRNA的反义siRNA序列为GCGUACGGCCCGGGCUAUUGGTT。

进一步地，siRNA的正义siRNA序列为CCAAUAGCCCGGGCCGUACGCTT。

进一步地，突变线粒体所导致的疾病为线粒体脑肌病。

本申请中所述的RNAi是指RNA干扰/RNA干涉(RNA interference，RNAsilencing)，即由某些小分子RNA介导的基因沉默的现象。本申请中所述的RNAi中使用的小分子RNA可以为miRNA，piRNA，siRNA，并不排斥其他类似机理的现有或研究中的类似或其他小分子RNA。本申请中所述的RNAi试剂为包含上述小分子RNA的试剂，其中还可以包含储存、转染上述小分子RNA所用的试剂，这些试剂为分子生物学领域公知或者可以由相关试剂厂商提供(可参见，《分子克隆》，萨姆布鲁克，等相关著作)

本申请中所述的突变线粒体可导致的疾病包括但不限于Leber遗传性视神经病(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)，线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作综合征(mitochondrial encephalomyopathy，lacticacidosis，and stroke-likeepisodes，MELAS)，人类神经性肌肉衰弱症，以及目前尚未发现或明确病因的与突变线粒体相关的疾病。

本申请中药物可以包含所述的药学上可接受的赋形剂包括但不限于用于各种口服、注射等剂型的赋形剂，如包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂等。本申请的药物可以包含其他治疗相关疾病的药物，或者与这些药物联合使用。

附图说明

图1：针对野生型和突变型ATP6基因的siRNA在野生型和突变型细胞中降低ATP6mRNA的效果；

图2：使用siRNA技术敲低13个线粒体基因的结果。

具体实施方式

实施例1 siRNA的设计

设计针对ATP6基因(m8993T>G)突变的siRNA序列和特异性针对野生型ATP6基因的siRNA并委托合成：

siATP6 m siRNA sense：CCAAUAGCCCGGGCCGUACGCTT(SEQ ID NO.1)；

siATP6 m siRNA antisense：GCGUACGGCCCGGGCUAUUGGTT(SEQ ID NO.2)；

siATP6 w siRNA sense：CCAAUAGCCCUGGCCGUACGCTT(SEQ ID NO.3)；

siATP6 w siRNA antisense：GCGUACGGCCAGGGCUAUUGGTT(SEQ ID NO.4)。

实施例2转染和mRNA检测

根据lipofectamin RNAimax说明书，向143B野生型和143B(m8993T>G)突变细胞系均分别转染实施例1中制备的特异性针对野生型ATP6基因的siRNA和特异性地设计针对ATP6基因(m8993T>G)突变的siRNA。

继续培养48小时后用TRIZOL提取细胞RNA，逆转录定量PCR检测ATP6 mRNA的水平。

定量PCR ATP6引物为

ATP6 FP：AAGGCACACCTACACCCCTT(SEQ ID NO.5)；

ATP RP：GGCCTGCAGTAATGTTAGCG(SEQ ID NO.6)；

16S FP：GGTGCAGCCGCTATTAAAGG(SEQ ID NO.7)；

16S RP：ATCATTTACGGGGGAAGGCG(SEQ ID NO.8)；

结果见图1：在突变体细胞中，特异性地靶向突变的ATP6的siRNA降低ATP6 mRNA效率高于野生型ATP6的siRNA。相反，在野生型细胞中，特异性地靶向野生型的ATP6的siRNA降低ATP6 mRNA的效率高于突变型ATP的siRNA。

继续用siRNA处理细胞若干天，用BN-PAGE测定复合体V的活性。突变体细胞中，与特异性地靶向野生型的ATP6的siRNA相比，特异性地靶向突变型的ATP6能够增强复合体V的活性。

实施例3使用siRNA技术敲低13个线粒体基因

我们在Ago2-CLIP seq数据中根据Ago2的结合峰位置附近设计了特异性地靶向线粒体13个基因的siRNA，用RNiMAX将siRNA转染小鼠细胞48h后，提取总RNA，通过RT-PCR分别检测每个基因的敲低效果，结果如图2所示：线粒体中所有基因都能被siRNA有效地敲低。

序列表

<110> 中国科学院生物物理研究所

<120> 应用线粒体RNAi沉默细胞中线粒体基因表达

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列()

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ccaauagccc gggccguacg ctt 23

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gcguacggcc cgggcuauug gtt 23

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccaauagccc uggccguacg ctt 23

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gcguacggcc agggcuauug gtt 23

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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aaggcacacc tacacccctt 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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atcatttacg ggggaaggcg 20