一株猪细小病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株分离纯化的猪细小病毒及其应用。

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)，属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(parvovirus)，单股DNA，无囊膜，基因组约5.2Kb。成熟PPV完整病毒粒子外观呈六角形或圆形、典型的二十面立体对称结构，血清型单一，很少发生变异。病毒对热及酸碱均具有较强抵抗力。PPV基因组编码了3种结构蛋白：VP1、VP2、和VP3，分子量分别是84kDa、64kDa和60kDa，是PPV的主要免疫原性抗原。

1967年分离到猪细小病毒并首次证明了它的致病作用。PPV最早出现在欧洲，我国于1982年分离到该病毒。PPV感染能引起猪的繁殖障碍性疾病。PPV感染母猪后产死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪，猪群暴发该病时常与木乃伊胎、窝仔数减少等临床表现有关。带毒猪和病猪是本病的传染源，经消化道、呼吸道、精液进行传播，各种不同年龄、性别的家猪和野猪均易感。目前研究结果表明：PPV对猪的影响主要分为两个方面：一是对母猪受精卵细胞的影响，二是对胎儿发育的影响。采集流产或死产胎儿的新鲜组织病毒分离鉴定。随着生猪养殖业集约化程度不断提高，该病对生猪养殖业的危害日趋严重。

目前PPV在我国呈流行趋势。随着各种猪病毒病的不断发生，外界环境的复杂和猪群体抗力的下降，近年来，PPV感染呈扩大上升的趋势、越来越多的猪场相继爆发PPV，给养殖业造成了一定的危害和巨大的经济损失，及时研发高效的疫苗和诊断试剂盒，对于防控该病具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株猪细小病毒及其部分基因组序列，以及基于分离株制备的灭活疫苗在猪细小病毒病防控中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一株猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)及其VP2基因组核苷酸序列，该序列具有特殊变异位点。

本发明将某猪场的病猪组织研磨液接种ST细胞，经细胞传代、纯化及鉴定，得到一株猪细小病毒，命名为PPV-ZM2021，于2022年9月15日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.45271。本发明提供猪细小病毒分离株的VP2基因组序列，如SEQ ID N o.1所示。

上述猪细小病毒PPV-ZM2021经悬浮培养能到达高滴度，其在细胞上增殖稳定，滴度高达10

采用该猪细小病毒分离株PPV-ZM2021制备的疫苗能够诱导猪产生高水平的中和抗体、交叉保护性好。

第二方面，本发明提供一种含有所述猪细小病毒毒株的生物制品，所述生物制品用于预防、或诊断猪细小病毒病。

所述的生物制品可以是疫苗或诊断试剂。

其中，所述的疫苗为活疫苗或灭活苗。

本发明提供的包含所分离猪细小病毒的灭活疫苗。所述灭活疫苗由猪细小病毒PPV-ZM2021接种ST细胞进行传代培养、收获病毒液、测定毒价，灭活，然后按重量比1:1比例与佐剂混匀。

佐剂可以为任何动物疫苗可用的佐剂，其中佐剂可以由如下重量百分含量的组分制成：注射用水溶液90％，聚乙烯吡咯烷酮2％，聚乳酸-羟乙酸(PLGA)3％，聚乙二醇60001％，烷基糖苷(癸基葡糖苷)(APG0816)2％，聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯1％，鲸蜡醇1％。

所述灭活疫苗抗原含量为每头份不低于10

所述诊断试剂可以为ELISA试剂盒，其中，包括所述猪细小病毒毒株全病毒包被的酶标板和酶标二抗。

在此基础上，含有本发明所述猪细小病毒在制备用于防控、诊断猪细小病毒病的其他生物制品也属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果在于：

本发明的发明人于2021年从某猪场病猪组织中分离并经传代纯化，获得一株猪细小病毒，命名为PPV-ZM2021。该分离株在传代细胞上增殖性好，对仔猪无明显致病力，且免疫原性优异，能够诱导仔猪产生高水平中和抗体，为猪细小病毒的有效防控奠定坚实的基础。

利用本发明所得猪细小病毒PPV-ZM2021在易感细胞系ST上增殖快，增殖滴度高，可达10

建立血清抗体检测方法对于筛选细小病毒阴性猪有重要的作用。ELISA具有敏感性高、特异性好、可批量操作的特点，便于临床推广应用。本发明提供的包含所分离猪细小病毒的ELISA试剂盒，能较好的检测血清中的猪细小病毒抗体，为该病的有效检测提供了重要基础。

附图说明

图1为猪细小病毒分离株在ST贴壁细胞上培养，其中，A为猪细小病毒在ST细胞上的病变(CPE)，B为正常ST细胞对照。

图2为猪细小病毒的氨基酸变异图。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均为市售产品。

实施例1猪细小病毒的分离

1.病猪组织的采集与处理

采集病猪组织，剪碎，加入10倍体积含500单位双抗的DMEM培养基研磨，4℃，12000rpm离心5min，取研磨液上清，-80℃冻存备用。

2.病猪组织病原检测

取200μl上述研磨液上清，用北京全式金生物公司DNA/RNA提取试剂盒，按说明书步骤提取DNA和RNA；然后，用全式金反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以提取的DNA和反转录cDNA为模板，分别用猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型/3型(PCV2/PCV3)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PDCoV)共9对检测引物及全式金2╳EasyTaq PCRSuperMix进行PCR检测，同时设置阳性和阴性对照。检测结果显示，病料研磨液为猪细小病毒阳性，其他病原阴性。

3.猪细小病毒的分离

用含8％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液将ST细胞制成悬液接种于6孔细胞培养板，按1：10比例加入上述研磨液，300μl/孔，同时设置正常细胞对照，2ml/孔，置于37℃，5％CO

4.猪细小病毒VP2基因组序列测定

(1)猪细小病毒VP2基因组DNA提取

对分离到的病毒进行ST悬浮细胞扩繁培养传代，取200μl猪细小病毒第10代病毒液，用全式金EasyPure Viral DNAKit提取病毒基因组，具体操作如下：

先加入20μl蛋白酶K于1.5mL无菌离心管；在离心管中加入200μl病毒液；再加入200μl BB5(含5.6μg Carrier RNA),涡旋混合15s，56℃孵育15min；加入250μl无水乙醇，涡旋混合15s，室温放置5分钟；将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000rpm离心1min，弃掉流出液；加入500μl WB5，12000rpm离心1min，弃掉流出液；重复加入500μl WB5步骤洗涤一次；室温12000rpm离心1min，彻底去除残留的乙醇；将离心柱转入一个新1.5mL离心管中，并向离心柱中央加40μl水，室温静置1min；室温12000rpm离心1min，洗脱DNA，冻于-80℃备用。

(2)猪细小病毒VP2基因组序列

参考GeneBank上已发表的猪细小病毒VP2基因序列，选择保守区设计2对引物，由北京三博远志生物技术有限公司合成。以上述DNA为模板，扩增VP2基因组序列。

所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，进行35个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化目的条带，然后送至北京铂尚生物技术有限公司测序。各片段经拼接得到猪细小病毒VP2基因组序列，如SEQID No.1所示。

将拼接获得的猪细小病毒VP2基因组核酸序列与现有疫苗株(GenBank序列号:AY583318.1)比对，核苷酸同源性为98.1％，并且有特殊基因变异点；将拼接获得的猪细小病毒VP2基因组推导的氨基酸序列与疫苗株(GenBank序列号:AY583318.1)基因组推导的氨基酸序列比对，发现推导的氨基酸同源性为97.8％，存在5个特殊氨基酸变异点(图2)。因此，确定此毒株为一株新的猪细小病毒。

对分离到的病毒进行ST悬浮细胞扩繁培养传代，继续将猪细小病毒传至第11代，培养24小时后有明显细胞病变，经鉴定阳性后，已扩大培养得到一株猪细小病毒，命名为PPV-ZM2021，于2022年9月15日中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.45271。

将猪细小病毒接种ST贴壁细胞进行培养，24-36小时出现典型的细胞病变，如图1。待细胞病变达到约80％，收获培养物，反复冻融3次，依据Reed&Muench方法测定病毒毒价为10

实施例2猪细小病毒PPV-ZM2021交叉凝集抑制(HI)实验

血凝素：PPV-ZM2021、猪细小病毒病灭活疫苗PPV WH-1株(WH-1株细小病毒病灭活疫苗)生产用毒种制备抗原。

待检测血清：分别接种了PPV-ZM2021、猪细小病毒商品灭活疫苗A(WH-1株批号：B20220202)、猪细小病毒商品灭活疫苗B(S-1株批号：CK2112016)、自制灭活疫苗C(PPV-ZM2021株，称取9g中牧自制的胶状水佐剂，与抗原等体积混合，充分震荡混匀。具体自制方法见实施例4。)、PBS的28天豚鼠血清。

制备4单位HA的两种血凝素，分别与不同稀释度的处理后豚鼠血清进行血凝抑制试验，判定HI效价。

结果显示，同一免疫血清对两种血凝素的HI效价存在明显差异(详见下表1)，由于HI效价与攻毒保护具有正相关性，因此疫苗对两个毒株的攻毒保护效果应存在显著差异。

免疫血清中，自制灭活疫苗C的动物血清HI最高，针对PPV-ZM2021株的HI效价最高、为13～14log2且稳定性好。

表1.猪细小病毒交叉HI试验

实施例3猪细小病毒PPV-ZM2021致病性实验

筛选猪细小病毒病原及抗体阴性40日龄仔猪9头，随机分为3组，每组3头。试验组为鼻腔、肌肉攻毒，每头猪分别鼻腔接种2ml 10

连续观察10天，每日观察猪只状态，测量直肠温度并记录。试验组和对照组体温均在正常范围内波动，观察临床症状，试验组和对照组猪只食欲正常，无腹泻出现，且无猪只死亡，全部存活。以上数据表明，猪细小病毒分离株PPV-ZM2021对仔猪无明显致病性。

于攻毒前(0天)及攻毒后3天、5天、7天、10天采集攻毒组和对照组每头猪血液、双肛拭子，分离血清，PCR检测病毒血症和排毒情况。病毒血症检测结果，见表2。排毒情况检测结果，见表3。数据显示，攻毒猪在3天均出现病毒血症和排毒现象，10天以后均未出现病毒血症和排毒现象。

表2.攻毒前后病毒血症检测结果

表3.攻毒前后粪便排毒情况检测结果

攻毒试验数据表明，本发明分离株PPV-ZM2021感染仔猪后无明显临床症状。

实施例4分离株PPV-ZM2021在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用

1.猪细小病毒灭活疫苗的制备

将PPV-ZM2021分离株按培养体积的百分之一接种于ST细胞进行连续传代，收获病毒液，反复冻融3次后，离心取上清，测定病毒滴度。病毒滴度10

疫苗配置方法：

A组灭活疫苗：称取60g中牧自制的胶状水佐剂，与抗原等体积混合，充分震荡混匀。

B组灭活疫苗：称取60g赛比克公司的201VG，预热至32℃，抗原也预热至32℃，将水相等体积混入201VG，充分震荡混匀。

2.疫苗安全性试验

选取30日龄左右猪细小病毒病原及抗体阴性仔猪12头，随机分为4组，每组3头。试验A组肌肉分点注射2头份(4ml)A组灭活疫苗疫苗，间隔14d二次接种疫苗；对照A组肌肉分点注射等体积无菌PBS溶液，间隔14d二次接种PBS；试验B组肌肉接种2头份(4ml)B组灭活疫苗疫苗，间隔14d二次接种疫苗；对照B组肌肉接种等体积无菌PBS，间隔14d二次接种PBS。连续观察21天。结果显示，与对照组相比，试验A组和B组仔猪精神状态、体温及日增重无明显差异，未出现不良反应。

3.疫苗有效性试验

筛选猪细小病毒病原及抗体阴性断奶仔猪12头，随机分为4组，每组3头。试验A组肌肉注射1头份(2ml)A组灭活疫苗，对照A组肌注等体积无菌PBS溶液；试验B组肌肉注射接种1头份(2ml)B组灭活疫苗，对照B组肌肉注射等体积无菌PBS溶液，连续观察28天，于7天、14天、21天、28天采集血液，分离血清，于56℃灭活30min，测定猪细小病毒中和抗体。28天后再进行二次免疫接种，连续观察14天，于35天、42天采集血液，分离血清，于56℃灭活30min，测定猪细小病毒中和抗体。中和抗体检测结果(如表4所示)显示，由本发明毒株PPV-ZM2021经传代制备的灭活疫苗免疫后42天能产生高水平中和抗体，具有良好的免疫原性，其中，A组产生的中和抗体水平更高，是优选的灭活疫苗配置佐剂。

表4.灭活疫苗免疫后中和抗体检测结果

实施例5分离株PPV-ZM2021在制备间接ELISA检测试剂盒的应用

1.扩繁PPV-ZM2021病毒分离株备用。

用ST细胞扩增PPV-ZM2021病毒。待细胞出现明显病变时，收获病毒于-80℃冻存，反复冻融3次。然后6000r/min离心5min，去除细胞碎片。用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒。用PBS稀释纯化的病毒，并测蛋白浓度。

2.间接ELISA具体步骤。

(1)包被全病毒抗原：以纯化的全病毒作为包被抗原，用倍比稀释抗原和血清，利用方正滴定法确定病毒最佳包被浓度和最佳血清稀释度。病毒最佳包被浓度为2.50ug/ml，病毒最佳包被浓度为1：100。

用包被液稀释已纯化的病毒，以每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜。

(2)弃掉包被液，用PBS洗3次，每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时。弃掉脱脂乳，然后用PBST洗3-5次，每次3-5分钟。

(3)用PBS稀释待检血清，然后每孔加100μL，37℃孵育1小时，同时设阴、阳性血清对照。弃掉液体，用PBST洗3-5次，每次3-5分钟。

(4)确定二抗最佳条件：二抗最佳稀释度为1：10000，最佳孵育时间为45分钟。

加入稀释好的辣根过氧化酶标记的抗猪IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育1小时。弃掉二抗，用PBST洗3-5次，每次3-5分钟。

(5)每孔加入100μL TMB显色液，避光显色15分钟。

(6)每孔加入50μL终止液2M H

阴、阳性血清对照结果成立。随机检测15份猪血清。

同时用中和试验同步检测，具体方法如下：

将待检血清于56℃灭活30分钟。将被检血清从1：4稀释至1：64，每个稀释度作3个重复，每孔加50uL，设阳性对照、阴性对照。将稀释好每50uL中100TCID

3.猪血清抗体检测结果如表5所示。

4.结论：用间接ELISA试剂盒检测猪血清抗体结果和用中和试验同步检测结果一致，说明间接ELISA试剂盒检测猪血清抗体的方法成立。

表5.用间接ELISA试剂盒检测猪血清抗体结果

备注：“+”代表阳性；“-”代表阴性。

虽然，上文中用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。