一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及到一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法，具体为一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的精确敲除鸡 NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法。

背景技术

CRISPR-Cas系统最早发现于细菌的天然免疫系统，用于对抗病毒的入侵和外源DNA。其中Ⅱ型CRISPR-Cas系统运用最为广泛，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白到靶序列上，在PAM序列上游3bp位置特异性剪切DNA 双链，造成DNA双链断裂(DSB，double strand break)，从而启动细胞内的DNA 损伤修复机制，导致修复后发生碱基缺失或插入，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的。目前该技术已经成熟的运用于真核细胞的基因组编辑中。

Na+/H+离子交换蛋白-1(Sodium/hydrogen exchanger 1，NHE1)是存在于细胞膜表面的离子转运泵蛋白家族的一员。NHE1具有维持细胞内pH值等内环境稳定以及调控宿主细胞的凋亡和增殖的重要功能，也是首个被鉴定的J亚群禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV-J)的细胞受体，该蛋白存在于所有真核细胞膜上。ALV-J的Env可特异性的结合鸡NHE1位于细胞外环-1 (Loop-1)的28-39位氨基酸，并以此介导ALV-J的入侵及感染，而对ALV-J 不易感的禽类NHE1的W38氨基酸存在变异或缺失。本研究通过CRISPR/Cas9技术，药物筛选后通过亚克隆的方法，成功获得鸡源NHE1基因W38位精确敲除的 DF-1细胞株delW38-NHE1，且发现delW38-NHE1细胞系能够有效封闭ALV-J的感染。本发明为探究NHE1基因W38氨基酸生物学功能，解析NHE1基因W38位点与ALV-J互作分子机制以及为构建抗ALV-J转基因鸡与抗病毒药物开发打下了基础，具有良好的应用研究价值。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有问题，提供一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种精确敲除鸡NHE1基因W38 位氨基酸的细胞系构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)、构建一种特异性靶向鸡NHE1基因W38位的sgRNA，所述的sgRNA位于鸡NHE1基因的第一个外显子区域，且靶序列唯一；

步骤2)、准备一种用于靶向敲除鸡NHE1基因W38位的CRISPR-Cas9系统， CRISPR-Cas9系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡NHE1基因W38位的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列；CRISPR-Cas9 系统中，Cas9蛋白的编码序列与sgRNA的编码序列位于同一质粒上，所述的质粒为lentiCRISPR v2；

步骤3)、合成以pUC57为骨架，含有缺失NHE1基因W38位所需的供体质粒，并命名为：pUC57-delW38；

步骤4)、将步骤1)构建的特异性靶向敲除鸡NHE1基因W38位的sgRNA克隆至带有Cas9基因的lentiCRISPR v2质粒，并将lentiCRISPR v2质粒与步骤3)构建的供体质粒pUC57-delW38共同转染至细胞中；

利用CRISPR-Cas9系统达到基因位点精准敲除，通过药物筛选和亚克隆的方法最后获得阳性单克隆细胞株，从而获得鸡源NHE1基因W38位敲除细胞系。

步骤1)中，对鸡NHE1基因设计了1条sgRNA，所述sgRNA靶位点位于NHE-1基因的第一个外显子区域，该外显子序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的特异性靶向鸡NHE1基因W38位的sgRNA编码链及互补链；其序列如SEQ IDNO.2所示。

步骤1)中，靶向鸡NHE1基因的sgRNA制备方法，包括将合成的sgRNA编码链和互补链退火形成双链DNA，之后通过BsmBⅠ限制性内切酶酶切载体，将双链DNA 置于T7启动子之下构建获得。

步骤3)中，对鸡NHE1蛋白设计了缺失W38位点的模板供体质粒，所述缺失位点位于NHE1基因的第一个外显子区域，该供体质粒序列如SEQ ID NO.3所示。

步骤4)中，所述的细胞系为敲除鸡NHE1基因W38位点的细胞系。

本发明方法先进科学，通过本发明，本发明首先提供了一种特异性靶向鸡 NHE1基因W38位点的sgRNA，所述sgRNA位于鸡NHE-1基因的第一个外显子区域，且靶序列唯一，本发明所述sgRNA针对鸡NHE1基因的W38位点，其序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种用于靶向敲除鸡NHE1基因W38位点的CRISPRCas9系统，在所述的系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡NHE1基因W38位点的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列。

敲除的具体操作如下：

(1)利用NCBI在线数据库查找鸡NHE1基因组序列

NCBI Reference Sequence:NM_001044643.1

在该基因的第一个外显子区域设计敲除靶位点，第一个外显子的序列如SEQ IDNO.1所示。

(2)sgRNA的构建：设计好的sgRNA编码链和互补链分别命名为sgRNA_F和sgRNA_R，把引物稀释至100uM浓度，体系如下：sgRNA_F和sgRNA_R各1uL，PCR buffer 1μL，ddw 7μL，退火程序为5℃/min梯度降温至25℃，获得双链DNA。另一方面，利用BsmBI限制性内切酶酶切lentiCRISPR v2载体，酶切体系如下： BsmBI限制性内切酶1μL，lentiCRISPR v2质粒1μg，0.1M DTT 0.5μL，NEB buffer3.1 5μL，其余用ddw补至50μL，酶切条件为55℃15min，之后通过跑胶后胶回收获得含有粘性末端的lentiCRISPR v2载体质粒。最后，将获得的sgRNA与酶切后的载体质粒通过连接酶连接，最终将sgRNA放入lentiCRISPR v2质粒中，获得sgRNA和Cas9蛋白基因位于同一载体的质粒，命名为NHE1-sgRNA。

(3)缺失NHE1基因W38位点所需的供体质粒的合成：由金唯智公司合成以 pUC57为骨架，含有缺失NHE1-W38所需的供体质粒，并命名为：pUC57-delW38，其中修复模板序列如SEQ ID NO.3。

(4)敲除细胞系的获得：6孔板中转染构建好的NHE1-sgRNA和pUC57-delW38 各2μg，设立不转染的细胞作对照。48h后加入含有嘌呤霉素的培养基进行药物筛选，每3天换药1次，待阴性对照细胞全部死亡后，换成不含药物的完全培养基，存活的细胞生长至适当密度后，利用有限稀释法进行亚克隆至96孔板中，待细胞生长至足够数量时进行鉴定，之后冻存阳性细胞。

通过本发明，为构建一个鸡源NHE1基因W38位敲除的细胞系,提供一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向鸡NHE1基因W38位氨基酸的sgRNA，之后转染带有sgRNA和Cas9基因的lentiCRISPR v2质粒，利用CRISPR-Cas9系统达到基因位点的精确敲除，通过药物筛选及亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源NHE1基因W38位敲除的细胞系。

本发明目的是构建一种基于CRISPR-Cas9靶向敲除鸡NHE1基因W38氨基酸的方法，基于本发明建立的DF-1细胞系可以有效封闭ALV-J感染。本发明为抗ALV-J转基因鸡及抗ALV-J药物研发奠定基础。

本发明基于CRISPR-Cas9靶向敲除鸡NHE1基因W38氨基酸的细胞系构建在相关领域未见报道，本发明建立的delW38-NHE1细胞系能有效封闭ALV-J感染，为进一步探究NHE1基因W38氨基酸生物学功能，解析NHE1的W38与ALV-J互作分子机制以及为构建抗ALV-J转基因鸡及抗病毒药物开发打下了基础，具有较大的应用研究价值。

附图说明

图1为lentiCRISPR v2载体质粒的酶切；

泳道M：super DNA marker；泳道1：酶切后lentiCRISPR v2载体质粒。

图2为亚克隆NHE1-deW38细胞系的测序鉴定。

图3为Western blot评价NHE1-deW38细胞系抗ALV-J效果；

泳道1：NHE1-deW38细胞系感染ALV-J；泳道2：正常DF-1细胞感染ALV-J。

具体实施方式

实施例：

1,查找目的基因:利用NCBI在线数据库查找鸡NHE1基因组序列。NCBI ReferenceSequence:NT_033779.5，在该基因的第一个外显子设计敲除靶位点，第一个外显子的序列如SEQ NO.1所示。

2，利用在线设计网站设计针对靶序列的sgRNA：利用张锋实验室网站 https://zlab.bio/guide-design-resources进行sgRNA的设计，选取6条候选 sgRNA，在sgRNA_F的5’端前部添加CACCG，在sgRNA_R的5’端添加AAAC，3’端添加C，具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

SEQ ID NO.2表1.靶向敲除鸡NHE1 W38基因的sgRNA

3,双链sgRNA的获得：用ddw将sgRNA_F和sgRNA_R溶解，使其终浓度为 100μM浓度，利用以下退火体系：sgRNA_F和sgRNA_R各1μL，10×PCR buffer 1μL，ddw 7μL，退火程序为5℃/min梯度降温至25℃，获得双链DNA。

4，载体质粒的酶切：利用BsmBI限制性内切酶酶切lentiCRISPR v2载体，酶切体系如下：BsmBI限制性内切酶1μL，lentiCRISPR v2质粒1μg，0.1M DTT 0.5μL，NEB buffer3.15μL，其余用ddw补至50μL，酶切条件为55℃15min，之后通过跑凝胶电泳(图1)，胶回收获得含有粘性末端的lentiCRISPR v2载体质粒。

5，表达sgRNA载体质粒的构建：将退火获得的双链sgRNA进行100倍稀释，同时将胶回收的载体质粒稀释至50ng/μL，之后按照以下体系进行连接：载体质粒1μL，双链sgRNA 1μL，T4连接酶1μL，10×T4 buffer 1μL，ddw 6μL，在4℃连接过夜，随后转化至stbl3感受态细胞中，挑取菌落提质粒后送测序鉴定。

6，缺失NHE1-W38所需的供体质粒的合成：由金唯智公司合成以pUC57为骨架，含有缺失NHE1-W38所需的供体质粒，并命名为：pUC57-delW38，其中修复模板序列如SEQ IDNO.3。

7，敲除细胞系的筛选：准备一个6孔板的DF-1细胞，每个孔分别转染4 μg的sgRNA和pUC57-delW38各2μg，不转染的细胞作为对照,转染6h后换成 5％生长液，48h后弃去原培养基，加入含有6μM嘌呤霉素的5％FBS DMEM培养基进行筛选，每隔3天换液，待阴性对照组的细胞全部死亡后，加入无药物的 5％FBS DMEM，当细胞密度达到80％左右时，进行亚克隆并扩大培养。

8，敲除细胞系的鉴定：待亚克隆的细胞生长至足够密度时，传代至48孔板，24孔板，12孔板，6孔板，之后收集细胞进行测序鉴定，以正常DF-1细胞为对照，结果如图2。

9，将DF-1和delW38-NHE1细胞系感染MOI＝5的ALV-J GY03,细胞感染三天后进行Western blot验证，评价敲除细胞系抗病毒效果，结果如图3所示，感染ALV-J的野生型DF-1细胞中可以检测到强烈的Env蛋白条带，而感染ALV-J 的敲除细胞系中未检测到Env蛋白，表明所构建的敲除delW38-NHE1细胞系能有效阻断ALV-J的感染入侵。

SEQ ID NO.1

鸡NHE1基因第一个外显子序列：

Atgggggccgcggccctccgagcccttccctgggctctgctgctgctgctgggcccgctgctgc ccggccagcgcttgcaggccgacgccacgcgtgtctccgagcccacctgggagcagccgtggggagag cccgggggtatcaccgccgccccgctggccacggcccaggaggtgcacccgctgaacaaacagcacca caaccactcggccgaggggcacccgaagccccgcaaagctttccccgtgctgggcatcgactactcgc acgtccgcatccccttcgagatctcgctctggatcctgctggcctgcctgatgaagatgg

SEQ ID NO.2

SEQ ID NO.3

供体质粒pUC57-delW38，修复模板序列：

GCCCGCTGCTGCCCGGCCAGCGCTTGCAGGCCGACGCCACGCGGGTCTCCGAGCCCACCGAGCA GCCGTGGGGAGAGCCCGGGGGTATCACCGCCGCCCCGCTGGCCACGGCCCAGGAGGTGCACCCGCTGAACAAACAGCACCACAACCACTC。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种精确敲除鸡NHE1基因W38位氨基酸的细胞系构建方法

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgggggccg cggccctccg agcccttccc tgggctctgc tgctgctgct gggcccgctg 60

ctgcccggcc agcgcttgca ggccgacgcc acgcgtgtct ccgagcccac ctgggagcag 120

ccgtggggag agcccggggg tatcaccgcc gccccgctgg ccacggccca ggaggtgcac 180

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ttccccgtgc tgggcatcga ctactcgcac gtccgcatcc ccttcgagat ctcgctctgg 300

atcctgctgg cctgcctgat gaagatgg 328

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caccgcccca cggctgctcc caggt 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacacctgg gagcagccgt ggggc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcccgctgct gcccggccag cgcttgcagg ccgacgccac gcgggtctcc gagcccaccg 60

agcagccgtg gggagagccc gggggtatca ccgccgcccc gctggccacg gcccaggagg 120

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