一种黑果枸杞中活性物质的分离方法

技术领域

本发明涉及天然产物分离技术领域，特别是涉及一种黑果枸杞中活性物质的分离方法。

背景技术

黑果枸杞是近年来在青海柴达木盆地等地被广泛种植的一种药食两用植物，具有较高的营养和食用价值，含有蛋白质、维生素以及矿物质等多种营养成分。其果实也含有丰富的花青素成分，具有抗氧化和抗过敏功能，增强人体免疫力和改善睡眠。

研究表明，黑果枸杞含有多种生物活性成分，其成熟浆果中富含花色苷等多酚类物质，具有抗氧化、潜在预防和治疗心血管系统疾病等作用。其中多酚类物质包括花色苷、黄酮类化合物等通过其较强的抗氧化清除自由基作用，表现出抗炎、保护心血管、抗肿瘤等多种生物活性。

目前对于黑果枸杞的活性物质的研究还比较薄弱，其活性成分的发掘、分离和提取，还有待进一步的研究。若能对黑果枸杞中新的化学成分及其药理作用进行更加深入、细微的研究与活性机制探讨，则有望开发出更多可治疗疾病且安全有效的天然植物来源药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑果枸杞中活性物质的分离方法，通过对黑果枸杞进行分离提取，首次得到一种活性物质norpetanin，通过核磁数据鉴定得到活性物质norpetanin的确切的化学结构，并发现活性物质norpetanin具有抗炎活性、降糖和降脂作用。

本发明所采用的技术方案是：

一种黑果枸杞中活性物质的分离方法，包括以下内容：

(1)取黑果枸杞果实甲醇提取物浸膏；

(2)将黑果枸杞果实甲醇提取物浸膏与干燥的聚酰胺粉末混合，干燥后研磨，过20目筛，得到过筛粉末；

(3)取步骤(2)中过筛粉末装入小型中压色谱塔中，并连接装有MCI的中压色谱塔与制备液相色谱，进行干法上样；采用水/甲醇/二氯甲烷三相体系进行洗脱，共计得到三个组分：保留时间12～39min得到Fr1，保留时间39～139min得到Fr2，保留时间139～230min得到Fr3；

(4)步骤(3)中得到的Fr2，以甲醇和/或水为流动相，进行梯度洗脱，保留时间76～130min得到Fr2-5；

(5)步骤(4)中Fr2-5，连接C18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相进行梯度洗脱：保留时间19-21min得到Fr2-5-3；

(6)步骤(5)中Fr2-5-3，C18制备色谱柱，以水/乙腈为流动相，进行梯度洗脱，保留时间33-35min得到Fr2-5-3-3，即为目标活性物质。

进一步地，所述活性物质为组合物，包括如式Ⅱ和式Ⅲ所示的化合物或其各光学异构体、各晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：：

进一步地，所述组合物中式Ⅱ和式Ⅲ所示的化合物的比例为3:1。

进一步地，步骤(3)中所述洗脱条件：

0～120min，100％水～100％甲醇；

120～180min，100％甲醇～100％二氯甲烷；

180～210min，100％甲醇；

210～240min，100％水；

流速：50mL/min，检测波长：210nm。

进一步地，步骤(4)中所述洗脱条件：

0～120min，0～100％甲醇；

120～140min，100％甲醇；

流速：50mL/min；

检测波长：254nm；

填料：MCI GEL CHP20P树脂；

色谱塔规格：49×460mm。

进一步地，步骤(5)中所述洗脱条件：

0～60～65～90min，30％～42％～40％～95％甲醇；

流速：19mL/min；

检测波长：210nm；

进样体积：300μL；

填料：C18制备色谱柱；

柱子规格：21.2×250mm，5μm。

进一步地，步骤(6)中所述洗脱条件：

0～10～60min，5％～15％～17％乙腈；

流速：19mL/min；

检测波长：210nm；

进样体积：500μL；

填料：C18制备色谱柱；

柱子规格：21.2×250mm，5μm。

本发明还提供了前述Fr2、Fr2-5、Fr2-5-3或Fr2-5-3-3、组合物以及其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物，在制备治疗和/或预防炎症相关疾病的产品中的应用。

进一步地，所述产品为降低NO、PGE2、TNF-α、IL-β、IL-6、COX-2和iNO至少一种炎症因子的释放量的产品。

进一步地，所述产品为抑制iNOS蛋白表达的产品。

本发明还提供了前述Fr2、Fr2-5、Fr2-5-3、组合物以及其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物，在制备改善糖代谢或/和脂代谢产品中的应用。

进一步地，所述产品为具有降脂作用、或抑制脂肪细胞分化的产品。

更进一步地，所述产品为抑制细胞内脂滴积累和/或细胞内脂质生成的产品。

根据本发明的分离纯化路径，活性物质Fr2-5-3-3存在于Fr2、Fr2-5或Fr2-5-3这几个提取部位中，且在上述部位中含量依次增加。基于化合物I(包括顺反的互变异构体及其组合物)在抗炎、改善糖脂代谢方面的作用，含有化合物I(包括顺反的互变异构体及其组合物)的Fr2、Fr2-5或Fr2-5-3也具备上述活性。

所述“C18制备色谱柱”是一种常用的反相色谱柱，其原理是使用C18烷基链固定在硅胶基质上作为固定相，将极性物质与非极性物质分离。C18色谱柱的烷基链可以与样品中的非极性物质相互作用，使其在固定相上停留更长的时间，而无法快速通过柱子，从而实现分离。相反，极性物质则无法与烷基链相互作用，因此可以快速通过柱子。C18色谱柱适用于分离具有不同极性的化合物混合物，例如药物、天然产物和有机化合物等。其分离效果受到固定相的性质、样品的性质和流动相的性质等多个因素的影响。

精细分离色谱填料MCI GEL：

用于制药方面的分析制备的色谱填料(MCI-GEL CHP系列)、MCI-GEL CHP20/P120系列、CMG系列、CHP2MG系列、CHP系列。

MCI GEL精细分离填料可分为以下几种系列：

离子交换树脂系列：

键合磺酸盐的阳离子交换树脂MCI-GEL SCK、CK、AFR系列；

键合季铵盐的阴离子交换树脂MCI-GEL SCA、CA、CDR系列。

生物分离树脂系列：

用于生物分离CQK、CQA离子交换树脂系列，基体是聚羟基甲基丙烯酸酯类(HMA)；

用于生物分离色谱CQH疏水反应树脂系列，基体是聚羟基甲基丙烯酸酯类(HMA)；

用于生物分离的尺寸排阻色谱的CQP系列树脂，聚羟基甲基丙烯酸酯类(HMA)。

吸附树脂系列：

用于反向色谱分离的MCI-GEL CHP系列产品，基体是聚苯乙烯和二乙烯基共聚物或聚甲基丙烯酸酯。本申请应用的MCI填料即为MCI-GEL CHP20树脂。

本发明的有益效果是：

本发明首次通过色谱分离方法：采用水/甲醇/二氯甲烷三相体系进行洗脱将黑果枸杞中甲醇提取物浸膏中活性成分进行分离，最后采用以水/乙腈为流动相，进行梯度洗脱，保留时间33-35min得到目标活性物质norpetanin，通过核磁数据鉴定得到活性物质norpetanin的确切的化学结构，并发现活性物质norpetanin具有抗炎活性、降糖和降脂作用。

本发明中化合物结构式上标注的数字，仅为了便于对化合物的结构进行说明。

附图说明

图1Fr2的制备色谱图；

图2Fr2-5的制备色谱图；

图3Fr2-5-3的制备色谱图；

图4norpetanin的分析色谱图；

图5norpetanin的高分辨质谱图；

图6norpetanin的

图7norpetanin的

图8norpetanin的HMBC图；

图9norpetanin的HSQC图；

图10norpetanin的COSY图；

图11norpetanin的DEPT图；

图12norpetanin的紫外吸收光谱图；

图13不同浓度的norpetanin对RAW264.7细胞活力的影响；

图14norpetanin对RAW264.7细胞NO释放量的影响；

图15norpetanin对RAW264.7细胞iNOS蛋白表达的影响图；

图16FCM法检测norpetanin处理后3T3-L1脂肪细胞2-NBDG摄取的影响图；

图17norpetanin对3T3-L1脂肪细胞中p-PI3K、p-AKt表达的影响图；

图18norpetanin对3T3-L1细胞脂滴积累的影响图(100×)；

图19norpetanin对3T3-L1细胞TG含量的影响图；

图20norpetanin对3T3-L1细胞成脂转录因子表达的影响图；

图21norpetanin对3T3-L1细胞脂代谢相关蛋白表达的影响图。

具体实施方式

以下对本发明的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，此处所描述的实施例仅是本发明中的一部分，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

一种组合物的分离方法，包括以下内容：

(1)称取10.0kg干燥黑果枸杞果实，在室温避光条件下，加入200L甲醇浸泡，提取3次，每次浸泡4d，提取一次，共提取3次；将提取液进行过滤，并进行避光减压浓缩、合并，得到黑果枸杞果实甲醇提物浸膏3.643kg。

(2)将步骤(1)中制备的甲醇提取物浸膏与干燥的聚酰胺粉末以质量比1:1进行混合，经烘箱40℃烘干后研磨，过20目筛，得到过筛粉末；

(3)取步骤(2)中过筛粉末50.00g装入小型中压色谱塔(26×100mm)中，并连接装有MCI的中压色谱塔(49×460mm)，进行干法上样；采用水/甲醇/二氯甲烷三相体系进行洗脱，0～120min，100％水～100％甲醇；120～180min，100％甲醇～100％二氯甲烷；180～210min，100％甲醇；210～240min，100％水；流速：50mL/min，检测波长：210nm；共计得到三个组分Fr1、Fr2和Fr3，如图1所示，在保留时间39～139min得到Fr2，紫色粉末状，511.3g，收率15.1％。

(4)对步骤(3)中得到的Fr2做进一步的分离，以甲醇和/或水为流动相，进行梯度洗脱，洗脱条件0～120min，0～100％甲醇；120-140min，100％甲醇；流速：50mL/min；检测波长：254nm；填料：MCI GEL CHP20树脂；规格：49×460mm；如图2所示，保留时间76～130min得到Fr2-5 175.5g，收率34.3％。

(5)对步骤(4)中Fr2-5进行分离，分离条件为21.2×250mm，5μm的C18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相进行梯度洗脱：0～60～65～90min，30％～42％～70％～95％甲醇，流速：19mL/min；检测波长：210nm；进样体积300μL，如图3所示，保留时间19～21min得到Fr2-5-3，称重5.2g，收率29.6％。

(6)对步骤(5)中Fr2-5-3进行分离，规格为21.2×250mm，5μm的C18制备色谱柱，以水/甲醇为流动相，进行梯度洗脱：0～10～60min，5％～15％～17％乙腈；流速：19mL/min；检测波长：210nm，进样体积500μL；保留时间33～35min得到Fr2-5-3-3，即为目标组合物，如图4所示，黄色粉末，称重827mg，收率15.9％。目标组合物的MS、

所述组合物，结构如通式Ⅱ和Ⅲ所示的化合物或其各光学异构体、各晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物：

黑果枸杞中活性组合物(Fr2-5-3-3)的核磁共振数据如表1所示。

表1组合物(Fr2-5-3-3)的核磁共振数据

组合物Fr2-5-3-3：黄色粉末，ESI-MS m/z：809[M-H]

活性物质norpetanin的DEPT图、紫外吸收光谱图分别如图11和12所示。

实施例2

norpetanin的抗炎作用评价:

利用所建立的炎症细胞模型，测定norpetanin对细胞NO释放量的影响，并探究活性物质norpetanin对iNOS蛋白表达的影响，并初步探讨其发挥抗炎作用可能的作用机制。

1.实验材料与试剂

1.1实验材料

本发明实施例1分离提取的组分Fr2-5-3-3，即黑果枸杞活性组合物norpetanin。

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：TCM13。

受试药物的配制：称取Fr2-5-3-3与阳性对照药地塞米松适量，用DMSO配制成浓度为100mM的母液，于4℃冰箱保存，使用时按需求进行稀释。

所用材料与试剂如表2所示：

表2实验材料与试剂

2.实验方法

2.1MTT法测定细胞活力

取对数生长的RAW264.7细胞以5×10

2.2Griess法测定NO含量

冰箱取出Griess试剂Ⅰ、Ⅱ，待其恢复至室温进行实验。将标准品用含有10％FBS的DMEM进行稀释，使其浓度依次为0、1、2、5、10、20、40、60、80、100μM。在96孔板中，每孔加入50μL标准品及样品溶液，各孔再依次加入50μL Griess试剂Ⅰ及50μLGriess试剂Ⅱ，置摇床上混匀后测定540nm波长的吸光值，根据标准曲线计算NO含量。

2.3Western blot分析

实验分为对照组、LPS组和LPS+不同浓度药物组，取对数生长期RAW264.7细胞，以5×10

(1)RAW264.7细胞蛋白的提取

RAW264.7细胞经过处理后，对细胞进行裂解，提取细胞蛋白。用吸液泵将培养液吸出，PBS缓冲液清洗2次，将PBS吸净。加入细胞裂解液，晃动6孔板混匀，放置于冰上裂解10min，用细胞刮将细胞刮下，收集到离心管中。将离心管置于冰上继续裂解30min。裂解完成后，利用低温离心机，在12000r/min，4℃下离心15min，收集含有蛋白质的上清液于新的EP管中。

(2)BCA法测细胞蛋白浓度

蛋白浓度的测定采用BCA法，首先利用PBS缓冲液将蛋白标准品配制成浓度为0.5mg/mL，BCA工作液按照A液：B液＝50：1的比例配制，混匀。设置三个平行，按表3所示，加入蛋白质标准品溶液与PBS缓冲液，绘制标准曲线。取细胞提取蛋白质溶液样品1μL加入96孔板，并用PBS缓冲液补足体积至20μL，后加入200μLBCA工作液，37℃反应30min，酶标仪测定562nm吸光度值，根据标准曲线计算各样品蛋白浓度，BCA法蛋白定量表如表3所示。

表3BCA法蛋白定量表

(3)蛋白变性

取稀释好的蛋白样品，加入蛋白上样缓冲液并混匀，在金属浴中100℃变性15min。变性好的蛋白冷却至室温后，于-20℃冰箱储存备用。

(4)SDS-PAGE电泳

取两块洁净玻璃板，对齐置于胶架上夹紧，加入超纯水进行检漏，检漏后将超纯水倒出并用吸水纸将两玻璃板间残留液体吸干，准备灌胶。如表4所示，根据蛋白分子量大小配制适合浓度的分离胶(下层胶)，根据实验中所需要检测的蛋白分子量按照表5配制10％SDS-PAGE分离胶，按表6配制5％SDS-PAGE浓缩胶(上层胶)。在两干燥玻璃板之间加入4mL左右分离胶，加入异丙醇封胶，放置1h使分离胶凝固。倒掉异丙醇，用吸水纸吸去残留的异丙醇，灌入浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡，待浓缩胶凝固，轻轻将梳子拔出。将两块玻璃板夹在电泳槽上，灌入电泳液使液面没过玻璃板，将蛋白质样品进行上样，上样结束后，开始电泳，先用恒压80V使样品在浓缩胶中浓缩30min左右，将电压调至120V继续恒压电泳，待上样缓冲液跑至胶板底部，停止电泳。SDS-PAGE凝胶最佳分离范围如表4所示；10％SDS-PAGE分离胶配制表如表5所示；5％SDS-PAGE浓缩胶配制表如表6所示。

表4 SDS-PAGE凝胶最佳分离范围

表5 10％SDS-PAGE分离胶配制表

表6 5％SDS-PAGE浓缩胶配制表

(5)转膜

将PVDF膜裁剪至合适大小，剪去一角作为标记以便区分切胶后的正反面，用甲醇浸泡活化1min。将活化后的PVDF膜、泡沫、转膜滤纸泡在预冷的转膜缓冲液中平衡。用切胶刀撬开玻璃板，根据目标蛋白分子量切胶，放入电泳液中，将转膜夹黑色一面置于下方，依次放上泡沫、滤纸、胶条、PVDF膜、滤纸、泡沫，夹紧。放置好后把夹子放入转膜槽中，黑色夹子对着槽的黑面，倒转膜液使之浸没夹板，放置冰袋置于低温环境，设置电流为恒流250mA。根据蛋白质分子量大小设定转膜时间。

(6)封闭

封闭液为1×TBST配制的5％的脱脂牛奶，转膜结束后将PVDF膜取出放入孵育盒，加脱脂牛奶至没过PVDF膜，室温放置在摇床慢摇1h，倒出脱脂牛奶，1×TBST轻摇清洗10min，清洗3次。

(7)孵育一抗

用抗体稀释液将一抗iNOS(CST，#13120))按照1：1000比例稀释，将PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中，4℃摇床低速孵育一抗过夜，回收一抗溶液，1×TBST清洗10min，清洗3次。

(8)孵育二抗

将PVDF膜放入1:5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，孵育完毕后回收二抗溶液，1×TBST室温洗膜3次，每次10min。

(9)显影

显影采用ECL化学发法，显影液A和B按1：1混匀，取100μL滴加在PVDF膜上，显影仪显影并拍照。

3.实验结果

3.1norpetanin对RAW264.7细胞活力和NO分泌的影响

如图13和14所示，MTT法检测活性物质对RAW264.7细胞活力的影响，活性物质norpetanin在0-20μM没有明显的抑制作用，在50μM(P<0.05)和100μM(P<0.01)都可以抑制RAW264.7的生长，且具有显著抑制NO分泌的作用。

3.2norpetanin对RAW264.7细胞iNOS蛋白表达的影响

活性物质在抑制炎症模型NO释放量方面表现出了良好的抗炎活性，进一步对其抗炎机制进行研究。检测化合物处理后RAW264.7细胞内iNOS蛋白表达水平，考察其对炎症相关蛋白的影响。如图15所示，LPS刺激后，RAW264.7细胞中的iNOS、表达水平上调，与对照组相比具有极显著差异(P<0.01)。norpetanin在浓度为10μM时，可以显著的抑制iNOS蛋白表达(P<0.01)，表明化合物可通过抑制iNOS蛋白的表达从而降低NO释放量发挥抗炎作用。

实施例3

norpetanin对糖代谢的影响：

1.实验材料与仪器

1.1材料与试剂

受试物：为实验室自制制备所得norpetanin。

3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞购买于中国科学院上海细胞库，实验中所使用的材料与试剂见表7。

表7材料与试剂

主要实验试剂

(1)2-NBDG配制

将2-NBDG粉末用DMSO溶解配制成10mM的母液，使用时用无糖DMEM稀释至终浓度为100μM。

(2)Western blotting工作液的配制如下：

a.10％ SDS

称取10gSDS，加入100mL超纯水，50℃水浴溶解，室温保存。如出现沉淀，水浴溶化后仍可使用。

b.SDS-PAGE电泳液(5×)

称取15.1g Tris，94.0g Glycine，5.0g SDS，加超纯水溶解，定容至100mL，室温保存。使用时可将5×电泳液稀释为1×电泳液，可重复使用2-3次，室温保存。

c.转膜液(10×)

称取15.15g Tris，72.0g Glycine，用时稀释为1×转膜液，方法：量取10×转膜液50mL，加甲醇100mL，用超纯水补至500mL，即10×转膜液：甲醇：水＝1:2:7，可重复使用3-5次，4℃冰箱保存。

d.TBS(10×)

称取12.12g Tris，40.03g NaCl，加超纯水溶解，HCl调pH＝7.6(加HCl大约3.5mL)，定容至500mL，4℃冰箱保存。

1.2仪器和设备

本实验所用的主要仪器和设备见表8。

表8仪器和设备

2实验方法

2.1 3T3-L1脂肪细胞模型的建立

(1)3T3-L1细胞的体外培养与传代

3T3-L1细胞用含10％FBS及1％青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中培养。细胞培养箱的温度为37℃、湿度为95％和CO

(2)3T3-L1细胞的冻存与复苏

细胞的冻存：选取对数生长期的细胞，快速消化细胞，将消化后的细胞悬液在室温下以1000g离心5min得到细胞团，加入提前配制的细胞冻存液(DMEM:FBS:DMSO＝5:4:1)，每支冻存管中加入1.2mL的细胞悬液，同时在管壁上做好标记(细胞类型、细胞代数、冻存的细胞个数和冻存的时间)，以便能随时查询，最后4℃放置10min，-20℃放置1h，-80℃放置过夜，第二天置于液氮罐中保存。细胞的复苏：从液氮罐中快速取出冻存的细胞株，迅速置于37℃水浴中融化，待细胞完全融化后，快速地将细胞转移至培养液中进行培养，待细胞贴壁后(一般6～8h)更换新鲜培养液。

(3)3T3-L1细胞的计数

细胞计数常用的工具是血球计数板，血球计数板每块计数板由2块H形凹槽，形成高0.10mm的计数池，计数板中有9个大方格，细胞计数的区域为四角的4个大方格。细胞个数确定后然后根据实验需要，调整细胞密度。一般计数的原则，记上不记下，记左不记右。根据实验要求调整细胞计数密度，记录4个大方格的细胞总数，最后按照公式计算细胞个数：

细胞个数＝4个格中的细胞总数/4×10

(4)胰岛素抵抗模型的建立

采用“鸡尾酒”法对3T3-L1细胞进行诱导分化，按如下方法进行诱导分化：将细胞状态良好的3T3-L1细胞接种于培养板上，铺板密度5×10

2.2norpetanin对3T3-L1细胞2-NBDG摄取的影响

将3T3-L1前脂肪细胞以5×10

2.3norpetanin对3T3-L1细胞AKt磷酸化的影响

将3T3-L1前脂肪细胞以5×10

2.4Western blot分析

将处理得到细胞样品进行蛋白提取，其具体操作方法如下：

(1)将RIPA裂解液与PMSF按100:1的比例混合均匀(如分析磷酸化蛋白时，需加入磷酸酶抑制剂)，配制成细胞裂解液。将6孔板中的细胞用冷的PBS洗3次，每孔加入100μL细胞裂解液，放于冰上裂解5min，随后用细胞刮子刮取细胞，收集到1.5mL离心管，再次放入4℃冰箱充分裂解30min。最后在12000g，4℃，15min的条件下离心肝组织匀浆液和细胞裂解液，取上清液蛋白于新的EP管。

(2)BCA法测定蛋白质含量：取出适量蛋白样品，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书的要求，将蛋白标准品用PBS缓冲液稀释为0.5mg/mL，按50:1的比例将试剂A：试剂B混匀配制成工作液。按表9所示将标准品和PBS加入96孔板中，每孔20μL，一般每个浓度设3个复孔，用来绘制标准曲线。蛋白样品1μL加到96孔板中，加PBS补到20μL。每孔加入200μLBCA工作液充分混匀，上述样品在微孔板孵育振荡器37℃振荡孵育30min，于酶标仪562nm处测吸光度值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。配好的蛋白样品于100℃加热10min，使蛋白完全变性。蛋白上样前，样品离心混合均匀后使用。

表9 BCA法蛋白定量表

(3)SDS-PAGE电泳：根据目标蛋白的分子量大小选择合适的分离胶浓度(如表10所示)，配制合适的溶液体系(下层胶)，待下层胶在室温放置40min以上使至完全凝固，再配制5％的浓缩胶(上层胶)，并插入大小合适的梳子。待浓缩胶凝固后，将胶板放入电泳槽中，往两块板之间加满电泳液后拔出梳子，上蛋白样品和marker后进行跑胶。电泳条件：S1阶段，80V，30min；S2阶段，120V，大约60～90min，直至缓冲液中溴酚蓝跑到分离胶最下端时结束电泳。

(4)转膜：待到蛋白电泳结束后立即进行转膜，根据marker条带按照分子量切下目标蛋白所在的位置。取出PVDF膜剪裁成与胶相同的大小，将剪裁好的膜放置甲醇溶液活化1min后放入转膜液中。按照转印夹黑板-滤纸-胶PVDF-滤纸-转印夹白板顺序夹紧电转夹，黑板对着槽的黑面，放入电泳槽，加满转膜液至整个槽中，通电后将转膜仪置于冰水混合物中。转膜的条件为恒流250mA，时间90min。

表10不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围

(5)封闭：转膜结束后，将PVDF膜快速从转膜板中用镊子轻轻拿出，放于TBST缓冲液中漂洗5min，随后立刻用含5％脱脂奶粉的TBST在室温摇床上封闭1h。

(6)一抗孵育：封闭结束后，将PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中，在4℃条件下置于水平摇床上慢摇孵育过夜。

(7)二抗孵育：一抗孵育结束后，TBST洗膜三次，一次8min。随后将PVDF膜置于含有HRP标记的鼠二抗或兔二抗溶液中室温慢摇孵育1h。

(8)显影：二抗孵育结束后，TBST洗膜三次，一次8min。洗膜结束后，将混合好的ECL显影液滴加在PVDF膜上，并用凝胶成像系统进行拍照。

(9)结果分析：目标蛋白和内参蛋白的灰度值用Image J软件进行定量分析，蛋白的相对表达量为目标蛋白与内参蛋白的比值(磷酸化与非磷酸化蛋白的比值)。

2.5统计分析

使用GraphPad Prism7软件进行作图和统计学分析，两组间均数的比较采用独立样本t检验，多组数据之间均数的相互比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，统计数据以平均值±标准差(x±s)表示，*或者#表示P<0.05说明具有统计学意义，**或者##表示P<0.01说明其差异具有极显著统计学意义。

3实验结果

3.1norpetanin对3T3-L1细胞2-NBDG摄取的影响

如图16所示，采用荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG检测3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取。荧光探针2-NBDG(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-ylamino]-2-deoxyglucose)是一种2-脱氧葡萄糖荧光类似物，能特异性结合胞内的葡萄糖，检测时有较高的灵敏性。通常胰岛素抵抗的细胞或机体中2-NBDG的荧光强度极弱，处于本底值，说明细胞或机体对葡萄糖的摄取能力弱。实验结果显示，正常组中2-NBDG的摄取能力高于胰岛素抵抗模型组中的葡萄糖摄取能力，模型组中细胞对葡萄糖的摄取能力较弱，与正常组中胰岛素刺激后的细胞的葡萄糖摄取能力差异较明显。活性物质norpetanin干预后，能促进胰岛素刺激下脂肪细胞对2-NBDG的摄取，活性物质norpetanin具有改善胰岛素抵抗的潜力。

注：与正常组相比，

3.2norpetanin对3T3-L1细胞PI3K和AKt磷酸化的影响

AKt又称为蛋白激酶B(PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白在细胞进程中扮演着重要的角色，如葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、细胞转运等多方面。在葡萄糖代谢过程中活化的AKt通过磷酸化途径而激活胰岛素信号通路中的多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞功能和胰岛素信号的传递。通常活化的AKt通过激活其下游的磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)而促使葡萄糖转运蛋白从胞浆转位到细胞膜上，加快葡萄糖的吸收利用，从而发挥胰岛素信号传递的作用。本实验通过检测黑果枸杞中活性物质norpetanin对细胞中p-AKt和p-PI3K表达的影响，考察其是否具有促进细胞吸收利用葡萄糖，增强胰岛素信号传递过程，改善胰岛素抵抗的作用。其实验结果如图17所示，与正常组相比，模型组p-AKt和p-PI3K蛋白表达水平降低。活性物质norpetanin处理后，能提高3T3-L1脂肪细胞中p-AKt和p-PI3K的表达水平，从而促进3T3-L1脂肪细胞细胞对葡萄糖摄取、增强胰岛素敏感性。

4小结

利用3T3-L1脂肪细胞建立了胰岛素抵抗模型研究黑果枸杞中活性物质norpetanin的降糖作用，借助FCM检测化合物对处于胰岛素抵抗状态下的脂肪细胞对葡萄糖类似物的摄取情况，同时采用Western blotting检测3T3-L1脂肪细胞中PI3K和AKt的磷酸化水平，实验结果表明黑果枸杞活性物质norpetanin干预后，能促进胰岛素刺激下脂肪细胞对2-NBDG的摄取，具有改善胰岛素抵抗的潜力。从Western blotting实验结果可以看出，活性物质norpetanin也能提高3T3-L1脂肪细胞中p-PI3K和p-AKt表达水平。

本研究中黑果枸杞活性物质norpetanin能提高3T3-L1脂肪细胞中p-AKt和p-PI3K表达水平，其暗示着黑果枸杞中活性物质norpetanin能促进胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取，提高对胰岛素的敏感性，具有改善胰岛素抵抗的潜力，为开发利用黑果枸杞治疗II型糖尿病提供更多的科学依据。

实施例4

norpetanin对脂代谢的影响：

1实验材料与仪器

1.1材料与试剂

受试物：为实验室分离制备得到的norpetanin。

3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞购买于中国科学院上海细胞库，实验中所使用的材料与试剂见表11。

表11材料与试剂

1.2仪器和设备

本实验所用的主要仪器和设备见表12。

表12仪器和设备

2实验方法

2.1 3T3-L1脂肪细胞模型的建立

(1)3T3-L1细胞的体外培养与传代

3T3-L1细胞用含10％FBS及1％青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中培养。细胞培养箱的温度为37℃、湿度为95％和CO

(2)3T3-L1细胞的冻存与复苏

细胞的冻存：选取对数生长期的细胞，快速消化细胞，将消化后的细胞悬液在室温下以1000g离心5min得到细胞团，加入提前配制的细胞冻存液(DMEM:FBS:DMSO＝5:4:1)，每支冻存管中加入1.2mL的细胞悬液，同时在管壁上做好标记(细胞类型、细胞代数、冻存的细胞个数和冻存的时间)，以便能随时查询，最后4℃放置10min，-20℃放置1h，-80℃放置过夜，第二天置于液氮罐中保存。细胞的复苏：从液氮罐中快速取出冻存的细胞株，迅速置于37℃水浴中融化，待细胞完全融化后，快速地将细胞转移至培养液中进行培养，待细胞贴壁后(一般6～8h)更换新鲜培养液。

(3)3T3-L1细胞的计数

细胞计数常用的工具是血球计数板，血球计数板每块计数板由2块H形凹槽，形成高0.10mm的计数池，计数板中有9个大方格，细胞计数的区域为四角的4个大方格。细胞个数确定后然后根据实验需要，调整细胞密度。一般计数的原则，记上不记下，记左不记右。根据实验要求调整细胞计数密度，记录4个大方格的细胞总数，最后按照公式计算细胞个数：

细胞个数＝4个格中的细胞总数/4×10

(4)3T3-L1细胞诱导分化

采用“鸡尾酒”法对3T3-L1细胞进行诱导分化，按如下方法进行诱导分化：将细胞状态良好的3T3-L1细胞接种于培养板上，铺板密度5×10

2.2油红O染色

将细胞状态良好的3T3-L1细胞接种于6孔板上，铺板密度5×10

2.3TG含量测定

将3T3-L1细胞以5×10

(1)细胞前处理：在诱导的第8d，将细胞培养液吸走，冷PBS洗两次后加入胰酶消化液进行消化细胞。

(2)细胞收集：细胞消化后，加入PBS重悬细胞后在1000g的条件下离心5min，收集细胞沉淀团。

(3)超声破碎：向收集的沉淀团中加入适量的PBS后进行超声破碎(3min)。

(4)测定：在96孔板中每孔加入2μL细胞破碎悬液，空白孔中加入2μL蒸馏水，标准孔中加入2μL标准品，然后每孔中加入200μL的测定液，混匀，

37℃孵育10min后，在510nm处读取吸光值。借助BCA法测定待测样品中蛋白浓度，进行校正，最后根据公式计算TG的含量。

TG含量＝(OD样品-OD空白)/(OD校样-OD空白)×校准品浓度(mM)/待测样品蛋白浓度(gprot/L)

2.4Western blot分析

将处理得到细胞样品进行蛋白提取，其具体操作方法如下：

(1)将RIPA裂解液与PMSF按100:1的比例混合均匀(如分析磷酸化蛋白时，需加入磷酸酶抑制剂)，配制成细胞裂解液。将6孔板中的细胞用冷的PBS洗3次，每孔加入100μL细胞裂解液，放于冰上裂解5min，随后用细胞刮子刮取细胞，收集到1.5mL离心管，再次放入4℃冰箱充分裂解30min。最后在12000g，4℃，15min的条件下离心肝组织匀浆液和细胞裂解液，取上清液蛋白于新的EP管。

(2)BCA法测定蛋白质含量：取出适量蛋白样品，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书的要求，将蛋白标准品用PBS缓冲液稀释为0.5mg/mL，按50:1的比例将试剂A：试剂B混匀配制成工作液。按表13所示将标准品和PBS加入96孔板中，每孔20μL，一般每个浓度设3个复孔，用来绘制标准曲线。蛋白样品1μL加到96孔板中，加PBS补到20μL。每孔加入200μLBCA工作液充分混匀，上述样品在微孔板孵育振荡器37℃振荡孵育30min，于酶标仪562nm处测吸光度值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。配好的蛋白样品于100℃加热10min，使蛋白完全变性。蛋白上样前，样品离心混合均匀后使用。

表13BCA法蛋白定量表

(3)SDS-PAGE电泳：根据目标蛋白的分子量大小选择合适的分离胶浓度(如表14所示)，配制合适的溶液体系(下层胶)，待下层胶在室温放置40min以上使至完全凝固，再配制5％的浓缩胶(上层胶)，并插入大小合适的梳子。待浓缩胶凝固后，将胶板放入电泳槽中，往两块板之间加满电泳液后拔出梳子，上蛋白样品和marker后进行跑胶。电泳条件：S1阶段，80V，30min；S2阶段，120V，大约60～90min，直至缓冲液中溴酚蓝跑到分离胶最下端时结束电泳。

(4)转膜：待到蛋白电泳结束后立即进行转膜，根据marker条带按照分子量切下目标蛋白所在的位置。取出PVDF膜剪裁成与胶相同的大小，将剪裁好的膜放置甲醇溶液活化1min后放入转膜液中。按照转印夹黑板-滤纸-胶PVDF-滤纸-转印夹白板顺序夹紧电转夹，黑板对着槽的黑面，放入电泳槽，加满转膜液至整个槽中，通电后将转膜仪置于冰水混合物中。转膜的条件为恒流250mA，时间90min。

表14不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围

(5)封闭：转膜结束后，将PVDF膜快速从转膜板中用镊子轻轻拿出，放于TBST缓冲液中漂洗5min，随后立刻用含5％脱脂奶粉的TBST在室温摇床上封闭1h。

(6)一抗孵育：封闭结束后，将PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中，在4℃条件下置于水平摇床上慢摇孵育过夜。

(7)二抗孵育：一抗孵育结束后，TBST洗膜三次，一次8min。随后将PVDF膜置于含有HRP标记的鼠二抗或兔二抗溶液中室温慢摇孵育1h。

(8)显影：二抗孵育结束后，TBST洗膜三次，一次8min。洗膜结束后，将混合好的ECL显影液滴加在PVDF膜上，并用凝胶成像系统进行拍照。

(9)结果分析：目标蛋白和内参蛋白的灰度值用Image J软件进行定量分析，蛋白的相对表达量为目标蛋白与内参蛋白的比值(磷酸化与非磷酸化蛋白的比值)。

2.5统计分析

使用GraphPad Prism7软件进行作图和统计学分析，两组间均数的比较采用独立样本t检验，多组数据之间均数的相互比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，统计数据以平均值±标准差(x±s)表示，*或者#表示P<0.05说明具有统计学意义，**或者##表示P<0.01说明其差异具有极显著统计学意义。

3实验结果

3.1norpetanin对3T3-L1细胞脂滴积累的影响：

通过油红O染色观察norpetanin对3T3-L1细胞脂滴积累的影响，其结果如图18所示，未分化的细胞内无脂滴的积累，分化的细胞内含有大量的脂滴。经过norpetanin处理后，胞内脂滴显著减少。

3.2norpetanin对3T3-L1细胞脂质含量的影响：

norpetanin对TG含量的影响结果如图19所示，与未分化的细胞相比，分化的细胞内TG含量显著增加(P<0.01)。与分化的细胞相比，norpetanin处理后TG含量降低且均具有极显著差异P<0.01)。

3.3norpetanin对3T3-L1细胞脂代谢蛋白表达的影响：

(1)norpetanin对3T3-L1细胞成脂转录因子表达的影响

通过Western blot分析norpetanin对3T3-L1细胞成脂转录因子表达的影响，其结果如图20所示。未诱导分化的3T3-L1细胞中PPARγ、C/EBPα蛋白表达水平较低。而在诱导分化的细胞中PPARγ、C/EBPα蛋白表达水平较高。与分化组相比，norpetanin处理能在一定程度上降低PPARγ、C/EBPα转录因子的蛋白表达水平。

(2)norpetanin对3T3-L1细胞脂质生成相关蛋白表达的影响

通过Western blot分析norpetanin对3T3-L1细胞脂质生成相关蛋白表达水平的影响，其结果如图21所示。未诱导分化的3T3-L1细胞中FAS、ACC蛋白表达水平较低。而在诱导分化的细胞中FAS、ACC蛋白表达水平显著升高。与分化组相比，化合物处理后能显著降低FAS、ACC蛋白的表达水平。基于以上的结果，发现norpetanin通过抑制成脂转录因子和脂质生成相关蛋白的表达而减少胞内脂滴的积累。

4小结

在细胞水平上探究了norpetanin对3T3-L1细胞脂质生成的影响。3T3-L1细胞从前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞时会受转录因子和成脂蛋白的调控，并且细胞形态也会发生变化如最终出现“戎环样”。norpetanin能抑制3T3-L1细胞内脂滴的积累，降低细胞内TG含量。本实验结果也表明norpetanin也能通过抑制转录因子如PPARγ、C/EBPα等表达水平而抑制3T3-L1脂肪细胞的分化，降低胞内脂滴的积累。同时通过抑制FAS、ACC蛋白的表达水平从而抑制脂质生成来改善细胞的脂代谢水平。