检测小鼠11条神经细胞死亡通路试剂盒及非疾病诊断为目的的荧光定量PCR方法

技术领域

本发明属于一种试剂盒及检测方法，特别涉及一种检测小鼠11条神经细胞死亡通路试剂盒及非疾病诊断为目的的荧光定量PCR方法。

背景技术

细胞死亡是一个规律的，处于动态平衡的调控过程，在维持组织、器官形态与功能中起至关重要的作用。绝大部分细胞会定期执行死亡调控过程以进行自我更新，保持组织器官的正常功能。神经细胞的死亡调控紊乱将会引发神经细胞过度的死亡及神经传导支配功能受损，这也是导致各类急、慢性神经退行性病变的主要原因。例如在中枢神经系统中，视神经的创伤性损伤会导致视网膜神经节细胞死亡和轴突丢失，最后造成不可逆视力损害和失明，且目前临床尚无有效治疗方法。

目前发现有11种神经细胞死亡途径，包括：细胞凋亡、程序性坏死、依赖性细胞死亡、铁死亡、铜死亡、细胞焦亡、溶解性死亡、线粒体膜通透性改变的死亡、自噬性死亡、吞噬性死亡和SARM1相关死亡。神经细胞信号传递通路复杂、传导通路长，神经细胞死亡机制复杂，逐一了解其标志物和机制将花费大量时间和金钱，并且单一抑制某一条死亡通路并不能抑制神经细胞死亡。因此需要系统地探索神经系统疾病中细胞死亡的模式，以寻找更准确的治疗靶点，减少神经细胞的死亡，为治疗神经系统疾病提供有效方法。但目前的检测办法多是针对某条单一的神经细胞死亡通路而进行，缺乏更全面且便捷的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测小鼠11条神经细胞死亡通路试剂盒及非疾病诊断为目的的荧光定量PCR方法，有助于科研人员快速了解神经系统疾病或疾病模型中神经细胞死亡的模式。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测小鼠11条神经细胞死亡通路试剂盒，包括：

(1)试剂盒组份：

包括11组引物组：

所述引物组的核苷酸序列如下：

Bax F：GAACCATCATGGGCTGGACA

R：GTGAGGACTCCAGCCACAAA

Casp8 F：GAGTACAGTTCTGGGGAGCG

R：ACTGCCCAGTTCTTCAGCAA

Nlrp3 F：GCCTCACTGAACTGGACCTC

R：GAGGAGATGTCGAAGCAGCA

PycardF：TGAGCAGCTGCAAACGACTA

R：CTGGTCCACAAAGTGTCCTGT

Atg5 F：AGCTCTTCCTTGGAACATCACA

R：TTCTGCAGTCCCATCCAGAG

Map1lc3b F：GCGGACTGAGACACACACAA

R：ATGAGCCGGACATCTTCCAC

Gas6 F：AGGTCTGCCACAACAAACCA

R：CGCAGAGGCAAGAGTAGGAG

P2ry6 F：CCAGTTCTCATGGCTTGCAG

R：GGGAAGCACTGACGTCCTC

Gpx4 F：CCGTCTGAGCCGCTTACTT

R：ATGCACACGAAACCCCTGTA

Acsl4 F：GCAGCACCTTCGACTCAGA

R：TCGAAGTGTGTGACAGAGCG

Sarm1 F：CTCTTGCAGCCAGAGAAATGC

R：ACGTCGATGAAGACGCTGAA

Ppif F：CACCAACCACAATGGCACAG

R：TGCTTGCCATCTAGCCAGTC

Ctsc F：GGATACTGCCTACGACGAGC

R：CATCATGGACCCACCCAGTC

Ripk1 F：GAACTCCGACCGGTCCTC

R：ACACACCACTTTTGGTTCTTGC

Ripk3 F：TGTTCCCTTTGCAGACCCTG

R：GACGCACCAGTAGGCCATAA

Mlkl F：GGAGGAAGCAGGAGAATCCC

R：ACACGGTTTCCTAGACGCTG

Fdx1 F：AACGTTGGCTTGCTCTACTTG

R：GTCCATAGCCTTGGTCAGACA

Mtf1 F：GAAGCGGAAGTGACGCTAGG

R：GTCGTCTGGACTGTGTTCCC

Lias F：TGCATAATGGACCAGACCTTCAA

R：TGTCTTTAGCCATGGAGGTAGTC

Actb F：GCTCCGGCATGTGCAAAG

R：CCCACCATCACACCCTGG

所述11组引物的正向引物和负向引物浓度各为10μM，体积各为0.5mL；引物复合物：包括正向引物和负向引物，浓度各为10μM，体积各为0.5mL；

(2)阴性对照：ddH

所述2X Reaction buffer反应缓冲液包括：

MgCl

Tris-HCl，100mM

KCl，100mM。

所述荧光染料为SYBR green染料。

一种非疾病诊断为目的的检测小鼠11条神经细胞死亡通路的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

S1.提取待测样品cDNA；

S2.以步骤s1 cDNA为模板进行qPCR反应；

s3.小鼠神经细胞死亡通路判定。

所述qPCR反应的程序包括：95℃预变性2分钟，接着95℃变性5秒，60℃退火延伸，循环40次，扩增循环结束后，加热升温至95℃变性DNA产物。

所述qPCR反应的体系包括：2U Taq DNA聚合酶1μL，2X Reaction buffer 5μL，10mM dNTP 1μL，正向引物和反向引物各0.2μL，ddH

本发明的优点：

1、通过同时且纵向对11条神经细胞死亡通路的检测，我们明确了视神经损伤后视网膜神经节细胞的死亡模式，有助于针对激活的通路及靶点后续展开更深入的研究，减少视神经损伤后视网膜神经节细胞的死亡，并且在神经系统疾病动物模型中证实了同时对11条神经细胞死亡通路进行检测的可行性。

2、本试剂盒可以同时对11条神经细胞死亡途径的标志物表达水平进行检测，系统而快速地评估11条神经细胞死亡通路的激活情况，极大节约了研究时间和成本，更有助于科研人员全面了解神经系统疾病或疾病模型中神经细胞的死亡模式，从而可以高效地寻找更准确治疗靶点和治疗方法。

附图说明

图1是Ct值和荧光扩增曲线图。

图2是小鼠视神经损伤后14天内，视网膜中细胞自噬标记物Atg7表达水平的变化情况。

图3是小鼠视神经损伤后14天内，视网膜中细胞自噬标记物Becn1表达水平的变化情况。

图4是小鼠视神经损伤后14天内，视网膜中细胞焦亡标记物N/rp3表达水平的变化情况

图5是小鼠视神经损伤后14天内，视网膜中铁死亡标记物Gpx4表达水平的变化情况。

图6是小鼠视神经损伤后14天内，视网膜中SARM1相关死亡标记物Sarm1表达水平的变化情况。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是，本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不旨在限制本发明的保护范围。

用于下列实施例中表示试剂均为市售品，其英文缩写如下。

2U Taq DNA：聚合酶；

2X Reaction buffer：反应缓冲液；

dNTP：脱氧核苷三磷酸；

SYBR Green：染料。

实施例1：一种用于检测小鼠11条神经细胞死亡通路的试剂盒，包含：

(1)试剂盒组份：

包括11组引物组：所述引物组的核苷酸序列如下：

Bax F：GAACCATCATGGGCTGGACA

R：GTGAGGACTCCAGCCACAAA

Casp8 F：GAGTACAGTTCTGGGGAGCG

R：ACTGCCCAGTTCTTCAGCAA

Nlrp3 F：GCCTCACTGAACTGGACCTC

R：GAGGAGATGTCGAAGCAGCA

PycardF：TGAGCAGCTGCAAACGACTA

R：CTGGTCCACAAAGTGTCCTGT

Atg5 F：AGCTCTTCCTTGGAACATCACA

R：TTCTGCAGTCCCATCCAGAG

Map1lc3b F：GCGGACTGAGACACACACAA

R：ATGAGCCGGACATCTTCCAC

Gas6 F：AGGTCTGCCACAACAAACCA

R：CGCAGAGGCAAGAGTAGGAG

P2ry6 F：CCAGTTCTCATGGCTTGCAG

R：GGGAAGCACTGACGTCCTC

Gpx4 F：CCGTCTGAGCCGCTTACTT

R：ATGCACACGAAACCCCTGTA

Acsl4 F：GCAGCACCTTCGACTCAGA

R：TCGAAGTGTGTGACAGAGCG

Sarm1 F：CTCTGCAGCCAGAGAAATGC

R：ACGTCGATGAAGACG CTGAA

Ppif F：CACCAACCACAATGGCACAG

R：TGCTTGCCATCTAGCCAGTC

Ctsc F：GGATACTGCCTACGACGAGC

R：CATCATG GACCCACCCAGTC

Ripk1 F：GAACTCCGACCGGTCCTC

R：ACACACCACTTTTGGTTCTTGC

Ripk3 F：TGTTCCCTTTGCAGACCCTG

R：GACGCACCAGTAGGCCATAA

Mlkl F：GGAGGAAGCAGGAGAATCCC

R：ACACGGTTTCCTAGACGCTG

Fdx1 F：AACGTTGGCTTGCTCTACTTG

R：GTCCATAGCCTTGGTCAGACA

Mtf1 F：GAAGCGGAAGTGACGCTAGG

R：GTCGTCTGGACTGTGTTCCC

Lias F：TGCATAATGGACCAGACCTTCAA

R：TGTCTTTAGCCATGGAGGTAGTC

Actb F：GCTCCGGCATGTGCAAAG

R：CCCACCATCACACCCTGG

所述11组引物的正向引物和负向引物浓度各为10μM，体积各为0.5mL；

引物复合物：包括正向引物和负向引物，浓度各为10μM，体积各为0.5mL；

所述2X Reaction buffer反应缓冲液的组分：

MgCl

Tris-HCl，100mM

KCl，100mM

(2)阴性对照：ddH

实施例2：一种非疾病诊断为目的的检测小鼠11条神经细胞死亡通路的荧光PCR方法，包括以下步骤：

S1：配制待测样本和阴性对照的试剂盒反应体系，

待测样本反应体系总共10μL，依次加入2U Taq DNA聚合酶1μL，2X Reactionbuffer 5μL，10mM dNTP 1μL，正向引物和反向引物各0.2μL，ddH

阴性对照反应体系总共10μL，包含2UTaq DNA聚合酶1μL，2X Reaction buffer 5μL，10mM dNTP 1μL，正向引物和反向引物各0.2μL，ddH

S2：各引物碱基序列如下：

Bax F：GAACCATCATGGGCTGGACA

R：GTGAGGACTCCAGCCACAAA

Casp8 F：GAGTACAGTTCTGGGGAGCG

R：ACTGCCCAGTTCTTCAGCAA

Nlrp3 F：GCCTCACTGAACTGGACCTC

R：GAGGAGATGTCGAAGCAGCA

PycardF：TGAGCAGCTGCAAACGACTA

R：CTGGTCCACAAAGTGTCCTGT

Atg5 F：AGCTCTTCCTTGGAACATCACA

R：TTCTGCAGTCCCATCCAGAG

Map1lc3b F：GCGGACTGAGACACACACAA

R：ATGAGCCGGACATCTTCCAC

Gas6 F：AGGTCTGCCACAACAAACCA

R：CGCAGAGGCAAGAGTAGGAG

P2ry6 F：CCAGTTCTCATGGCTTGCAG

R：GGGAAGCACTGACGTCCTC

Gpx4 F：CCGTCTGAGCCGCTTACTT

R：ATGCACACGAAACCCCTGTA

Acsl4 F：GCAGCACCTTCGACTCAGA

R：TCGAAGTGTGTGACAGAGCG

Sarm1F：CTCTGCAGCCAGAGAAATGC

R：ACGTCGATGAAGACGCTGAA

Ppif F：CACCAACCACAATGGCACAG

R：TGCTTGCCATCTAGCCAGTC

Ctsc F：GGATACTGCCTACGACGAGC

R：CATCATGGACCCACCCAGTC

Ripk1 F：GAACTCCGACCGGTCCTC

R：ACACACCACTTTTGGTTCTTGC

Ripk3 F：TGTTCCCTTTGCAGACCCTG

R：GACGCACCAGTAGGCCATAA

Mlkl F：GGAGGAAGCAGGAGAATCCC

R：ACACGGTTTCCTAGACGCTG

Fdx1 F：AACGTTGGCTTGCTCTACTTG

R：GTCCATAGCCTTGGTCAGACA

Mtf1 F：GAAGCGGAAGTGACGCTAGG

R：GTCGTCTGGACTGTGTTCCC

Lias F：TGCATAATGGACCAGACCTTCAA

R：TGTCTTTAGCCATGGAGGTAGTC

Actb F：GCTCCGGCATGTGCAAAG

R：CCCACCATCACACCCTGG，

S3：将S1配制好的两个体系分别放入实时荧光定量扩增仪中，选择SYBR Green l荧光检测通道，设置95℃预变性2分钟，接着95℃变性5秒，60℃退火延伸，循环40次，扩增循环结束后，加热升温至95℃变性DNA产物，同时，对阴性对照样品进行检测；

S4：待反应结束后，通过Ct值和荧光扩增曲线进行判别；若Ct值越小，说明样本中该基因的表达水平相对较高，越容易被检测到；反之，循环阈值Ct值越大，所需循环的次数越多，检测到时需要更多的时间与循环，因此，样本中该神经死亡通路标志物的基因表达水平相对低，阴性对照中的扩增曲线呈锯齿状；

S4：将每对基因引物的复孔平均Ct值减去内参复孔平均Ct值，得到delta Ct值，再把实验组delta Ct值减去对照组delta Ct值得到delta delta Ct值(ddCt)，倍数(foldchange)计算＝2

实施例3：通过用于检测小鼠11条神经细胞死亡通路试剂盒，可同时检测视神经11条或选择性检测某几条神经细胞死亡通路标志物(见表一)的表达情况。

确定实验中需要检测的通路，配制样本反应体系，每个样本中设置3个反应复孔，每个反应孔中加入2U Taq DNA聚合酶1μL，2X Reaction buffer 5μL，10mM dNTP 1μL，ddH

实施例4：通过用于检测小鼠11条神经细胞死亡通路试剂盒，同时检测视神经损伤后视网膜中细胞焦亡和铁死亡标志物表达水平。

检测方法同实施例3，选择细胞焦亡标志物N/rp3和铁死亡标记物Gpx4引物。与正常小鼠视网膜中细胞焦亡标记物N/rp3的delta Ct值(9.75±0.56)相比，小鼠视神经挤压损伤后第1天，视网膜中delta Ct值减少为8.67±0.23，说明其表达水平开始显著上升(p＝0.011)。损伤后第7天，小鼠视网膜中N/rp3的delta Ct值减至最低(7.53±0.15；p＝0.001)，并且这种高表达模式一直持续到损伤后14天(delta Ct值：2.74±0.23；p＝0.017)。上述数据表明小鼠视神经损伤后的14天中细胞焦亡模式被激活。

同时，与正常小鼠视网膜相比(delta Ct值：2.12±0.15)，小鼠视神经挤压损伤后第一天的视网膜中铁死亡负向调节标记物Gpx4 delta Ct值减少至2.65±0.08(p＝0.006)，显示Gpx4表达水平下降。Gpx4的低表达水平一直持续到损伤后第5天(delta Ct值：2.74±0.23；p＝0.017)，于第7天恢复至正常水平(delta Ct值：2.38±0.32；p＝0.264)。这些结果显示，小鼠视神经损伤后死亡模式被激活。

实施例5：通过用于检测小鼠11条神经细胞死亡通路试剂盒，检测小鼠视神经损伤后视网膜中SARM1相关死亡标志物Sarm1表达水平。

检测方法同实施例3。引物选择SARM1相关死亡标志物Sarm1与正常小鼠视网膜相比(delta Ct值：4.75±0.18)，小鼠视神经挤压损伤后的第7天，视网膜中Sarm 7的deltaCt值为4.76±0.38，无显著改变(p＝0.79)。损伤后第14天，Sarm 7的delta Ct值仍无显著变化(5.04±0.38，p＝0.89)。这些数据说明SARM 1相关死亡可能不参与视神经损伤后视网膜神经节细胞的死亡。

通过同时且纵向对神经细胞死亡通路的检测，我们明确了视神经损伤后视网膜神经节细胞的死亡模式，有助于针对激活的通路及靶点后续展开更深入的研究，减少视神经损伤后视网膜神经节细胞的死亡，并且在神经系统疾病动物模型中证实了同时对多条神经细胞死亡通路进行检测的可行性。

可以根据需求，来选择相应的引物进行检测所有的死亡通路还是针对性的某几条。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

表一神经细胞死亡途径和其关键调控因子

表二11条小鼠神经细胞死亡通路标志物的基因引物信息