一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法

技术领域

本发明属于微生物工程菌技术领域，具体涉及一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法。

背景技术

柠苹酸，是一种商品化学品，在树脂生产工业中可作为甲基丙烯酸的合成前体，在食品工业中可作为软饮料的酸化剂，并且作为护肤品该物质具有除皱效果。在医药领域，该物质对鱼鳞病等皮肤疾病也具有临床功效。柠苹酸是一种五碳化合物，其1号位和4号位上各具有一个羧基，2号位上具有一个羟基和甲基，其构型包括(R)-柠苹酸和(S)-柠苹酸。在柠苹酸的生产路线上，主要包括化工合成法和微生物转化法。在化工生产工艺里，柠苹酸常利用氰化氢与乙酰乙酯缩合而成，有毒的合成前体以及昂贵的合成成本促使研究者们努力寻找毒性较小且更可持续的合成途径。随着基因工程、代谢工程以及发酵工程的发展，生物生产的柠苹酸可以与化工生产的柠苹酸相竞争。近年来，生物法生产柠苹酸有了进一步的研究与开发，生产宿主菌种主要为大肠杆菌(Escherichia coli)。

柠苹酸的生物合成路径可以分为两个步骤。第一步骤为利用大肠杆菌的天然代谢途径合成丙酮酸与乙酰辅酶A，丙酮酸与乙酰辅酶A为菌株碳代谢时常见的中间代谢物，可由葡萄糖或甘油等碳源物质代谢而成。第二步骤为丙酮酸与乙酰辅酶A缩合形成柠苹酸，该步骤由柠苹酸合酶催化。由于大肠杆菌中不存在编码柠苹酸合酶的基因，因此在菌株中转入并表达柠苹酸合酶基因是微生物转化法生产柠苹酸的关键。

大肠杆菌是常见的工业生产菌株，该菌属的菌株具有易于基因改造以及易培养等特点。以往的研究也开展了大肠杆菌的柠苹酸合成，将来源于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的柠苹酸合酶(CimA)定向进化并转化至大肠杆菌，并对丙酮酸与乙酰辅酶A的代谢通路进行了优化，敲除大肠杆菌的乙酸代谢合成途径以减少丙酮酸和乙酰辅酶A向乙酸的形成，也针对TCA循环中的柠檬酸合酶基因进行了敲除或者弱化突变，以减少乙酰辅酶A的代谢流，并因此合成高水平的柠苹酸，但该技术途径从葡萄糖等碳原料向柠苹酸的转化率仍有待提高，目前最高的碳转化率仅为53％左右，与理论上的最大转化率0.82g/g相比仍存在着很大差距。

发明内容

本发明的目的是，提供一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法。旨在解决现有技术中微生物法合成柠苹酸转化率不高的技术问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种改造的大肠杆菌工程菌，以埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3为出发菌株，在其基因组中插入识别T7启动子的T7 RNA聚合酶基因，得到所述改造的大肠杆菌工程菌。

所述的T7 RNA聚合酶是能够专一识别T7启动子并激活该启动子转录的酶，其在埃希氏菌属大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示。

作为优选实施方案，所述T7 RNA聚合酶基因插入的位点为Escherichia coliS17-3菌株基因组中的乳酸脱氢酶基因位点。所述的乳酸脱氢酶是指能够催化丙酮酸与乳酸之间相互转换的酶，其编码基因的名称为ldhA。其在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.2所示。

作为优选实施方案，所述改造的大肠杆菌工程菌进一步高表达柠苹酸合酶基因。

作为优选实施方案，所述高表达柠苹酸合酶基因的方法为：向大肠杆菌工程菌中转入能够重组生产柠苹酸合酶的表达质粒。

作为优选实施方案，所述柠苹酸合酶的基因序列如SEQ ID NO.8所示。所述的柠苹酸合酶是指能够催化丙酮酸与乙酰辅酶A缩合成柠苹酸的酶，其编码基因名称为cimA。该酶来源于古细菌詹氏甲烷球菌DSM 2661并进行过定向改造，其基因阅读框如SEQ ID NO.8所示。

作为优选实施方案，所述改造的大肠杆菌工程菌进一步失活以下其中一种或多种功能蛋白，

辅助响应因子RcsA；

响应调控因子RcsB；

跨膜传感激酶RcsC；

磷酸转运蛋白RcsD；

外膜脂蛋白RcsF。

所述的辅助响应因子为辅助埃希氏菌属大肠杆菌种细菌中转录表达调控的蛋白，其编码基因名称为rcsA。其在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3基因组中的基因阅读框如SEQ IDNO.3所示。

所述的响应调控因子为埃希氏菌属大肠杆菌种细菌中转录表达调控的蛋白，该蛋白在活化状态下形成同源二聚体或与辅助蛋白形成异源二聚体调控细菌基因的转录，其编码基因名称为rcsB。其在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.4所示。

所述的跨膜传感激酶是指接受来自细胞内膜上的外源刺激信号从而磷酸化并传递磷酸分子的酶，其编码基因名称为rcsC。其在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.5所示。

所述的磷酸转运蛋白是指接受磷酸分子的磷酸化并传递磷酸分子至响应调控因子的蛋白，其编码基因名称为rcsD。其在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.6所示。

所述的外膜脂蛋白是指细胞膜外膜上接受外界刺激信号并传递刺激信号至跨膜传感激酶的蛋白，其编码基因名称为rcsF。其在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供所述的大肠杆菌工程菌生产柠苹酸的方法，该方法为：将大肠杆菌工程菌接种到含碳源和氮源的培养基中进行发酵培养，菌体会利用碳源和氮源发酵生产柠苹酸。

作为优选实施方案，所述培养基包含碳源10-50g/L，氮源1-10g/L，无机盐0-10g/L。

作为优选实施方案，所述碳源选自葡萄糖或丙三醇；所述氮源选自酵母提取物、蛋白胨、铵盐、尿素；所述无机盐选择钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

作为优选实施方案，所述发酵培养的条件为：发酵温度为30-40℃，发酵过程中设置微氧培养，供氧量为0.05-0.2L空气/L培养液/分钟，维持发酵过程中发酵液的pH值在4.5-7.0之间。

本发明还提供所述的大肠杆菌工程菌在生产柠苹酸中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1，本发明提供的改造的大肠杆菌工程菌在利用T7表达系统表达柠苹酸合酶基因后，菌株将葡萄糖转化为柠苹酸的效率为0.60g/g。而进一步失活改造的大肠杆菌工程菌中的辅助响应因子基因，或响应调控因子基因，或跨膜传感激酶基因，或磷酸传递蛋白基因，或外膜脂蛋白基因之后，改造的工程菌的葡萄糖转化效率有不同程度的改变，其中以失活磷酸传递蛋白的大肠杆菌工程菌的葡萄糖转化效率最高，为0.75g/g。

2，本发明中改造的埃希氏菌属大肠杆菌的出发菌株为埃希氏菌属大肠杆菌种Escherichia coli S17-3(保藏号为CCTCC 2018200)，目前已申请通过以该菌株作为底盘细胞生产可拉酸(专利号：201811356593.X)与2’-岩藻糖基乳糖(专利号：CN202010084247.1)的专利。本发明在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3中引入T7表达系统，使该菌种具有高效表达蛋白的能力。同时通过辅助响应因子失活、响应调控因子失活、跨膜传感激酶失活、磷酸转运蛋白失活、外膜脂蛋白失活对埃希氏菌属大肠杆菌进行改造，并在细胞中高表达柠苹酸合酶。改造后的埃希氏菌属大肠杆菌利用葡萄糖、甘油等为碳源进行发酵，碳源转化为柠苹酸并在发酵液中积累，其碳源的转化率达到0.8g/g，接近于理论最大转化率0.82g/g。本发明提供的方法，生产的柠苹酸可用作工业生产甲基丙烯酸的原料。柠苹酸添加于化妆品中具有一定的除皱功效，在临床运用上对鱼鳞病等皮肤疾病也具有一定功效，在食品中可作为软饮料的酸化剂，是一种具有高附加值的化学品。

附图说明

图1为本发明实施例8中各菌株发酵结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

埃希氏菌属大肠杆菌S17-3(保藏号：CCTCC 2018200)来自于实验室保藏菌种。

实施例1：插入T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌工程菌

利用基因重组的方式在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3的乳酸脱氢酶基因位点替换并插入T7 RNA聚合酶基因，再消除作为筛选标记的卡那霉素抗性基因，得到重组埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7。具体构建方法包括如下步骤：

第一步，扩增乳酸脱氢酶基因(ldhA)的上下游两端长同源臂序列、抗性片段和T7RNA聚合酶片段。设计同源引物，分别通过PCR扩增埃希氏菌属大肠杆菌S17-3 ldhA基因上下游各300bp的DNA序列，以pKD4质粒(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带着卡那霉素抗性的基因片段；并以埃希氏菌属大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板进行扩增，得到T7 RNA聚合酶的基因片段。

第二步，利用融合PCR的方法连接上述的四个片段形成重组基因片段。融合PCR的程序为：PCR反应体系为10μL，包括DNA聚合酶，4个基因片段以及无菌水。PCR的反应程序为：预变性95℃5min，然后变性95℃15S，退火60℃15S，延伸72℃3min，循环数10。再进行第二轮PCR，配制的PCR体系为50μL，包括DNA聚合酶，引物，第一轮PCR反应产物以及无菌水。PCR反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15S，退火55℃15S，延伸72℃3min，循环数30。

第三步，将获得的PCR产物转入要进行基因组改造的埃希氏菌属大肠杆菌S17-3中，重组基因片段与菌株染色体上的乳酸脱氢酶基因进行同源重组，筛选得到的具有卡那霉素抗性的菌株即为已在基因组中插入T7 RNA聚合酶基因的菌株，同时该菌株携带卡纳霉素抗性基因。

第四步，消除重组菌株中的卡纳霉素抗性基因。将带有表达重组酶的pCP20质粒(商业质粒)电转入上一步骤中得到的卡纳霉素抗性菌株中，在30℃下利用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌株，再将该重组菌株接种后于43℃培养24小时。培养后同时划线于氯霉素抗性平板、卡那霉素抗性平板与无抗性平板，筛选得到只能够在无抗性平板上生长的菌株，命名为S17-3-T7。

实施例2辅助响应因子RcsA的功能缺失

利用基因重组的方式在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的辅助响应因子基因位点替换并插入抗性基因片段，再消除作为筛选标记的卡那霉素抗性基因，得到重组埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7ΔrcsA，构建过程如下：

首先，扩增辅助响应因子基因(rcsA)的上下游两端长同源臂序列以及抗性基因片段。分别通过PCR扩增埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的rcsA基因上下游各300bp的DNA序列。再以pKD4质粒为模板进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带着卡那霉素抗性的基因片段。然后使用融合PCR的方法连接上述的三个片段形成重组基因片段。PCR方法和实施例1相同，再将获得的PCR产物转入埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7中，重组基因片段与菌株染色体上的辅助响应因子基因进行同源重组，筛选得到的具有卡那霉素抗性的菌株即为已在基因组上失活辅助响应因子基因的菌株，最后进行重组菌株中抗性基因的消除。将表达重组酶基因的pCP20质粒电转至前述筛选得到的携带卡纳霉素抗性基因的菌株，在43℃的温度条件下培养24小时。培养后同时划线于氯霉素抗性平板、卡那霉素抗性平板与无抗性平板，筛选得到只能够在无抗性平板上生长的菌株，命名为S17-3-T7ΔrcsA。

实施例3辅助调控因子RcsB的功能缺失

利用基因重组的方式在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的辅助响应因子基因位点替换并插入抗性基因片段，再消除作为筛选标记的卡那霉素抗性基因，得到重组埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7ΔrcsB，构建过程如下：

首先，扩增辅助响应调控基因(rcsB)的上下游两端长同源臂序列以及抗性基因片段。分别通过PCR扩增埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的rcsB基因上下游各300bp的DNA序列。再以pKD4质粒为模板进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带着卡那霉素抗性基因片段。然后使用融合PCR的方法连接上述的三个片段形成重组基因片段。PCR方法和实施例1相同，再将获得的PCR产物转入埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7中，重组基因片段与菌株染色体上的辅助响应因子基因进行同源重组，筛选得到的具有卡那霉素抗性的菌株即为已在基因组上失活辅助响应因子基因的菌株，最后进行重组菌株中抗性基因的消除。将表达重组酶基因的pCP20质粒电转至前述筛选得到的携带卡纳霉素抗性基因的菌株，在43℃的温度条件下培养24小时。培养后同时划线于氯霉素抗性平板、卡那霉素抗性平板与无抗性平板，筛选得到只能够在无抗性平板上生长的菌株，命名为S17-3-T7ΔrcsB。

实施例4跨膜传感激酶RcsC的功能缺失

利用基因重组的方式在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的辅助响应因子基因位点替换并插入抗性基因片段，再消除作为筛选标记的卡那霉素抗性基因，得到重组埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7ΔrcsC，构建过程如下：

首先，扩增跨膜传感激酶基因(rcsC)的上下游两端长同源臂序列以及抗性基因片段。分别通过PCR扩增埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的rcsC基因上下游各300bp的DNA序列。再以pKD4质粒为模板进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带着卡那霉素抗性的基因片段。然后使用融合PCR的方法连接上述的三个片段形成重组基因片段。PCR方法和实施例1相同，再将获得的PCR产物转入埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7中，重组基因片段与菌株染色体上的辅助响应因子基因进行同源重组，筛选得到的具有卡那霉素抗性的菌株即为已在基因组上失活辅助响应因子基因的菌株，最后进行重组菌株中抗性基因的消除。将表达重组酶基因的pCP20质粒电转至前述筛选得到的携带卡纳霉素抗性基因的菌株，在43℃的温度条件下培养24小时。培养后同时划线于氯霉素抗性平板、卡那霉素抗性平板与无抗性平板，筛选得到只能够在无抗性平板上生长的菌株，命名为S17-3-T7ΔrcsC。

实施例5磷酸转运蛋白RcsD的功能缺失

利用基因重组的方式在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的辅助响应因子基因位点替换并插入抗性基因片段，再消除作为筛选标记的卡那霉素抗性基因，得到重组埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7ΔrcsD，构建过程如下：

首先，扩增磷酸转运蛋白基因(rcsD)的上下游两端长同源臂序列以及抗性基因片段。分别通过PCR扩增埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的rcsD基因上下游各300bp的DNA序列。再以pKD4质粒为模板进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带着卡那霉素抗性的基因片段。然后使用融合PCR的方法连接上述的三个片段形成重组基因片段。PCR方法和实施例1相同，再将获得的PCR产物转入埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7中，重组基因片段与菌株染色体上的辅助响应因子基因进行同源重组，筛选得到的具有卡那霉素抗性的菌株即为已在基因组上失活辅助响应因子基因的菌株，最后进行重组菌株中抗性基因的消除。将表达重组酶基因的pCP20质粒电转至前述筛选得到的携带卡纳霉素抗性基因的菌株，在43℃的温度条件下培养24小时。培养后同时划线于氯霉素抗性平板、卡那霉素抗性平板与无抗性平板，筛选得到只能够在无抗性平板上生长的菌株，命名为S17-3-T7ΔrcsD。

实施例6外膜脂蛋白RcsF的功能缺失

利用基因重组的方式在埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的辅助响应因子基因位点替换并插入抗性基因片段，再消除作为筛选标记的卡那霉素抗性基因，得到重组埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7ΔrcsF，构建过程如下：

首先，扩增外膜脂蛋白基因(rcsF)的上下游两端长同源臂序列以及抗性基因片段。分别通过PCR扩增埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7的rcsF基因上下游各300bp的DNA序列。再以pKD4质粒为模板进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带着卡那霉素抗性的基因片段。然后使用融合PCR的方法连接上述的三个片段形成重组基因片段。PCR方法和实施例1相同，再将获得的PCR产物转入埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7中，重组基因片段与菌株染色体上的辅助响应因子基因进行同源重组，筛选得到的具有卡那霉素抗性的菌株即为已在基因组上失活辅助响应因子基因的菌株，最后进行重组菌株中抗性基因的消除。将表达重组酶基因的pCP20质粒电转至前述筛选得到的携带卡纳霉素抗性基因的菌株，在43℃的温度条件下培养24小时。培养后同时划线于氯霉素抗性平板、卡那霉素抗性平板与无抗性平板，筛选得到只能够在无抗性平板上生长的菌株，命名为S17-3-T7ΔrcsF。

实施例7重组表达柠苹酸合酶埃希氏菌属大肠杆菌的构建

首先合成并扩增柠苹酸合酶基因构建重组表达质粒，由生工生物工程(上海)利用DNA化学合成法合成，合成的基因再由引物Frag-F：tggtgccgcgcggcagccatttacagtttaccggtaacttcacga(如SEQ ID NO.9所示)和引物Frag-R：tgtccaccagtcatgctagcatggttcgtatcttcgataccacc(如SEQ ID NO.10所示)进行PCR，得到柠苹酸合酶cimA基因片段。将获得的PCR产物与含有T7启动子的表达质粒相连，克隆的试剂盒为ClonExpress Ultra One StepCloning Kit。再将重组产物化转入大肠杆菌感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板筛选阳性克隆表达质粒。鉴定后的表达质粒利用电穿孔法转入实施例1至6中获得的埃希氏菌属大肠杆菌菌株中，最终分别构建完成多个重组菌株，分别命名为S17-3-T7-(cimA)、S17-3-T7ΔrcsA-(cimA)、S17-3-T7ΔrcsB-(cimA)、S17-3-T7ΔrcsC-(cimA)、S17-3-T7ΔrcsD-(cimA)、S17-3-T7ΔrcsF-(cimA)。

实施例8埃希氏菌属大肠杆菌摇瓶发酵产柠苹酸

将实施例7中获得的多个重组菌株分别接种到500mL锥形瓶中，其中装有50mL摇瓶发酵培养基，恒温振荡培养箱转速200转每分钟，恒温37℃进行发酵培养。培养基组分为：葡萄糖10-30g/L，磷酸氢二钠3.4-6.8g/L，磷酸二氢钾3-6g/L，氯化铵1g/L，酵母提取物2-5g/L，硫酸镁0.49-0.98g/L，硫酸铁2.8×10

结果表明，改造后的埃希氏菌属大肠杆菌在利用T7表达系统表达柠苹酸合酶基因后，菌株将葡萄糖转化为柠苹酸的效率为0.60g/g。而进一步失活改造的埃希氏菌属大肠杆菌中的辅助响应因子基因，或响应调控因子基因，或跨膜传感激酶基因，或磷酸传递蛋白基因，或外膜脂蛋白基因之后，改造的埃希氏菌属大肠杆菌的葡萄糖转化效率有不同程度的改变，其中以失活了磷酸传递蛋白的埃希氏菌属大肠杆菌的葡萄糖转化效率最高，为0.75g/g。

实施例9柠苹酸合成的发酵优化

利用5L发酵罐并以补料分批发酵的方式提高改造的埃希氏菌属大肠杆菌的柠苹酸产量。选择埃希氏菌属大肠杆菌S17-3-T7ΔrcsD-(cimA)做为发酵菌株，将该菌株接种至5L发酵罐中，其中装有2L发酵培养基，发酵罐转速设置为250转每分钟，pH值设置在5.0-7.0之间，进气量设置为2.0-6.0L空气/L培养液/分钟，恒温37℃进行培养。

初始培养基组分为：葡萄糖80g/L，酵母提取物7g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。每间隔一定时间利用高效液相色谱法定量发酵液中柠苹酸的含量和葡萄糖含量，当葡萄糖含量低于10g/L时向发酵罐内添加20g/L葡萄糖，直至柠苹酸含量不再增加时，停止发酵罐发酵，利用液相色谱进行柠苹酸的检测。发酵培养48小时后，调节空气进量，进行微氧培养，供氧量为0.05-0.2L空气/L培养液/分钟，最终在120小时发酵后，得到柠苹酸最大产量42.6g/L，实际消耗53.4g/L葡萄糖，碳源的转化效率达到0.80g/g。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2749

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

aggtacgatt tactaactgg aagaggcact aaatgaacac gattaacatc gctaagaacg 60

acttctctga catcgaactg gctgctatcc cgttcaacac tctggctgac cattacggtg 120

agcgtttagc tcgcgaacag ttggcccttg agcatgagtc ttacgagatg ggtgaagcac 180

gcttccgcaa gatgtttgag cgtcaactta aagctggtga ggttgcggat aacgctgccg 240

ccaagcctct catcactacc ctactcccta agatgattgc acgcatcaac gactggtttg 300

aggaagtgaa agctaagcgc ggcaagcgcc cgacagcctt ccagttcctg caagaaatca 360

agccggaagc cgtagcgtac atcaccatta agaccactct ggcttgccta accagtgctg 420

acaatacaac cgttcaggct gtagcaagcg caatcggtcg ggccattgag gacgaggctc 480

gcttcggtcg tatccgtgac cttgaagcta agcacttcaa gaaaaacgtt gaggaacaac 540

tcaacaagcg cgtagggcac gtctacaaga aagcatttat gcaagttgtc gaggctgaca 600

tgctctctaa gggtctactc ggtggcgagg cgtggtcttc gtggcataag gaagactcta 660

ttcatgtagg agtacgctgc atcgagatgc tcattgagtc aaccggaatg gttagcttac 720

accgccaaaa tgctggcgta gtaggtcaag actctgagac tatcgaactc gcacctgaat 780

acgctgaggc tatcgcaacc cgtgcaggtg cgctggctgg catctctccg atgttccaac 840

cttgcgtagt tcctcctaag ccgtggactg gcattactgg tggtggctat tgggctaacg 900

gtcgtcgtcc tctggcgctg gtgcgtactc acagtaagaa agcactgatg cgctacgaag 960

acgtttacat gcctgaggtg tacaaagcga ttaacattgc gcaaaacacc gcatggaaaa 1020

tcaacaagaa agtcctagcg gtcgccaacg taatcaccaa gtggaagcat tgtccggtcg 1080

aggacatccc tgcgattgag cgtgaagaac tcccgatgaa accggaagac atcgacatga 1140

atcctgaggc tctcaccgcg tggaaacgtg ctgccgctgc tgtgtaccgc aaggacaagg 1200

ctcgcaagtc tcgccgtatc agccttgagt tcatgcttga gcaagccaat aagtttgcta 1260

accataaggc catctggttc ccttacaaca tggactggcg cggtcgtgtt tacgctgtgt 1320

caatgttcaa cccgcaaggt aacgatatga ccaaaggact gcttacgctg gcgaaaggta 1380

aaccaatcgg taaggaaggt tactactggc tgaaaatcca cggtgcaaac tgtgcgggtg 1440

tcgataaggt tccgttccct gagcgcatca agttcattga ggaaaaccac gagaacatca 1500

tggcttgcgc taagtctcca ctggagaaca cttggtgggc tgagcaagat tctccgttct 1560

gcttccttgc gttctgcttt gagtacgctg gggtacagca ccacggcctg agctataact 1620

gctcccttcc gctggcgttt gacgggtctt gctctggcat ccagcacttc tccgcgatgc 1680

tccgagatga ggtaggtggt cgcgcggtta acttgcttcc tagtgaaacc gttcaggaca 1740

tctacgggat tgttgctaag aaagtcaacg agattctaca agcagacgca atcaatggga 1800

ccgataacga agtagttacc gtgaccgatg agaacactgg tgaaatctct gagaaagtca 1860

agctgggcac taaggcactg gctggtcaat ggctggctta cggtgttact cgcagtgtga 1920

ctaagcgttc agtcatgacg ctggcttacg ggtccaaaga gttcggcttc cgtcaacaag 1980

tgctggaaga taccattcag ccagctattg attccggcaa gggtctgatg ttcactcagc 2040

cgaatcaggc tgctggatac atggctaagc tgatttggga atctgtgagc gtgacggtgg 2100

tagctgcggt tgaagcaatg aactggctta agtctgctgc taagctgctg gctgctgagg 2160

tcaaagataa gaagactgga gagattcttc gcaagcgttg cgctgtgcat tgggtaactc 2220

ctgatggttt ccctgtgtgg caggaataca agaagcctat tcagacgcgc ttgaacctga 2280

tgttcctcgg tcagttccgc ttacagccta ccattaacac caacaaagat agcgagattg 2340

atgcacacaa acaggagtct ggtatcgctc ctaactttgt acacagccaa gacggtagcc 2400

accttcgtaa gactgtagtg tgggcacacg agaagtacgg aatcgaatct tttgcactga 2460

ttcacgactc cttcggtacc attccggctg acgctgcgaa cctgttcaaa gcagtgcgcg 2520

aaactatggt tgacacatat gagtcttgtg atgtactggc tgatttctac gaccagttcg 2580

ctgaccagtt gcacgagtct caattggaca aaatgccagc acttccggct aaaggtaact 2640

tgaacctccg tgacatctta gagtcggact tcgcgttcgc gtaacgccaa atcaatacga 2700

ctcactatag agggacaaac tcaaggtcat tcgcaagagt ggcctttat 2749

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60

gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120

actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180

ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240

aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300

gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360

caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420

actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480

cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540

gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600

atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660

gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720

caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780

gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840

ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900

gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960

ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990

<210> 3

<211> 624

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

ttagcgcatg ttgacaaaaa taccattagt cacattatcc gtcagtcgga cgacatggta 60

gataacctgt ttattatgcg ttttgatctt acgtttaata ttacctttat gcgatgaaac 120

ggtcttggct ttgatattca tttggtcaga gatttgaatg gttccctgac ctgccatcca 180

cattcgcaac atactcgatt cggttcggct caatgataac gtcggcatat ttaaaaacga 240

ggttatcgtt gtctcttttt tcagaatatc gccaaggata tcgtcgagag attccggttt 300

aatcgattta gaactgatca ataaattttt tctgaccaat agatattcat caaaatgaac 360

attggcaatt gccataaaaa cgataaataa cgtattggga tgttgattaa tgatgagctt 420

gatacgctga ctgttagaag catcgtggat gaaacagtcc tcattaataa acaccactga 480

agggcgctgt gaatcacaag ctatggcaag gtcatcaacg gtttcaatgt cgttgatttc 540

tcttttttta acccctctac tcaacagata cccggttaaa cctagtcggg tgtaactaca 600

taaatccata ataatcgttg acat 624

<210> 4

<211> 651

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

ttagtcttta tctgccggac ttaaggtcac tgaagagaga taattcagca gggcgatatc 60

gttctcgaca cccagcttca tcatcgcaga tttcttctgg ctactgatgg ttttaatact 120

gcggttcagc tttttagcga tctcggtcac caggaagcct tccgcaaaca ggcgcagaac 180

ttcactctct tttggcgaga gacgcttgtc accgtaacca ccagcactga ttttttccaa 240

caggcgagaa acgctttccg gggtaaattt cttccctttc tgcagcgcgg cgagagcttt 300

cggcagatcg gtcggtgcac cttgtttcag cacgatccct tcgatatcca gatccaatac 360

cgcactaaga atcgccgggt tgttgttcat agtcagaaca atgatcgaca ggcttgggaa 420

atggcgcttg atgtacttga ttaaggtaat gccatcgccg tacttatcgc caggcatgga 480

gagatcggta atcaacacat gcgcatccag tttcggcagg ttgttgatca gtgctgtaga 540

gtcttcaaat tcgccgacaa cattcaccca ctcaatttgc tcaagtgatt tgcgaatacc 600

gaacaagact atcggatggt catcggcaat aattacgttc atattgttca t 651

<210> 5

<211> 2850

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

ttgaaatacc ttgcttcttt tcgtacaacc ctgaaagcct cgcgctacat gttcagagca 60

ttggcgttag tgctctggct gttgattgct ttttcatccg ttttttacat cgttaatgcg 120

ttacatcagc gagaatcgga aattcgtcag gaatttaatc tgagttccga tcaggctcag 180

cgctttattc aacgcacctc tgatgtgatg aaagagctga agtacatcgc cgaaaatcgc 240

ttatcggcag aaaacggtgt gctttccccg cgtggacgag aaacgcaggc ggatgtgcct 300

gcgtttgaac cgctgtttgc cgactccgat tgttccgcaa tgagtaacac ctggcgaggt 360

tctctggagt cattggcgtg gtttatgcgc tactggcgcg ataatttttc tgcggcttac 420

gatctaaacc gggtattttt aatcggcagc gataacctct gcatggccaa tttcggtctg 480

cgtgatatgc cagtggaacg cgataccgcg ttgaaagctt tgcatgaacg catcaataaa 540

tatcgaaatg caccacaaga tgatagcggc agtaacctct actggatcag cgaaggtccg 600

cgccctggcg tcgggtattt ttacgcgttg acgccagttt atctggcgaa ccggttgcag 660

gcgcttttgg gtgtcgagca gaccatccgg atggagaact ttttcttacc gggtacgttg 720

ccgatggggg ttaccattct tgatgaaaat ggtcataccc tgatttcgct taccggacca 780

gaaagtaaaa ttaagggcga tcctcgctgg atgcaggaac gctcctggtt tggctatacg 840

gaagggttcc gggagctggt gctgaagaaa aatctgccac cctcatcgct aagcatcgtg 900

tattcggtgc cggttgataa ggtgctggaa cgcattcgca tgttgatcct taacgcaatt 960

ttgctgaatg tgcttgccgg agctgcattg tttactctcg cacggatgta cgagcgacgt 1020

attttcattc cggcggaaag cgacgccctg cgactggaag aacatgagca gttcaatcgc 1080

aagattgtcg cctccgcgcc agtgggtatc tgcattttgc gtaccgctga tggcgtcaat 1140

attttaagta acgaactggc gcatacctat ctcaatatgc ttacgcatga ggaccgccaa 1200

cgactgacgc aaattatctg tgggcagcag gtcaattttg ttgatgtcct gaccagcaac 1260

aataccaatc tgcaaatcag cttcgtccat tcgcgctatc gtaatgaaaa cgtggccatt 1320

tgtgtgctgg tggatgtttc ttcgcgcgtg aagatggaag agtcgttgca ggagatggca 1380

caagcagcgg aacaggcgag ccagtcaaaa tcgatgttcc ttgccaccgt cagtcatgag 1440

ctgcgaacgc cgctgtatgg cattatcggt aacctggatc tgttgcaaac caaagagtta 1500

ccgaaaggcg tcgatcggct ggtgacggca atgaacaact cttccagcct gttgttgaaa 1560

attatcagcg atattctcga tttctcgaag attgaatcgg aacagttgaa gatcgaaccg 1620

cgtgagtttt caccgcgtga agtgatgaac cacatcaccg ccaactattt accgctggtg 1680

gtacgcaagc agttaggctt gtactgcttt attgaaccgg atgtgccagt ggccttaaat 1740

ggcgacccga tgcgtttaca gcaggtcatc tccaacctgt tgagtaacgc cataaaattc 1800

accgataccg gctgtatagt tttgcatgtt cgcgcggatg gcgattatct ctctatccgt 1860

gttcgcgata ccggcgtggg gataccggcg aaagaagtgg tgcgcttgtt tgatcccttc 1920

ttccaggtcg gaacgggcgt acagcgtaat ttccagggga ccggtctggg tctggcgatt 1980

tgtgaaaaac tgatcagcat gatggacggc gatatctcgg tagattcaga accgggaatg 2040

ggcagccagt ttaccgtgcg tattccgttg tacggcgctc agtacccgca gaaaaaaggc 2100

gtggaagggt tgagtggtaa acgctgctgg ctggcggtcc gcaatgcgtc gctctgtcag 2160

ttcctggaaa ccagtttgca gcgcagcggc atcgtcgtta caacatacga agggcaggaa 2220

ccgactcccg aagatgtgtt gatcactgac gaggtagtga gtaaaaaatg gcagggcaga 2280

gcggtagtga ccttctgtcg tcgccatatt ggtattccgc tggagaaagc gccaggggag 2340

tgggtacaca gtgtggctgc tccgcatgag ctaccggcat tgttggcgcg tatttatttg 2400

atcgagatgg agagcgacga tcctgctaac gctctgccgt caacggacaa agcggtcagc 2460

gataatgacg atatgatgat tctggtcgtg gatgatcatc cgattaaccg gcgtttgctg 2520

gcagatcagt tgggatcgtt gggctatcaa tgtaaaaccg cgaatgatgg cgtcgatgcg 2580

cttaatgtac ttagcaagaa tcatattgat atcgtgctta gcgacgtcaa catgccaaat 2640

atggatggtt accgcttgac gcaacgcatt cgtcagttgg gactgacgtt gccggtaatc 2700

ggagtaactg ctaatgcgtt ggctgaagag aagcagcggt gtctggagtc cggtatggac 2760

agctgcctgt cgaagccggt aacgctggat gtgataaaac agacgctgac gttatatgcc 2820

gagagggtca ggaaatcgcg ggattcgtag 2850

<210> 6

<211> 2673

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

ctacagcaag ctcttgacat aactgtcaat gtcgctgatg tatttttcta ttcctggaac 60

atccttctca cgaatcagat gttccagcgt ttcacataac tgcttgccgg gtaccagatt 120

tagcatggca aatacgcctt taagacgatg agccgtttgg gctaacgcag caaagtcact 180

ggttgctgct tcagtataca gcctcttaac atcatccggt actgtgtcta caaagagcgc 240

ataatagccg ctggcatgga gttgcgcatt ttcatctccg cccagaggcg attctgtcac 300

ctcttcctgc gccagttgca cttcaattaa ttgtaagacc gcttcctgca tagcgttgct 360

catattgaag ttgacgcaca attgaccagg cccaatttcc cgtacgccag actcatcatc 420

gcttaaaagc aagccagagg cagtaagatt agacggatta tccgttaaaa agatatcata 480

atcttgacta attaatcttt catcgggtgt gatacaggtt gcaccccaat tttctaactg 540

gcgagtgaca atattccgaa tttctgccga agtaacatcc accattacgc agacatcatc 600

cagtaaacgc tcttcttcct cttcaacttc cgggtcagct gcgagcattt tgatatgcac 660

agagtagcgt gtaccaagcc catcccgcgt tttgatgttt aaatgaccgc ccagtttacg 720

tgccagttga tcgctcagcc agaatgccag cgggtccgcc ttgccatagc gatcgttttg 780

ggtctggttg ataaacggga agtgcaaatt atccatttca tgaatactta cgccttctcc 840

cgtgtccaga atgcggaacg tcaggcggtc ttcggaggac tcatcctgat caacctcaag 900

ggtgattttt cccaattgcg ttgaggtcac ggcatattgc atcagtagca gcaaaatacg 960

tcgtaaggca tcgcgatcgc cgcggcgcat atcgtgtgct ttcagatgat tgttaatcag 1020

cagttgcaga cctttacgct tgatggcagg caacactgaa ggcacaactt catcaattaa 1080

atcctgcacg gagaacagca ccgtctcact tttccagcta tcatccgcaa gcatgttcgc 1140

taactgtatt tcatcaacca gccgcaccag cacatctgcc tgattcgcca gttgtttgct 1200

ttccggggcg ttgagtttag ccgcgctctc cgccagggac tgtgcgggtt ctttcagcgc 1260

atcgccaatg tttttcataa agatcatccg cccctgctgg tttttctcat acagacgctg 1320

cgcctgcttg agtttcttgt ttaccagcac ttcgcgatcc tgatcgcgaa taatgaaaat 1380

ttgtgtgcgc ggcgcgacct ggctgcggaa catgcggatc tcatacagct cgttattgat 1440

cgtcgcctga ataatcccct gatgctgttc cgccatggtg gtgatgtttt gcagattcaa 1500

atgcggcagc aaatgatcgg caattttgtt acttatgaca gtgcggttcg attcctgatc 1560

gtgaaccagc aggccgagcg gcagcagtga gactatctct tcattgattg cccgtaaaat 1620

gcgcaattcg ttattgaccg ccgtgctggg gacgttttct gtactgcggc tggagaaatg 1680

gcggaatgtg gtatagccaa ataacgccag cgccagcaaa ccgatgttca gcagcagtgg 1740

cagcagaatg ttttgcaacg tatccagcaa taaggtgcca taaggaacct gccagaccag 1800

gcgcatatcg gtagagttga gtgccgagga gatttcaatc ttcgtactgt taaagtggat 1860

actgacgcta tccgtccctt ctttctcatt atcattgttt cccgttgccg tcgcgtctgg 1920

ctcaaggcgg aaactgtcca gcggcatacc cggtgggatc aaatcattaa tcggcagatc 1980

aaaagccacg accgttgcca gatgtcctgg ctggttaaag gtagtacgca atgtaaagta 2040

atgaccgttc tgccaggcca ggcggcgcat gttagaaaag ctttcgcgtt catcgagggc 2100

gttggcctgt tgcaacatct ctgcacgacg tgaatcaaca atgtcgctga cggtcgattc 2160

tttaaatccg gaggtgagat ctttaagggg tagggttgag atcagcacca gactgttatc 2220

ctgaccattc aggtaataca tcgaccacgg tacattttct gcgccccaca atgtatccag 2280

ataagtggac atccgctgag tcatctcaag cgttgagttg tcgtgagagc caaagattaa 2340

cgcttccgtt ttgcggcgtg gtttctccag atagtagaca tcctgtttca ggcgcgtctc 2400

ttgtaaacct tcgccggagg agggggaggt cgtcgcggca atgttgtcgt agatctgcca 2460

ggtcacgtaa cgccagttat cgacgcgctt ttggatagca tgggtaatgt cgacaatctg 2520

gtaactttta tctttcagcc aggcgttaac ggcgctttgt accattacac ccatcgtcac 2580

cagtaacaca atgatcaaca gtaaaaagaa gcgggtaatg ctccccggta ggagtgaaaa 2640

gcgggtcgtg gccgttgtct ctttctgacg cat 2673

<210> 7

<211> 405

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

atgcgtgctt taccgatctg tttagtagca ctcatgctaa gcggctgttc catgttaagc 60

agatcccctg tcgaacccgt tcaaagcact gcaccccagc cgaaagcgga gcctgcaaaa 120

ccgaaagcgc cgcgcgccac gccggtccga atttatacca atgcagaaga attagtcggc 180

aaaccgttcc gcgatctcgg tgaagtcagt ggcgactctt gccaggcctc taatcaggac 240

tctccgccga gcattccaac cgcacgtaag cggatgcaaa tcaacgcctc taaaatgaaa 300

gccaatgctg tattactgca tagctgcgaa gtcaccagcg gtacgccagg ctgctatcgt 360

caggctgtat gtatcggttc tgcgcttaac attacggcga aatga 405

<210> 8

<211> 1116

<212> DNA

<213> 詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)

<400> 8

atggttcgta tcttcgatac caccctgcgt gatggtgaac agaccccagg cgtttctctg 60

accccgaacg ataaactgga aatcgcgaaa aaactggatg aactgggcgt tgatgttatc 120

gaagcgggta gcgcggttac cagcaaaggt gaacgtgaag gtatcaaact gatcaccaaa 180

gaaggtctga acgcggaaat ctgcagcttc gttcgtgctc tgccggttga catcgatgct 240

gcgctggaat gcgacgttga ttctgtgcac ctggttgttc cgaccagccc gatccacatg 300

aaatacaaac tgcgtaaaac cgaagatgaa gttctggtta ccgcactgaa agcggtggaa 360

tacgcgaaag aacagggtct gatcgttgaa ctgtctgcag aagatgcgac ccgctctgac 420

gtgaacttcc tgatcaaact gttcaacgaa ggcgaaaaag ttggtgctga tcgtgtgtgc 480

gtttgcgata ccgttggtgt tctgaccccg cagaaaagcc aggaactgtt caagaaaatc 540

accgaaaacg ttaacctgcc ggttagcgtt cactgccaca acgatttcgg catggctacc 600

gcgaacgcgt gctctgcggt tctgggcggc gcagttcagt gccacgttac cgtgaacggc 660

atcggtgaac gtgcgggtaa cgcgagcctg gaagaagtgg tggcggcgtc caaaattctg 720

tacggctacg ataccaaaat caaaatggaa aaactgtacg aagttagccg tattgttagc 780

cgtctgatga aactgccggt gccgccgaac aaagcgatcg ttggtgataa cgcgttcgct 840

cacgaagcgg gtatccatgt tgatggtctg atcaaaaaca ccgaaaccta cgaaccgatt 900

aaaccggaaa tggttggcaa ccgccgtcgt atcatcctgg gtaaacactc tggtcgtaaa 960

gcgctgaaat acaaactgga cctgatgggt atcaacgtta gcgatgaaca gctgaacaaa 1020

atctacgaac gtgttaaaga atttggtgat ctgggtaaat acatctctga tgctgatctg 1080

ctggcgatcg ttcgtgaagt taccggtaaa ctgtaa 1116

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 9

tggtgccgcg cggcagccat ttacagttta ccggtaactt cacga 45

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 10

tgtccaccag tcatgctagc atggttcgta tcttcgatac cacc 44