GmTIFY10e蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及GmTIFY10e蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及大豆品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

低温、干旱、土壤盐渍化是影响农业生产的严重问题。在有关植物抗逆境的众多研究中，科学家也克隆了许多不同来源的与抗逆境相关的功能基因并把它们转化到植物体中，但所取得的效果并不理想。植物的抗逆性状是多基因控制的复杂性状。植物对干旱、高盐及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。进一步对处于信号传导途径中的蛋白调节因子在植物多种信号途径相互作用中的调控机制进行研究，对深入理解植物的生物胁迫和非生物胁迫应答过程具有重要意义。因此，利用一个关键性蛋白调节因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了GmTIFY10e蛋白质的新用途。

本发明提供了GmTIFY10e蛋白质在调控植物耐逆性中的应用；

所述GmTIFY10e蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

d)与a)-c)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

上述蛋白质中，所述标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪或纯化。具体可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具体可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与上述GmTIFY10e蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与上述GmTIFY10e蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

所述生物材料为下述C1)至C10)中的任一种：

C1)编码GmTIFY10e蛋白质的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；

C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；

C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组载体的转基因植株；

C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；

C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体。

上述应用中，C1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)序列2所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmTIFY10e蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmTIFY10e蛋白质的DNA分子。

上述C1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述C2)所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达GmTIFY10e蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmTIFY10e基因转录的启动子，还可包括终止GmTIFY10e基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

C3)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码GmTIFY10e蛋白质的DNA分子。使用GmTIFY10e蛋白质的编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用GmTIFY10e蛋白质的编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

在本发明的一个具体实施例中，所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点插入序列表中序列2所示的DNA片段后得到的载体。

在本发明的另一个具体实施例中，所述重组表达载体具体可为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的载体。

C4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌GV3101。

C7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

C9)所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

C5)、C6)和C7)所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述GmTIFY10e蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物或植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述育种的目的是选育耐逆性高的植物。

上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性，具体体现为：当GmTIFY10e蛋白质在植物中的活性和/或含量提高时，所述植物耐逆性增加；当GmTIFY10e蛋白在植物中的活性和/或含量降低或缺失时，所述植物耐逆性降低。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了b1或b2所示的物质在降低植物耐逆性或培育耐逆性降低的转基因植物或植物育种中的应用：

b1、抑制或降低植物中GmTIFY10e蛋白质活性和/或含量的物质；

b2、抑制或降低植物中GmTIFY10e蛋白质编码基因表达的物质或敲除植物中GmTIFY10蛋白质编码基因的物质。

进一步的，所述抑制或降低植物中GmTIFY10e蛋白质活性和/或含量的物质可为任何能够使植物中上述GmTIFY10e蛋白质活性和/或含量降低或缺失的物质，如抑制上述GmTIFY10e蛋白质合成或促进上述GmTIFY10e蛋白质降解或抑制上述GmTIFY10e蛋白质功能的蛋白质、多肽或小分子化合物(如蛋白活性抑制剂)。

所述抑制或降低植物中GmTIFY10e蛋白质编码基因表达的物质可为任何能够使植物中编码上述GmTIFY10e蛋白质的基因无法表达的物质，如沉默植物中上述GmTIFY10e蛋白质编码基因的物质，如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等。更进一步的，所述抑制或降低植物中GmTIFY10e蛋白质编码基因表达的物质可为抑制植物中GmTIFY10e基因表达的载体。在本发明的具体实施例中，所述抑制植物中GmTIFY10e基因表达的载体为含有序列3所示DNA分子的载体。

所述敲除植物中GmTIFY10e蛋白质编码基因的物质可以是以任何方式实现宿主细胞不产生GmTIFY10e基因的功能性蛋白质产物的物质，具体方式如去除全部或部分编码基因序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质、去除或改变调节组分(例如启动子编辑)使得基因序列不被转录等。通常，敲除在基因组DNA水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中上述GmTIFY10蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

进一步的，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现为如下M1)-M6)任一种：

(M1)在盐胁迫下，转基因植物的根长长于受体植物；

(M2)在盐胁迫下，转基因植物的植株鲜重大于受体植物；

(M3)在盐胁迫下，转基因植物的脯氨酸含量高于受体植物；

(M4)在盐胁迫下，转基因植物的CAT含量高于受体植物；

(M5)在盐胁迫下，转基因植物的POD含量高于受体植物；

(M6)在盐胁迫下，转基因植物的丙二醛含量低于受体植物。

所述提高受体植物中GmTIFY10e蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GmTIFY10e蛋白质。

所述过表达的方法为将GmTIFY10e蛋白质的编码基因导入受体植物。

更进一步的，所述GmTIFY10e蛋白质的编码基因通过重组表达载体导入受体植物中。所述GmTIFY10e蛋白质的编码基因为序列2所示的DNA分子。在本发明的一个具体实施例中，所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点插入序列表中序列2所示的DNA片段后得到的载体。在本发明的另一个具体实施例中，所述重组表达载体具体可为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BsTEII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA片段后得到的载体。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中GmTIFY10e蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物。

进一步的，所述降低受体植物中GmTIFY10e蛋白质的含量和/或活性的方法是通过对所述受体植物中GmTIFY10e蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默表达来实现。

再进一步的，抑制受体植物中GmTIFY10e蛋白质的编码基因表达的方法为在受体植物中导入抑制受体植物中GmTIFY10e蛋白质的编码基因表达的载体。

更进一步的，所述抑制受体植物中GmTIFY10e蛋白质的编码基因表达的载体为含有序列3所示的DNA分子的载体。

在本发明的一个具体实施例中，所述含有序列3所示的DNA分子的载体具体为将pCAMBIA3301载体的NcoI和BstEII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子后得到的载体。

在上述方法中，所述导入具体可为通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

上述任一所述应用或方法中，所述耐逆性为耐盐性。

所述植物为(X1)或(X2)或(X3)：

(X1)双子叶植物或单子叶植物；

(X2)豆科植物或十字花科植物；

(X3)大豆或拟南芥。

所述拟南芥具体可为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)。

所述大豆具体可为大豆中黄39。

实验表明，本发明的GmTIFY10e可以提高植物的耐盐性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物品种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为GmTIFY10e受胁迫诱导表达的荧光实时定量(Real-time)PCR图谱。

图2为125mM NaCl处理7天后的野生型和转基因拟南芥耐盐性检测结果。A：盐胁迫处理对照与125mM NaCl处理7天后的野生型与转基因拟南芥植株表型；B：盐胁迫处理对照和125mM NaCl处理后拟南芥主根长检测结果；C：盐胁迫处理对照和125mM NaCl处理后拟南芥鲜重检测结果。其中，OE-1、OE-2和OE-3分别为转GmTIFY10e基因拟南芥株系GmTIFY10e-1、转GmTIFY10e基因拟南芥株系GmTIFY10e-2和转GmTIFY10e基因拟南芥株系GmTIFY10e-3。*表示与WT相比差异达到显著水平(p<0.5)，**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图3为250mM NaCl处理7天后的野生型和转基因拟南芥耐盐性检测结果。A：盐胁迫处理对照与250mM NaCl处理14天后的野生型与转基因拟南芥植株表型；B：盐胁迫处理对照和250mM NaCl处理后丙二醛含量测定结果；C：盐胁迫处理对照和250mM NaCl处理后CAT含量测定结果；D：盐胁迫处理对照和250mM NaCl处理后POD含量测定结果；E：盐胁迫处理对照和250mM NaCl处理后脯氨酸含量测定结果。其中，OE-1、OE-2和OE-3分别为转GmTIFY10e基因拟南芥株系GmTIFY10e-1、转GmTIFY10e基因拟南芥株系GmTIFY10e-2和转GmTIFY10e基因拟南芥株系GmTIFY10e-3。*表示与WT相比差异达到显著水平(p<0.5)，**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图4为侵染不同菌株大豆毛状根的耐盐性检测结果。A：盐胁迫处理对照及250mMNaCl处理7天后的大豆植株表型；B：盐处理后毛状根的硝基蓝四氮唑(NBT)染色结果；C：盐胁迫处理对照和盐处理后毛状根中丙二醛含量测定结果；D：盐胁迫处理对照和盐处理后毛状根中脯氨酸含量测定结果；E：盐胁迫处理对照和盐处理后毛状根中CAT含量测定结果；F：盐胁迫处理对照和盐处理后毛状根中POD含量测定结果。其中，GmTIFY10e-RNAi、EV和GmTIFY10e-OE分别为侵染K599-GmTIFY10e-RNAi的大豆植株、侵染K599-pCAMBIA3301的大豆植株和侵染K599-35S：GmTIFY10e的大豆植株。

图5为侵染不同菌株大豆叶片的耐盐性检测结果。A：盐处理前后叶片的硝基蓝四氮唑(NBT)染色结果；B：盐胁迫处理对照和盐处理后叶片中丙二醛含量测定结果；C：盐胁迫处理对照和盐处理后叶片中CAT含量测定结果；D：盐胁迫处理对照和盐处理后叶片中POD含量测定结果；E：盐胁迫处理对照和盐处理后叶片中脯氨酸含量测定结果。其中，GmTIFY10e-RNAi、EV和GmTIFY10e-OE分别为侵染K599-GmTIFY10e-RNAi的大豆植株、侵染K599-pCAMBIA3301的大豆植株和侵染K599-35S：GmTIFY10e的大豆植株。

图6为侵染不同菌株大豆的表达量检测结果。其中，GmTIFY10e-RNAi、EV和GmTIFY10e-OE分别为侵染K599-GmTIFY10e-RNAi的大豆植株、侵染K599-pCAMBIA3301的大豆植株和侵染K599-35S：GmTIFY10e的大豆植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。

下述实施例中的pCAMBIA3301载体、发根农杆菌K599和大豆中黄39均由中国农业科学院作物科学研究所张辉研究员提供，均记载于文献“Sun et al.，Targetedmutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system，Scientific Reports，2015.5.29(DOi:10.1038/srep10342)”中，经张辉研究员同意后公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、实时荧光定量PCR分析GmTIFY10e的表达特性

一、胁迫处理

取室温生长20d左右的大豆中黄39幼苗进行以下处理：

(1)干旱处理(图1中A)：用300mM的甘露醇处理盆栽的大豆幼苗模拟干旱，分别在干旱处理0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)高盐处理(图1中B)：用250mM的NaCl水溶液处理盆栽的大豆幼苗模拟高盐，分别在高盐处理0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后取样，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)对照处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、RNA提取

采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA。

三、反转录为cDNA

将纯化的mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

将cDNA稀释50倍后用作qRT-PCR的模板。用GmTIFY10e基因的特异引物对(引物序列为GmTIFY10e-qRTF：AACATGGGAAATTCCAGTGTTG；GmTIFY10e-qRTR：GGCACTGGTTGGAATGATATTC)对样品进行qRT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin基因作为内参，actin基因的特异引物对序列为RT-GmELFbF：GTTGAAAAGCCAGGGGACA和RT-GmELF1bR：TCTTACCCCTTGAGCGTGG。qRT-PCR在

ΔΔC

Timex表示任意时间点，Time

结果见图1。结果显示，高盐处理均可使GmTIFY10e基因的表达升高。

实施例2、GmTIFY10e基因及其编码的蛋白质在提高拟南芥耐盐性中的应用

本实施例提供了一种来源于大豆品种中黄39(中国农业科学院作物科学研究所)的基因，其名称为GmTIFY10e基因，其cDNA序列为序列表中序列2，开放阅读框架为序列表中序列2自5′端起第1至588位，编码序列表中序列1所示的GmTIFY10e蛋白质。GmTIFY10e基因及其编码的蛋白质可以提高植物耐盐性，具体检测步骤如下：

一、重组表达载体的构建

1、GmTIFY10e基因的克隆

根据GmTIFY10e基因的序列设计引物对(GmTIFY10e-1302F和GmTIFY10e-1302R)，引物分别引入NcoI酶切识别位点，然后以中黄39大豆cDNA为模板PCR扩增GmTIFY10e基因，得到PCR产物。

GmTIFY10e-1302F：5'-GGGACTCTTGACCATGATGAATCCATGGAAC-3'；

GmTIFY10e-1302R：5'-TCAGATCTACCCATGGCTAAAATAACACAAA-3'。

PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小约为600bp。

2、重组表达载体的构建

①用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，货号为DV807A)纯化回收步骤1获得的PCR产物。

②用限制性内切酶NcoI酶切pCAMBIA1302载体(Clontech公司)，回收载体骨架。

③将步骤①的纯化回收产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，并将序列正确的重组质粒命名为重组载体pCAMBIA1302-GmTIFY10e。

重组载体pCAMBIA1302-GmTIFY10e为在pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点插入序列表中序列2所示的DNA分子后得到的载体。pCAMBIA1302-GmTIFY10e能表达GmTIFY10e蛋白质。

二、转基因植物的获得

1、将步骤一得到的重组载体pCAMBIA1302-GmTIFY10e导入农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌C58C1-pCAMBIA1302-GmTIFY10e。

2、将重组农杆菌C58C1-pCAMBIA1302-GmTIFY10e接种于含50mg/ml利福平和100mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时。

3、将步骤2获得的菌液转至含50mg/ml利福平和100mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中进行扩大培养，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD

4、步骤3完成后收集菌体，4℃、4000g离心10min，用转化液(该转化液为向MS液体培养基中添加蔗糖和silwet得到的，蔗糖和silwet质量百分比浓度分别为10％和0.02％)重悬菌体，得到菌体悬液，菌体悬液的OD

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌体悬液的容器中，使花序在菌体悬液中浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T

T

按照上述步骤2-5的方法，将pCAMBIA1302-GmTIFY10e替换为pCAMBIA1302，其他步骤均不变，得到转空载体植株。

三、转基因植物的耐盐性鉴定

分别将T

将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，培养4天后，将植株转移至新的MS培养基和含125mM NaCl的MS培养基中，5天后测量转GmTIFY10e基因拟南芥植株和WT植株的主根长及植株的鲜重。

将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，于萌发10天后移至营养土：蛭石为1:1小盆中，待长至3周后，用250mM NaCl水溶液进行盐处理两周，盐处理具体方法为：待长至3周后，将栽培盆放入含有约2L的250mM NaCl水溶液底盆中(和浇水的方式一样，浇水时把水倒入底盆中，然后把栽培小盆放入其中，让其自然渗吸)，两周后统计存活率。同时设置以不添加NaCl的水溶液替代250mM NaCl水溶液的对照组(Control)。盐处理两周后分别检测转GmTIFY10e基因拟南芥植株叶片中的CAT含量、POD含量、脯氨酸含量和丙二醛含量。

CAT含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司的过氧化氢酶(CAT)含量测试盒(Comin公司，货号为CAT-2-Y)进行CAT含量测定。具体步骤如下：称取0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

POD含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司的过氧化物酶(POD)含量测试盒(Comin公司，货号为POD-2-Y)进行POD含量测定。具体步骤如下：称取0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

脯氨酸含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司的脯氨酸(PRO)含量测试盒(Comin公司，货号为PRO-2-Y)进行脯氨酸含量测定。具体步骤如下：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；之后置90℃振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。取0.5mL样本+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min，每10min振荡一次。待冷却后，在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值A，并计算脯氨酸含量。

丙二醛含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司的丙二醛(MDA)测试盒(Comin公司，货号为MDA-2-Y)进行MDA含量测定。具体步骤如下：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2mL样本，混匀。95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，10000g，25℃，离心10min。吸取上清液于200ul玻璃比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为A532和A600并计算MDA含量。

结果见图2和图3。结果显示，在盐处理后，野生型拟南芥Col-0植株叶片萎蔫、变黄，但转GmTIFY10e基因拟南芥植株仍能正常生长，且转GmTIFY10e基因拟南芥植株的主根长、植株鲜重、脯氨酸、CAT和POD含量均高于野生型拟南芥Col-0，丙二醛含量低于野生型拟南芥Col-0。说明转GmTIFY10e基因拟南芥植株具有耐盐性，GmTIFY10e基因及其所编码的蛋白质可以用来提高拟南芥的耐盐性。

按照上述方法，鉴定转空载体对照植株的耐盐性，结果显示，空载体对照植株表型与野生型拟南芥拟南芥Col-0无明显区别，且其主根长、植株鲜重、CAT含量、POD含量、脯氨酸含量、丙二醛含量也与野生型拟南芥Col-0无显著差异。

实施例3、GmTIFY10e基因及其编码的蛋白质在提高大豆耐盐性中的应用

一、GmTIFY10e过表达载体的构建

1、根据大豆GmTIFY10e cDNA序列和pCAMBIA3301载体中NcoI、BstEII酶切位点两侧序列与同源重组要求[正向引物与载体左臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段正向序列(20-25nt左右)，反向引物与载体右臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段反向序列(20-25nt左右)]设计引物序列如下：

GmTIFY10e-3301-T-F：5'-GGACTCTTGACCATGATGAATCCATGGAAC-3'；

GmTIFY10e-3301-T-R：5'-ATTCGAGCTGGTCACCCTAAAATAACACAAA-3'。

2、以中黄39大豆cDNA模板，使用北京全式金生物技术有限公司的

3、将步骤2得到的PCR产物经琼脂糖电泳检测后，纯化回收PCR产物。

4、用NcoI与BstEII酶切pCAMBIA3301载体，回收载体骨架。

5、用北京全式金生物技术有限公司的Quick-Fusion Clong Kit将步骤3回收的PCR产物克隆到pCAMBIA3301载体中，并将序列正确的重组载体命名为35S：GmTIFY10e。

重组载体35S：GmTIFY10e为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BstEII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子后得到的载体。该重组载体35S：GmTIFY10e能表达GmTIFY10e蛋白质，其中，GmTIFY10e基因的表达由35S强启动子启动，由NOS强终止子终止。

二、GmTIFY10e干扰载体的构建

1、委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司人工合成序列表中序列3所示的DNA片段，该片段依次包括NcoI酶切位点、序列2第259-450位所示的核苷酸序列、玉米alcoholdehydrogenase(Adh)基因序列(作为内含子)、序列2第259-450位所示核苷酸序列的反向互补序列、BstEII酶切位点。

2、用NcoI酶和BstEII酶对pCAMBIA3301载体进行酶切，回收载体骨架。

3、将步骤1中的DNA片段和步骤2回收的载体骨架用Infusion重组酶在50℃条件下反应20min，得到连接产物。

4、将步骤3得到的连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆摇菌，用通用引物M13F(GTAAAACGACGGCCAG)和M13R(CAGGAAACAGCTATGAC)检测菌液，之后用M13F测序验证，并将序列正确的重组载体命名为GmTIFY10e-RNAi。

重组载体GmTIFY10e-RNAi为将pCAMBIA3301载体的NcoI和BstEII的酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子后得到的载体。

三、大豆毛状根的转化

分别将重组载体35S：GmTIFY10e、重组载体GmTIFY10e-RNAi和载体pCAMBIA3301导入发根农杆菌K599中，分别得到重组菌K599-35S：GmTIFY10e、重组菌K599-GmTIFY10e-RNAi和重组菌K599-pCAMBIA3301，并将其分别转化大豆毛状根。具体步骤如下：

1、将大豆中黄39种子播于混合土(营养土：蛭石＝1：1)中，播种深度为1-2cm。置于温室，白天28℃/晚上20℃，每天浇水。

2、用注射器分别挑取重组菌K599-35S：GmTIFY10e、K599-GmTIFY10e-RNAi和K599-pCAMBIA3301侵染6天大子叶尚未展开的大豆幼苗的子叶节。

3、侵染完用塑料盒盖上。

4、待长出毛状根后，用蛭石将大豆子叶节侵染位点及其以下部分埋住，浇水浇透。28℃，14h光照/10h黑暗，白天28℃/晚上20℃，培养30天，每两天浇一次水，保持侵染部分的潮湿环境。

5、30天后，当毛状根长到5-10cm时，将主根减去(此时毛状根用于GmTIFY10e基因表达量检测)，得到的植株称为复合体植株，将复合体植株埋入混合土(营养土：蛭石＝1：1)中，每三天浇一次水。

各植株GmTIFY10e基因表达量检测结果显示，侵染了K599-35S：GmTIFY10e的大豆毛状根中GmTIFY10e基因的表达量显著高于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根，侵染了K599-GmTIFY10e-RNAi的大豆毛状根中GmTIFY10e基因的表达量显著低于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根(图6)。

四、耐逆性分析

复合体植株培育45天后，待毛状根恢复到足够健康时进行盐处理。具体方法如下：用250mM NaCl水溶液处理大豆幼苗模拟高盐胁迫，在盐处理7天后取样，按照实施例2中的方法测定各转基因植株毛状根与叶片中的CAT、POD、脯氨酸和丙二醛含量，并对毛状根和叶片进行硝基蓝四氮唑(NBT)染色。同时设置以不添加NaCl的水溶液替代250mM NaCl水溶液的对照组。

NBT染色方法具体如下：选取盐处理7天的大豆幼苗上大小相近的叶片，染色液按照NBT底物染色试剂盒说明进行配制，此时将选取的毛状根或叶片浸入NBT染色液中12h，接下来将染色的毛状根或叶片完全浸入甘油、100％酒精混合液(3:7)，95℃水浴30min，每10min上下颠倒一次脱色液，以便毛状根或叶片脱色完全。最后将脱色完全的毛状根或叶片进行拍照记录，每个处理重复三次实验。

结果见图4和图5。结果显示，与侵染K599-pCAMBIA3301的大豆相比，侵染K599-35S：GmTIFY10e的大豆表现出了更强的耐盐性，而侵染K599-GmTIFY10e-RNAi的大豆则表现出了更弱的耐盐性。说明GmTIFY10e基因及其所编码的蛋白质可以用来提高大豆的耐盐性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> GmTIFY10e蛋白及其编码基因在调控植物耐盐性中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 195

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Asn Pro Trp Asn Met Arg Thr Ser Lys Leu Leu Ser Gln Gln Val

1               5                   10                  15

Ser Tyr Pro Pro Tyr Leu Phe Val Glu Glu Ile Pro Asn Met Gly Asn

            20                  25                  30

Ser Ser Val Val Thr Lys Asp Ala Arg Gly Ser Gln Leu Thr Ile Phe

        35                  40                  45

Tyr Gly Gly Gln Val Leu Val Phe Asp Asp Ile Gln Ala Lys Lys Ala

    50                  55                  60

Lys Asp Ile Leu Ser Phe Ala Gly Lys Gly Met Ser Gln Asn Gln Asn

65                  70                  75                  80

Asp Tyr Ala Asn Thr Phe Pro Ala Thr Thr Ser Ala Asn Pro Thr Arg

                85                  90                  95

Pro Phe Pro Phe Leu Met Asn Ile Ile Pro Thr Ser Ala Asn Asn Ser

            100                 105                 110

Val Gln Asp His Pro Gln Ala Pro Ser Lys Pro Val Ile Cys Asp Leu

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Arg Lys Ala Ser Leu His Arg Phe Leu Glu Lys Arg Lys

    130                 135                 140

Asp Arg Ile Ala Ala Arg Ala Pro Tyr Gln Thr Ser Asn His Met Ala

145                 150                 155                 160

Ala Leu Asn Lys Pro Ala Glu Ser Met Thr Trp Leu Thr Leu Ala Pro

                165                 170                 175

Lys Ser Pro Gln Gln Asp Glu Ser Asp Ser Asp Ser Ser Ser Ser Phe

            180                 185                 190

Val Leu Phe

        195

<210> 2

<211> 588

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgaatccat ggaacatgag aacttccaag ttactctctc aacaagtttc ttatcctcct 60

tatctctttg tagaagagat tccaaacatg ggaaattcca gtgttgtgac caaggatgct 120

agaggttcac agctgacaat cttctatggt ggccaagttc ttgtcttcga tgatattcaa 180

gctaaaaaag ccaaggacat cttgtctttt gccggcaagg gaatgtctca aaaccagaac 240

gattatgcta acactttccc tgctacaact tctgctaatc ccactagacc atttcctttt 300

cttatgaata tcattccaac cagtgccaac aattcggttc aagaccaccc tcaagcacca 360

tccaaacctg ttatttgtga tctaccattg gctaggaaag cttcacttca tcggttcttg 420

gagaaaagaa aggatagaat tgctgccaga gcaccatatc aaacaagcaa tcacatggca 480

gcccttaata agccagctga atccatgaca tggctcacct tggcacctaa atcaccacaa 540

caagacgaat ctgattccga tagcagctcc agctttgtgt tattttag 588

<210> 3

<211> 550

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

catgccatgg ctgctacaac ttctgctaat cccactagac catttccttt tcttatgaat 60

atcattccaa ccagtgccaa caattcggtt caagaccacc ctcaagcacc atccaaacct 120

gttatttgtg atctaccatt ggctaggaaa gcttcacttc atcggttctt ggagaaaaga 180

aaggatagaa ttgctgccag agcacgatcc gatcgaaaaa cgggagtctg cccctaagac 240

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