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一种检测新型冠状病毒的变异位点的引物组合物

文献发布时间：2023-06-19 16:11:11

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒的变异位点的引物组合物及其应用。

背景技术

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的omicron株，是一种高度变异的病毒，具有很高的感染风险，通过基因检测结果证明，omicron株增强的传播性与毒力与其spike蛋白（S蛋白）的变异有关。目前，Omicron株的变异位点的检测主要依赖于实时荧光RT-PCR方法，但是，由于实时荧光检测方法对于单基因突变的定性诊断有难度，主要依赖于有变异与无变异检测的CT值的差值来判定结果，对于病毒载量较低的样本，鉴定难度很大。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种复杂生物样品中痕量核酸的全方位研究的SARS-CoV-2的omicron株的检测方法，尤其在于S基因的变异位点的检测。具有通量高、检测速度快、成本低的特点，该技术的检测效率、检测通量均远高于荧光定量PCR检测，而检测周期又远低于传统的一代测序和二代测序，少量的临床标本也可进行多基因多位点的检测。具体的，本发明根据变异位点区域成功设计和合成特异性丰度扩增引物以及单碱基延伸引物，将扩增产物经消化后对待测变异位点进行单碱基延伸，延伸产物使用飞行时间质谱进行分子量差异检测，通过数据分析，用于鉴定omicron株的全部特异性突变位点，提高检测效率，减少检测成本，为临床诊断提拱了强有力的技术支持。

本发明的第一方面，提供了一种检测新型冠状病毒的变异位点的引物组合物，所述的引物组合物包含丰度扩增引物和/或单碱基延伸引物，所述的丰度扩增引物如SEQ IDNO：1-6所示，所述的单碱基延伸引物如SEQ ID NO：7-18所示。

所述的引物组合物可以扩增或检测SARS-CoV-2，优选检测SARS-CoV-2的变异位点，进一步优选检测SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点，更优选为检测痰液或咽拭子（口腔或鼻）中的SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点。所述的变异位点编码的蛋白优选为G339D、S371L、S373P、S375F、T376A、N440K、Q498R、Y505H、N764K、D796Y、G954K、N969K中的一种或两种以上的组合。

所述的扩增可以为PCR、RT-PCR、qPCR、RCA、SDA、RPA、LAMP等。

所述的引物组合物可以用于诊断COVID-19。

本发明的第二方面，提供了一种上述引物组合物的应用，所述的应用包括：

A）在检测SARS-CoV-2的变异位点中的非疾病治疗和/或诊断的应用；或，

B）在制备治疗和/或诊断COVID-19的产品中的应用；

C）在检测SARS-CoV-2中的应用；

D）在治疗和/或诊断COVID-19中的应用。

所述的SARS-CoV-2的变异位点为SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点。编码的蛋白优选为G339D、S371L、S373P、S375F、T376A、N440K、Q498R、Y505H、N764K、D796Y、G954K、N969K中的一种或两种以上的组合。

所述的检测SARS-CoV-2的变异位点为检测痰液或咽拭子（口腔或鼻）中的SARS-CoV-2的变异位点。

所述的产品可以为试剂盒或芯片。

所述的诊断COVID-19包括检测SARS-CoV-2的存在和/或含量。优选检测痰液或咽拭子（口腔或鼻）中的SARS-CoV-2的存在和/或含量。

本发明的第三方面，提供了一种检测SARS-CoV-2的S蛋白或基因的试剂的应用，所述的应用包括：

A）在检测SARS-CoV-2的变异位点中的应用；或，

B）在制备治疗和/或诊断COVID-19的产品中的应用；

C）在检测SARS-CoV-2中的应用；

D）在治疗和/或诊断COVID-19中的应用。

所述的检测SARS-CoV-2的S蛋白为检测SARS-CoV-2的S蛋白的变异位点。优选为G339D、S371L、S373P、S375F、T376A、N440K、Q498R、Y505H、N764K、D796Y、G954K、N969K中的一种或两种以上的组合。

所述的检测SARS-CoV-2的S蛋白或基因的试剂包含上述第一方面的引物组合物。

本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含上述的引物组合物。

所述的试剂盒中还包含PCR或RT-PCR所需试剂。例如模板、引物、水、缓冲液、RNA、反转录酶等中的一种或两种以上的组合。

所述的试剂盒中还包含去磷酸化反应试剂和/或单碱基延伸反应试剂。

所述的去磷酸化反应试剂例如SAP酶、模板、缓冲液、水等中的一种或两种以上的组合。

所述的单碱基延伸反应试剂例如缓冲液、SAP产物、引物等中的一种或两种以上的组合。

所述的试剂盒还包含质谱检测所需试剂。例如芯片、水、纯化所需试剂等等中的一种或两种以上的组合。

所述的试剂盒可以用于扩增或检测SARS-CoV-2，即为SARS-CoV-2的检测试剂盒，优选检测SARS-CoV-2的变异位点，即为SARS-CoV-2的变异位点的检测试剂盒，进一步优选检测SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点，即为SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点的检测试剂盒，更优选为检测痰液或咽拭子（口腔或鼻）中的SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点。所述的变异位点编码的蛋白优选为G339D、S371L、S373P、S375F、T376A、N440K、Q498R、Y505H、N764K、D796Y、G954K、N969K中的一种或两种以上的组合。

所述的扩增可以为PCR、RT-PCR、qPCR、RCA、SDA、RPA、LAMP等。

所述的试剂盒可以用于诊断COVID-19，即为COVID-19的诊断试剂盒。

所述的诊断COVID-19包括检测SARS-CoV-2的存在和/或含量。

本发明的第五方面，提供了上述试剂盒在检测SARS-CoV-2或其变异位点或者诊断COVID-19中的应用或者制备诊断COVID-19中的应用。

本发明的第六方面，提供了一种SARS-CoV-2或其变异位点的检测方法，所述的检测方法包括：

A）用丰度扩增引物对待测样本进行PCR或RT-PCR扩增反应，获得扩增产物，所述的丰度扩增引物如SEQ ID NO：1-6所示；

B）将步骤A）获得的扩增产物利用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，获得去磷酸化产物；

C）用单碱基延伸引物对步骤B）获得的去磷酸化产物进行单碱基延伸，获得延伸产物，所述的单碱基延伸引物如SEQ ID NO：7-18所示；

D）将步骤C）获得的延伸产物进行树脂脱盐纯化；

E）质谱检测。

所述的SARS-CoV-2为SARS-CoV-2的omicron株。

所述的SARS-CoV-2的变异位点为SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点。所述的变异位点编码的基因优选为G339D、S371L、S373P、S375F、T376A、N440K、Q498R、Y505H、N764K、D796Y、G954K、N969K中的一种或两种以上的组合。

所述的待测样本为咽拭子（口腔或鼻）或痰液。

所述的质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

所述的碱性磷酸酶为虾碱性磷酸酶。

优选的，A）中所述的RT-PCR扩增的体系和程序见表1。

优选的，B）中所述的去磷酸化的体系和程序见表2。

优选的，C）中所述的单碱基延伸的体系和程序见表3。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测方法包括：

取个体的鼻咽拭子，提取RNA；

采用SEQ ID NO：1-6对提权的RNA进行RT-PCR扩增反应，获得扩增产物；

用虾碱性磷酸酶消化扩增产物，以去磷酸化；

用SEQ ID NO：7-18对消化后的SAP产物进行单碱基延伸；

树脂脱盐纯化，然后离心；

上样至芯片上；

利用

本发明的第七方面，提供了一种飞行质谱检测体系，包括上述第一方面的引物组合物以及MALDI-TOF MS体系。

本发明获得的有益效果：

本申请成功设计和合成特异性丰度扩增引物以及单碱基延伸引物，将扩增产物经消化后对待测变异位点进行单碱基延伸，延伸产物使用飞行时间质谱进行分子量差异检测，通过数据分析，用于鉴定omicron株的全部特异性突变位点，无须进行荧光信号的采集，可以检测出延伸探针与延伸产物之间只有一个碱基的分子量差异，其检测范围在1000-10000Da。

本发明所述的检测方法提高了检测效率，减少检测成本，且该方法检测omicron株的特异性、敏感性和稳定性都极高。更重要的是，对于灵敏度，现有技术中最高也只做到200copies/mL，本申请做到50 copies/mL。

本发明所述的“待测样本”可以来源于人或非人哺乳动物。

本发明所述的“个体”可以为人或非人哺乳动物或细胞或器官或组织。

本发明所述的“非人哺乳动物”可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠（例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠）或猴等等。

本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。

本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“检测方法”可以为诊断或治疗目的，也可以为非诊断或治疗目的。

本发明英文简写与中文对应：

PCR：聚合酶链式反应。

RT-PCR：反转录PCR。

qPCR：实时荧光定量PCR。

RCA：滚环核酸扩增技术。

RPA：重组酶聚合酶扩增技术。

SDA：链替代扩增技术。

LAMP：环介导等温扩增反应。

SAP：Shrimp Alkaline Phosphatase，虾碱性磷酸酶。

MALDI-TOF MS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

RT酶：逆转录酶。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：引物组1检测SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点的质谱图；

图2：引物组2检测SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点的质谱图；

图3：引物组3检测SARS-CoV-2的omicron株S基因的变异位点的质谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：引物组合物设计

根据SARS-CoV-2，NCBI(National Center for Biotechnology information)登录号：ON373214的S蛋白的变异位点。优选为G339D、S371L、S373P、S375F、T376A、N440K、Q498R、Y505H、N764K、D796Y、G954K、N969K设计丰度扩增引物和单碱基延伸引物，从设计的若干种引物中特定选择下列引物组1-3。

具体的，引物组1，丰度扩增引物：SEQ ID NO：1至6。单碱基延伸引物：SEQ ID NO：7至18。引物组2，丰度扩增引物：SEQ ID NO：19至24。单碱基延伸引物：SEQ ID NO：25至36。引物组3，丰度扩增引物：SEQ ID NO：37至42。单碱基延伸引物：SEQ ID NO：43至54。

其中，SEQ ID NO：1至18的具体序列如下：

SEQ ID NO：1--ATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGT；

SEQ ID NO：2--GAATAATCAGCAACACAGTTGCTG；

SEQ ID NO：3--ACGCCACCAGATTTGCATCTG；

SEQ ID NO：4--GTGTAATGTCAAGAATCTCAAGTGTC；

SEQ ID NO：5--ACTACTGATGCTGTCCGTGATC；

SEQ ID NO：6--GCATCTGCAAGTGTCACTTTGTTG；

SEQ ID NO：7--TCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTT；

SEQ ID NO：8--GCTGATTATTCTGTCCTATATAAT；

SEQ ID NO：9--GCTGATTATTCTGTCCTATATAAT；

SEQ ID NO：10--CTGTCCTATATAATTCCGCATCATTT；

SEQ ID NO：11--AGGAGACACTCCATAACACTTAAAA；

SEQ ID NO：12--TGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACA；

SEQ ID NO：13--TCCTTTACAATCATATGGTTTC；

SEQ ID NO：14--TTCCAACCCACTTATGGTGTTGG；

SEQ ID NO：15--TGGCAGTTTTTGTACACAATTAA；

SEQ ID NO：16--ACTTCAAGATGTGGTCAACC；

SEQ ID NO：17--TGTTAAACAACTTAGCTCCA；

SEQ ID NO：18--GCTTGTTAAACAACTTAGCTCCA。

实施例2：特异性引物、单碱基延伸反应结合MALDI-TOF MS的检测

一、样本来源

542份新冠疑似病例样本类型为鼻咽拭子，病例年龄分布在20岁~45岁之间。

核酸提取过程：

利用天隆科技公司的核酸提取或纯化试剂及自动核酸提取仪进行核酸提取，每个样本的加样量为200μL，提取方法按试剂盒说明书进行，病毒核酸洗脱量约70μL；获得待测样本。

二、检测步骤

第一步：用SEQ ID NO：1-6对待测样本进行RT-PCR扩增反应，获得扩增产物；其中，RT-PCR配制体系及扩增程序见表1。

表1：RT-PCR配制体系及扩增程序

第二步：将第一步获得的扩增产物（RT-PCR产物）利用SAP酶进行去磷酸化处理，获得去磷酸化产物（SAP产物），其中SAP配制体系及消化程序见表2。

表2：SAP配制体系及消化程序

其中，重组SAP购买自ABI公司。

第三步：用SEQ ID NO：7-18对SAP产物进行单碱基延伸，获得延伸产物，其中，延伸配制体系及延伸程序见表3。

表3：延伸配制体系及延伸程序

第四步：延伸反应结束后，向每支反应孔中加入35µL配制好的树脂（使用DyeEx®2.0 Spin Kit（250），购自QIAGEN公司，货号40724），混匀5min，5000转离心1min，取上清，获得纯化产物。

第五步：上样

将第四步获得的纯化产物加样到微阵列芯片40孔（购自北京毅新博创生物科技有限公司）上。

第六步：飞行时间质谱检测

将

二、检测结果

各引物组的质谱结果见图1-3。结果显示，引物组1结合飞行时间质谱检测可以检测出全部突变位点，峰值高且特定。而引物组2、3结合飞行时间质谱检测，结果均显示有的突变位点检测不出来，且包含非特异性检测点。

1、SARS-CoV-2的omicron株的全部变异位点的飞行质谱检测体系特异性验证：

将SARS-CoV-2的omicron株提取的RNA为阳性对照，分别对新冠野生株、新冠alpha株、新冠 delta株、人冠状病毒OC43、人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、人冠状病毒HKU1、H3N2流感病毒、H1N1流感病毒、BV流感病毒、BY流感病毒、副流感病毒PIV1-4型、腺病毒5型、呼吸道合胞病毒A型和B型、人偏肺病毒、人博卡病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的阳性样本提取核酸分别进行检测，以验证本发明检测方法的分析特异性。结果表明，只有SARS-CoV-2的omicron株的12个变异位点全部检出，其他病原体都没有检出。

2、SARS-CoV-2的omicron株的全部变异位点的飞行质谱检测体系灵敏度验证：

SARS-CoV-2的Omicron株的阳性核酸起始定量为5×10

3、SARS-CoV-2的omicron株的全部变异位点的飞行质谱检测体系临床应用验证：

利用542份鼻咽拭子样本进行临床验证，并且与已获得国家药品监督管理局批证的SARS-CoV-2的实时荧光检测试剂（广州达安，靶标是OFR1ab和N基因）同时进行检测，其灵敏度与特异性均为100%，结果详见表4。

表4：本申请方法与SARS-CoV-2的实时荧光PCR试剂检测结果的比较

实施例3：溯源效果

2022年6月初，对某市A区1例、B区1列、C区1例鼻咽拭子样本进行实施例2检测步骤进行核酸提取、丰度扩增、去磷酸化、单碱基延伸、点芯片、打质谱，通过12个特异变异位点的检出，分析与聚集性疫情变异位点高度一致，表明溯源成功。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 北京市疾病预防控制中心

<120> 一种检测新型冠状病毒的变异位点的引物组合物

<130> 1

<160> 54

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA