一种均质的多功能细菌纤维素基皮肤敷料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种均质的多功能细菌纤维素基皮肤敷料及其制备方法，具体涉及一种采用层层原位复合法制备的具有良好的吸湿性、防粘连、抗感染和促愈合能力的多功能细菌纤维素基皮肤敷料，属于生物医用材料领域。

背景技术

烧伤、烫伤及慢性创伤造成的皮肤严重受损，难以修复，并易引起感染等并发症，是当前矫形外科和皮肤科难以治疗的疾患之一。开发具有抗感染、促愈合等多种功能的皮肤敷料，对促进患者康复、减轻患者病痛及减少医疗卫生费用的支出具有积极的经济和社会价值。细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)具有三维纳米网络结构，能够阻止外界的致病菌入侵，并具有良好的吸水性、保水性、透气性、防粘连性能、生物相容性、免疫原性以及一定的止血功能，能够维持创面湿润的环境，促进肉芽生长，是理想的皮肤敷料原材料之一。然而，BC纳米纤维敷料并不具备杀菌功能，对已入侵的致病菌及已感染的创面毫无作用；另一方面，BC的细胞相容性欠佳，对于大面积的创面修复，难以达到理想的促愈合效果。

将有效成分引入到BC支架的三维网络结构中，制备BC基复合材料，是改善BC基敷料性能的有效方式。人们通过引入银纳米颗粒(Wu CN.TEMPO-Oxidized BacterialCellulose Pellicle with Silver Nanoparticles for WoundDressing.Biomacromolecules.2018；19:544-54.)、季铵盐类化合物(

虽然现有技术也存在将上述两种物质同时引入BC。但是在制备方法方面，传统的BC基复合材料制备方法是BC由木醋杆菌等细菌生物合成好后，再与添加物复合。由于BC有纳米级网络结构，大分子添加物无法进入BC内部，很难得到均质的材料。例如，专利(中国公开号CN102888027A)公开了一种细菌纤维素/胶原-壳聚糖复合材料及其制备方法，其利用正压法或负压法使得胶原进入BC的，但是该方法得到的复合材料中胶原分布不均匀。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种均质的多功能细菌纤维素基皮肤敷料及其制备方法。

一方面，本发明提供了一种均质的多功能细菌纤维素基皮肤敷料，通过层层原位复合法，将I型胶原和壳聚糖季铵盐引入细菌纤维素的三维网络结构中，获得兼具抗感染和促组织修复性能的多功能皮肤敷料。

较佳的，所述壳聚糖季铵盐为壳聚糖和季铵盐反应合成的壳聚糖衍生物，所述季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、氯丙胺三甲基氯化铵、羟丙基三甲基氯化铵中的至少一种。其中，壳聚糖季铵盐赋予该皮肤敷料抗感染性能。

较佳的，所述多功能细菌纤维素基皮肤敷料中细菌纤维素的含量为40～60wt％。

较佳的，所述多功能细菌纤维素基皮肤敷料的厚度为0.5～3mm。

另一方面，本发明还提供了一种多功能细菌纤维素基皮肤敷料的制备方法，包括：

(1)配制含I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基；

(2)采用静置培养法得到细菌纤维素基底膜；

(3)将含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基滴加在细菌纤维素基底膜表面，直至含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基全部消耗完；

(4)重复步骤(3)多次后，去除细菌纤维素基底膜，再经纯化和冷冻干燥，得到所述多功能细菌纤维素基皮肤敷料。

在本公开中，采用静置培养法得到细菌纤维素基底膜，以获得适合生物合成细菌纤维素的菌种。然后将含I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基滴加在细菌纤维素基底膜表面，细菌纤维素基底膜表层的菌种生物合成出细菌纤维素，在微米尺度上与I型胶原和壳聚糖季铵盐充分复合，解决了胶原蛋白和壳聚糖季铵盐不易引入的技术问题，使其分布更加均匀。另一方面，将添加物加入到培养基中，在细菌纤维素层层生长的同时，添加物层层复合进去，形成非常均匀的复合物。具体来说，细菌纤维素是细菌在有氧环境下分泌出来的，在含有细菌的培养液中，只有膜液界面那层细菌才会分泌细菌纤维素。本发明利用该特性，通过将含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基减到非常小量，即在非常薄的一层(优选达到微米级厚度)，覆盖在细菌纤维素基底膜及已生长的细菌纤维素上，使得前后生长的细菌纤维素之间具有连续性，从而实现细菌纤维素的连续生长。最后去除细菌纤维素基底膜，再经纯化和冷冻干燥，得到均质的多功能细菌纤维素基皮肤敷料。

较佳的，所述含I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基中壳聚糖季铵盐的浓度为1～5mg/mL，I型胶原的浓度为0.5～2mg/mL。

较佳的，所述细菌纤维素基底膜的厚度为0.5～2mm。

较佳的，每次滴加在细菌纤维素基底膜表面的含I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基的厚度为30～80μm。

较佳的，所述纯化包括：先置于0.3～0.7mol/L NaOH溶液中超声处理1～3小时；再置于纯水中，超声处理1小时，重复3～5次；最后采用纯水冲洗至中性。

较佳的，所述冷冻干燥的温度为-30～-50℃，时间为48～96小时。

有益效果：

本发明中，首次通过层层原位复合法，在含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基中原位生长细菌纤维素，直接实现了I型胶原和壳聚糖季铵盐的均匀分布，最终得到均质的多功能细菌纤维素基皮肤敷料；

本发明中，所得兼具抗感染和促组织修复性能的I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料的制备工艺简单、效率高，可重复性好；

本发明中，所制备的I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料综合了I型胶原、壳聚糖季铵盐和细菌纤维素三种材料的优势，在拥有皮肤敷料所需的基本性能的同时，兼具良好的抗菌性能和细胞相容性。

附图说明

图1为实施例1制备的细菌纤维素(BC)的扫描电镜图；

图2为实施例1中制备的I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素(CHBC)功能敷料的SEM图；

图3为实施例2制备的I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素(CHBC-2)功能敷料的扫描电镜图；

图4为实施例3中细菌纤维素(BC)和I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素(CHBC)功能敷料的细菌实验附图；

图5为实施例4中细菌纤维素(BC)和I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素(CHBC)功能敷料的细胞实验附图；

图6为实施例5中细菌纤维素(BC)和I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素(CHBC)功能敷料的动物实验附图。

具体实施方式

以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

在本公开中，首次通过层层原位复合法，将I型胶原和壳聚糖季铵盐引入细菌纤维素的三维网络结构中，最终得到均质的多功能细菌纤维素基皮肤敷料，即I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料。以下示例性地说明多功能细菌纤维素基皮肤敷料的制备过程。

配制普通培养基。配制培养基并置于灭菌锅高温高压灭菌30～60min，得到普通的培养基。具体来讲，将葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钠、酵母粉溶于去离子水中，配制成培养基，该培养基pH为3.5～5.5，并置入灭菌锅中在110～120℃、0.1MPa下灭菌20～40min，备用，得到普通培养基。作为一个配制普通培养基的示例，将25g葡萄糖、10g蛋白胨、10g磷酸氢二钠、7.5g酵母粉溶于1L去离子水中，配制成培养基，控制该培养基pH为4～5，并置入灭菌锅中在115℃、0.1MPa下灭菌30min，备用，得到普通培养基。

配制含I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基。在普通培养基的基础上，溶入壳聚糖季铵盐，高温高压灭菌。其中，控制壳聚糖季铵盐的浓度可为1～5mg/mL。然后在无菌环境下，继续溶入I型胶原，得到含I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基。其中，控制I型胶原的浓度可为0.5～2mg/mL。

在可选的实施方式中，壳聚糖季铵盐为壳聚糖和季铵盐反应合成的壳聚糖衍生物。所述季铵盐可为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、氯丙胺三甲基氯化铵、羟丙基三甲基氯化铵等中的至少一种。

采用静置培养法获得细菌纤维素基底膜。所得细菌纤维素基底膜的厚度可为0.5～2mm。

滴加含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基覆盖所得仍含有菌种的细菌纤维素基底膜。待上一次滴加的含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基刚消耗完时，再次滴加，反复多次，直至达到所需厚度。优选地，通过控制含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基的厚度，设置定时装置控制其滴加时间和频率。此外，在滴加含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基覆盖细菌纤维素基底膜时，控制该涂覆的特定培养基的厚度在30～80μm之间，目的在于使得细菌纤维素和I型胶原及壳聚糖季铵盐在微米尺度上层层复合。

待多功能细菌纤维素基皮肤敷料达到所需厚度之后，去除细菌纤维素基底膜，再经过纯化和冷冻干燥，得到多功能细菌纤维素基皮肤敷料。其中，纯化的步骤包括：先置于0.3～0.7mol/L NaOH溶液中，超声处理1～3小时；再置于纯水中，超声处理1小时，重复3～5次；最后用纯水冲洗至中性。冷冻干燥的温度为-30～-50℃，时间为48～96小时。

本发明中，所制备的I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料综合了I型胶原、壳聚糖季铵盐和细菌纤维素的优势，具有防粘连、吸湿性、抗感染和促愈合等诸多功能。

在可选的实施方式中，多功能细菌纤维素基皮肤敷料中细菌纤维素的含量可为40～60wt％。所得多功能细菌纤维素基皮肤敷料的厚度可为0.5～3mm。

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。若无特殊说明，下述实施例中采用的壳聚糖季铵盐为2,3-环氧丙基三甲基氯化铵。

实施例1

I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料1的制备，步骤如下：

S1：将25g葡萄糖、10g蛋白胨、10g磷酸氢二钠、7.5g酵母粉溶于1L去离子水中，配制成培养基，该培养基pH为4～5，并置入灭菌锅中在115℃、0.1MPa下灭菌30min，备用，得到普通培养基；

S2：将壳聚糖季铵盐溶入普通培养基中，浓度为3mg/mL。高温灭菌后，在无菌环境下，溶入I型胶原，浓度为1mg/mL，得到含I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基；

S3：在无菌环境下，将菌液接种到培养基中，菌液的菌种为木醋杆菌，在24孔板的每个孔中接种200μL已接种木醋杆菌的培养基，在30℃条件下静态培养2d，得到厚度为1.5mm的细菌纤维素基底膜(BC)；

S4：滴加含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基覆盖基底膜，厚度约为50μm，培养2小时；待上一次滴加的细菌纤维素培养基刚消耗完时，再次滴加，反复多次，直至达到所需厚度，约为1mm；

S5：去除基底膜后，置于0.5mol/L NaOH溶液中，超声处理1～3小时；再置于纯水中，超声处理1小时，重复3～5次；用纯水冲洗至中性。随后将样品在-20℃冰箱中冷冻12h，最后冷冻干燥72h，得到I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料(CHBC)。

用扫描电镜观察：

图1为BC的SEM图，从图中可以看出，纯BC其纤维表面比较均匀光滑，纤维间的孔隙较大。图2为CHBC的SEM图，I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料(CHBC)样品的细菌纤维素间的孔隙被I型胶原和壳聚糖季铵盐填充。所得多功能细菌纤维素基皮肤敷料中细菌纤维素的含量为50wt％。

实施例2

I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料2的制备，步骤如下：

参照实施例1的方法，配制普通培养基和含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基，培养获得细菌纤维素基底膜；

S1：滴加含有I型胶原和壳聚糖季铵盐的培养基覆盖基底膜，厚度约为80μm，培养2.5小时；待上一次滴加的细菌纤维素培养基刚消耗完时，再次滴加，反复多次，直至达到所需厚度，约为1.5mm；

S2：去除基底膜后，置于0.5mol/L NaOH溶液中，超声处理1～3小时；再置于纯水中，超声处理1h，重复3～5次；用纯水冲洗至中性。随后将样品在-20℃冰箱中冷冻12h，最后冷冻干燥72h，得到I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料2(CHBC-2)。

用扫描电镜观察：

图3为CHBC-2的SEM图，I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料2(CHBC-2)样品的细菌纤维素间的孔隙被I型胶原和壳聚糖季铵盐填充。所得多功能细菌纤维素基皮肤敷料中细菌纤维素的含量为45wt％。

实施例3

I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料CHBC的抗菌性能测试，步骤如下：

将实施例1中制备的细菌纤维素BC及I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料CHBC，分别与致病菌金黄色葡萄球菌ATCC 25923在37℃培养箱中共同培养6小时和24小时。扫描电镜观察材料表面细菌粘附和生长情况，激光共聚焦观察细菌杀灭情况。

图4中A为材料与细菌共培养一定时间后的SEM图片。与细菌纤维素BC相比，I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料CHBC能够很好地抑制细菌的定植和细菌生物膜的形成；图4中B为细菌死活染色激光共聚焦照片，其中绿色为活细菌，红色为死细菌。

从图中可以看到，I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料能够杀灭接触的细菌。

实施例4

I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料CHBC的细胞生物学性能测试，步骤如下：

用成纤维细胞(NIH3T3)和内皮细胞(HUVEC)来考察实施例1中制备的I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料CHBC的生物学性能：用CCK-8法考察细胞在材料表面的增殖行为；用扫描电镜观察细胞在材料表面的粘附形貌。

图5中A为NIH3T3在材料表面增殖的CCK-8实验结果，图5中B为HUVEC在材料表面增殖的CCK-8实验结果。从图中可以看出，I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料更能够促进两种细胞的增殖。图5中C扫描电镜结果，从图中可以看到，两种细胞在I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料表面的铺展的更好，表明细菌纤维素基复合材料具有更好的细胞相容性。

实施例5

I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料的动物实验，步骤如下：

参照实施例1的方法，制备I型胶原/壳聚糖季铵盐/细菌纤维素功能敷料，环氧乙烷灭菌。选取8周龄小鼠若干，麻醉、消毒以实施手术。用手术刀切出一定大小的伤口后，注入10

图6为伤口愈合大致照片，其中空白组(Control组)为未加细菌的BC组。从图中可以看到，BC组在2天后具有明显的感染，Control组合CHBC组并未发现感染的病灶；与control组相比，BC的愈合情况想对较差，表明感染会影响组织愈合；CHBC组的愈合情况明显好于BC组。