LAMA3或THBS1在制备促进肝再生药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种LAMA3或THBS1在制备促进肝再生药物中的应用。

背景技术

众所周知，正常肝脏组织具有很强的自我再生能力，即使手术切除2/3的正常肝脏组织，残留肝脏依然可以再生恢复到手术切除前的状态，因而活体肝移植手术治疗终末期肝病得以临床推广应用。但各种病态状况下，肝脏的自我再生修复能力大大降低，或者完全丧失，肝脏功能不但难以自我恢复，反而不断恶化进展，因此临床上出现许多肝功能衰竭等终末期肝病患者。尽管肝脏移植可能有效治疗终末期肝病，包括急性肝衰竭、慢性肝衰竭和代谢性肝病，但肝脏供体严重紧缺，并且肝脏移植外科手术本身存在巨大侵袭性和诸多风险。这促使人们试图通过移植肝细胞或者各种组织由来的未成熟干细胞，促进肝脏再生，以期达到治愈肝脏疾病的目的。

肝脏是我们体内最具再生能力的器官之一。然而，肝脏的再生能力在病理条件下很大程度上受损，如病毒感染和胆汁淤积症。过去的一些研究试图了解肝再生的分子/细胞机制。虽然“种子”(常驻组织细胞，包括成熟的肝细胞和未成熟的肝干细胞)和“土壤”(局部组织微环境)都被认为是至关重要的，但只有很少的研究集中在局部组织微环境在肝脏损伤后再生中的作用。

组织微环境由细胞外基质(ECM)/粘附分子和细胞因子/趋化因子等复杂因素组成。长期以来，ECM一直被认为是一种惰性细胞生长底物。ECM的动态结构是由多种蛋白质和其他大分子组成的，它为组织细胞(干细胞)的生物学功能(包括增殖、迁移和分化)提供了支架。ECM也被证明在维持肝干细胞方面起着关键作用。黏附分子是细胞表面蛋白质的一个子集，它与周围的细胞外基质和邻近的细胞结合，以维持各种组织/器官中细胞的结构和功能。尽管细胞外基质和黏附分子在维持肝脏内环境稳定中起着重要作用，但仍需要确定对肝脏再生起关键作用的ECM和黏附分子。

层粘连蛋白(Laminin)是ECM的重要结构成分，有利于细胞附着。它们是一个大的异源三聚体基底膜黏附蛋白家族，大约有16种不同的异构体。每个都由α，β和γ链组成。层粘连蛋白影响相关细胞的行为，如细胞的黏附、迁移、分化、活性和表型稳定性。层粘连蛋白已被证明可以诱导大鼠肝细胞中的分化标志物如酪氨酸转氨酶、色氨酸-2，3-双加氧酶和细胞色素P450的表达。

血小板反应蛋白(Thrombospondin)属于分泌型多功能蛋白家族。血小板反应蛋白-1(THBS1)是该家族的第一个成员，450kda同源三聚糖蛋白，具有多个功能结构域，是一种基质细胞糖蛋白，可由多种细胞类型分泌。通过与细胞外蛋白质和/或细胞表面受体结合，THBS1调节多种细胞功能，在多种生物过程中发挥重要作用，包括血管生成，细胞凋亡，潜在的TGF-β激活和免疫调节，还涉及许多器官功能的调节。THBS1在多种慢性肝病中可能发挥作用，主要包括非酒精性脂肪肝疾病，肝纤维化和肝细胞癌。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种LAMA3或THBS1在制备促进肝再生药物中的应用，对促进肝再生，治疗肝功能障碍意义重大。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种LAMA3蛋白或THBS1蛋白在制备促进肝再生药物中的应用。

层粘连蛋白α3(LAMA3)基因及其编码的层粘连蛋白参与肝细胞的增殖和存活，促进肝再生；血小板反应蛋白-1(THBS1)参与肝干细胞比例和干性的维持，促进肝再生。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述LAMA3蛋白的NCBI Gene ID：3909。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述THBS1蛋白的NCBI Gene ID：7057。

本发明提供LAMA3蛋白在制备与THBS1蛋白联合施用促进肝再生药物中的应用。

针对现有肝再生微环境中细胞外基质、细胞因子和趋化因子等促进肝再生因子的了解不够充分，本发明提供了细胞外基质中LAMA3和分泌性因子THBS1作为细胞因子治疗肝功能障碍，促进肝再生的实验基础，首次联合使用了LAMA3与THBS1，两种因子对肝细胞和肝干细胞生长有一定协同作用。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括LAMA3蛋白和THBS1蛋白中的至少一种。

作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物中还包括药学上可接受的载体。

本发明的有益效果：

(1)本发明发现细胞外基质中的LAMA3蛋白在肝细胞的存活、增殖和功能上有支持作用；本发明通过实验证实LAMA3显著降低Claudin-3阳性肝干细胞的比例，结合其促进肝细胞增殖的作用，确认了LAMA3诱导肝干细胞分化的作用。

(2)本发明发现分泌型蛋白THBS1减少了新生肝细胞的凋亡，并维持了Claudin-3阳性的肝干细胞在新生肝细胞中的比例，在肝干细胞的维持中起作用。

(3)本发明首次公开了LAMA3与THBS1的联合使用能显著提高肝细胞增殖率，在体外评价中，两种因子对肝细胞和肝干细胞生长有一定协同作用。对促进肝再生，治疗肝功能障碍意义重大。

附图说明

图1：LAMA3和THBS1对肝细胞和肝干细胞形态、细胞存活率的影响结果图。

图2：LAMA3和THBS1对白蛋白表达的影响结果图。

图3：LAMA3和THBS1对Claudin-3表达的影响结果图。

图4：LAMA3和THBS1对增殖指标Ki-67表达的影响结果图。

图5：新生大鼠肝细胞凋亡检测结果图。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

阳性细胞的观察和计数：用共聚焦激光扫描显微镜(FV10i-LIV，OLYPUS)观察和计数阳性细胞，用FV10-ASW软件(OLYPUS)用60倍放大镜采集数字图像。从每个实验的染色玻片中随机选择15幅图像进行定量计数。

实施例1 LAMA3和THBS1的特异表达

(1)动物

成年雄性C57BL/6小鼠(8-10周)和新生小鼠(出生后36小时内)。

(2)肝部分切除和胆管结扎术

成年小鼠接受70％肝部分切除(PH)，随机选择其中一半进行胆管结扎术(PH+BDL)。以假手术(开腹)作为健康阴性对照。治疗后第1，3，7，14天，每组各处死4只小鼠。从肝组织中提取总RNA，用于PCR芯片分析。

(3)聚焦通路的PCR芯片

通过聚焦通路的PCR芯片分析，寻找可能参与肝再生的ECM和黏附分子。具体步骤为：用RNasy Mini Kit(Qiagen)从肝组织中提取总RNA。用NanoDrop2000型分光光度计(Thermo Fisher Science)测定RNA浓度，4个RNA样本混合后(每个样本0.25μg)，用RT2First Strand Kit(Qiagen)反转录cDNA。小鼠ECM和黏附分子PCR芯片，包括84个基因。将所有数据归一化到看家基因的表达，并根据周期阈值(Ct)量化每个基因的表达水平。基于不同组间基因表达的不同动态变化，找到两个因子LAMA3(NCBI网址：

实施例2 新生小鼠肝细胞的分离和原代培养

取新生小鼠(出生后36小时内)采用颈椎脱位的方法实施安乐死。无菌条件下取出肝组织，立即转移到装有缓冲液(含Ca

为评价LAMA3和THBS1对肝细胞生长的影响，将肝细胞分别培养在含有以下培养基的培养皿中：

①对照组：无LAMA3预包被、培养基中不加THBS1；

②LAM组：5μg/ml LAMA3预包被、培养基中不添加THBS1；

③TSP组：无LAMA3预包被、培养基中添加0.5μg/ml THBS1；

④LAM+TSP组：预包被5μg/ml LAMA3且培养液中添加0.5μg/ml THBS1。

其中LAMA3预包被步骤为：

(1)使用前，先在2-8℃下，缓缓解冻LAMA3蛋白原液。

(2)计算实验所需的LAMA3蛋白的量，最初几代预包被浓度使用5ug/mL。一旦细胞适应，可根据经验针对不同细胞系适当降低包被浓度(低至1ug/mL)。

(3)用1x DPBS(Ca

(4)确保包被溶液覆盖整个培养皿表面。未被足够溶液覆盖的表面不能支持细胞生长。用薄膜密封培养器皿以防止蒸发和污染，2-8℃孵育过夜。

实施例3 LAMA3和THBS1对细胞存活率的影响

测量活的肝细胞总数，在原代培养7天后用0.25％胰蛋白酶从实施例2中的培养皿中收集所有细胞。使用细胞计数装置(Nucleo Counter，Chemotetec A/S，丹麦)对活细胞总数进行计数。

结果如图1A所示，从新生肝脏中收集所有细胞，包括肝细胞和肝干细胞，培养7天后不同培养基中的肝细胞表现出不同的形状和大小：在LAMA3包被的培养皿中观察到更多的梭形细胞，且许多细胞是双核的，并呈现成纤维细胞样的形态；相反，添加THBS1培养的一些细胞被拉长。

如图1B所示，与对照组相比，LAM组和LAM+TSP组肝细胞总数显著增加(P＜0.001)，说明LAMA3显著增加了新生肝细胞的数量；而TSP组肝细胞总数无明显变化(P＝0.998)。

实施例4 LAMA3和THBS1对白蛋白表达的影响

白蛋白是功能性肝细胞合成的最丰富的蛋白质，在原代培养7天后用0.25％胰蛋白酶从实施例2中的培养皿中收集所有细胞，利用免疫组织化学染色法检测白蛋白在细胞中的表达。

结果如图2所示，白蛋白在各组均有广泛表达。但LAM组、TSP组和LAM+TSP组的白蛋白阳性细胞百分率明显高于对照组(P＜0.001)。

实施例5 LAMA3和THBS1对Claudin-3表达的影响

紧密连接蛋白Claudin-3是鉴定肝干/祖细胞的标志物之一，肝干/祖细胞是一小部分未成熟的前体细胞，在肝脏中形成肝细胞和胆管细胞。为检测Claudin-3阳性肝干细胞及其增殖情况，在原代培养7天后用0.25％胰蛋白酶从实施例2中的培养皿中收集所有细胞，对肝细胞中claudin-3和Ki-67的表达进行了双重免疫染色。

结果如图3A所示，部分存活的新生肝细胞Claudin-3阳性，少数Ki-67阳性。如图3B所示，定量数据显示LAM组和LAM+TSP组claudin-3阳性细胞百分率明显低于对照组(P＜0.001)。此外，LAM组中双阳性细胞Claudin-3

实施例6 LAMA3和THBS1对肝细胞增殖活性的影响

Ki-67是一种分子量为345-395kDa的核蛋白双分子，在维持细胞增殖中发挥至关重要的作用。Ki-67存在于非G0细胞周期的所有细胞中，开始于G1中期，S至G2期呈逐渐上升趋势，到M期达到峰值，在M未期，被迅速降解。Ki-67标记指数(LI)，即组织中Ki-67染色的比例，预示着细胞的生长信息。

在原代培养7天后用0.25％胰蛋白酶从实施例2中的培养皿中收集所有细胞，利用免疫组织化学方法检测Ki-67的表达，若染色呈阳性表明细胞表达Ki-67蛋白，代表细胞增殖活性高。

结果如图4所示，与对照组相比，LAM组、TSP组和LAM+TSP组Ki-67表达均较高，但仅LAM+TSP组有统计学意义(P＜0.05)。

实施例7 THBS1显著降低新生大鼠肝细胞凋亡

在原代培养7天后用0.25％胰蛋白酶从实施例2中的培养皿中收集所有细胞，通过免疫染色估计细胞增殖。用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞15分钟。用0.1％Tritonx100透膜10分钟。5％牛血清白蛋白封闭1小时后，与大鼠抗Ki-67单克隆抗体(EBioscience)在4℃孵育过夜，用Alexa

结果如图5所示，与对照组相比，TSP组和LAM+TSP组凋亡细胞百分率显著降低(P＜0.05)，LAM组凋亡细胞百分率无明显变化(P＝0.511)。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。