用于生产视网膜色素上皮细胞片层的方法

本申请是申请日为2013年8月23日的中国专利申请201380051245.0“用于生产视网膜色素上皮细胞片层的方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及细胞片层的生产方法，其包含层压视网膜色素上皮细胞层和在移植后构成血管的细胞层。本发明还涉及用于移植的细胞片层，其包含从视网膜色素上皮细胞形成的细胞层、基底膜以及在移植后构成血管的细胞层。

背景技术

通过移植细胞片层形式的视网膜色素上皮细胞而治疗视网膜变性疾病的方法，该细胞片层形式接近体内形式。例如，正在实施自体组织移植（例如非专利文献1-3），包括将从年龄相关性黄斑变性患者的视网膜组织切除的视网膜色素上皮细胞的细胞片层（作为脉络膜伴随层）移植到受损黄斑区。源自患者组织的细胞片层是有问题的，这是因为除了移植手术之外，还产生了由于患者视网膜上的切除手术所导致的侵入风险，并发症的发病率高，移植后黄斑功能的改善和稳定保持的有效率低，等等。

作为利用从体外到体内培养的视网膜色素上皮细胞的方法，无需依赖于采集患者视网膜，使用通过在人工膜或羊膜上培养视网膜色素上皮细胞而获得的用于移植的细胞片层，以便掩盖很脆弱的单层上皮的刚度不足，这种方法是已知的。然而，人工膜是不适合移植的，因为它在组成、性质、刚度等方面不同于通过视网膜色素上皮细胞本身体内产生的基底膜，并且容易引起与其相关的炎症和排斥。与此相关，本发明人报导了容易形成由从体外到体内培养的视网膜色素上皮细胞和细胞本身所产生的基底膜所构成的细胞片层的方法（例如，专利文献1等）。由于通过该方法获得的细胞片层具有由活体类似的那些组分构成的基底膜，因此它很容易植入、具有刚性、在处理性方面优异并优选用于移植治疗。

视网膜色素上皮细胞病有时会发展出脉络膜纤维化和萎缩作为并发症，以及脉络膜微血管的不足，并显示出无法供应营养物给视网膜色素上皮和视觉细胞。具有基底膜的视网膜色素上皮细胞片层在这些症状中的移植带来一个问题，即所希望的治疗效果由于缺乏脉络膜微血管而难以实现，其妨碍了移植后对视网膜色素上皮细胞充足的营养物和氧供应以及所移植的细胞体内功能的充分展示。

另一方面，作为利用血管再生的治疗方法，包括移植内皮祖细胞、形成体内血管并治疗视网膜疾病的方法是已知的。例如，专利文献2报导了注射到玻璃体中的骨髓来源的内皮祖细胞定位于视网膜星形胶质细胞中，并入到血管中以形成正常的视网膜血管。然而，通过专利文献2的方法，经利用星形胶质细胞对内皮祖细胞的定位而再生了视网膜血管，但是不可能形成脉络膜血管来保护分开定位的视网膜色素上皮细胞和视觉细胞。

[文献列表]

[专利文献]

专利文献1：WO2011/142364

专利文献2：JP-A-2005-538742

[非专利文献]

非专利文献1：Am J Ophthalmol.2012年1月; 153(1):120-7

非专利文献2：Acta Ophthalmol.2011年9月; 89(6):e490-5

非专利文献3：Br J Ophthalmol.2011年3月; 95(3):370-5。

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的问题是研发方便且稳定地不使用人工膜来生产视网膜色素上皮细胞片层的新方法，从而提供用于移植的视网膜色素上皮细胞片层，其显示出高植活率以及功能性方面的优异，即使是对于患有诸如脉络膜视网膜变性疾病，特别是高度近视、严重葡萄膜炎等与脉络膜视网膜萎缩相关疾病的患者。

解决问题的手段

本发明人已进行了深入的研究，并研发出了细胞片层的生产方法，其包含层压视网膜色素上皮细胞层和在移植后具有形成血管的能力的细胞。他们已经发现，通过这样的方法所获得的细胞片层同时包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层两者，并且因此，当移植给患者时，它不仅重建了视网膜组织，而且通过血管形成重建了脉络膜，以及对于治疗脉络膜视网膜变性疾病，特别是与脉络膜病相关的视网膜变性疾病是有用的。此外，当通过在胶原凝胶层上铺板视网膜色素上皮细胞并将其培养而制备视网膜色素上皮细胞层时，所获得的视网膜色素上皮细胞层保持了胶原凝胶和视网膜色素上皮细胞片层之间的基底膜，具有细胞因子分泌能力和类似于体内视网膜色素上皮细胞的那些的细胞之间的粘附性，该视网膜色素上皮细胞层可以很容易地通过用胶原酶分解胶原凝胶而与细胞培养基材分开，同时保留基底膜。另外，构成视网膜色素上皮细胞层的细胞保持了视网膜色素上皮细胞特异性标志物的表达。基于这些发现，他们已经进行了进一步的研究，并完成了本发明。因此，本发明提供了以下内容：

[1] 生产细胞片层的方法，所述细胞片层包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层，所述方法包含层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层的步骤。

[2] [1]的生产方法，其中层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层，使得血管形成细胞层接触视网膜色素上皮细胞层的基底面。

[3] [1]或[2]的生产方法，其中血管形成细胞层是由选自由成血管细胞、血管内皮祖细胞和血管内皮细胞组成的组的至少一种细胞所构成的。

[4] [1]或[2]的生产方法，其中血管形成细胞层是由源自要用该细胞片层移植的患者的组织或细胞、或者源自具有与该患者HLA型匹配的HLA型的供体的细胞所构成的。

[5] [1]-[4]任一项的生产方法，其中视网膜色素上皮细胞层是通过包含以下步骤的方法所生产的细胞片层：

（1）将视网膜色素上皮细胞接种并培养在胶原凝胶上以形成由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层，以及

（2）用胶原酶降解胶原凝胶以分离由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层。

[6] [1]-[5]任一项的生产方法，其中视网膜色素上皮细胞是通过诱导ES细胞、iPS细胞或祖细胞的分化而获得的。

[7] [1]-[6]任一项的方法生产的细胞片层。

[8] 用于移植的细胞片层，所述细胞片层包含用通过从体外到体内诱导干细胞或祖细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞层、从所述细胞分泌的基底膜、以及血管形成细胞层。

发明效果

根据本发明，有可能容易且稳定地生产层压的视网膜色素上皮细胞片层，其具有能够补充活体中所缺乏的脉络膜血管并在移植后给视网膜供应氧气和营养物的血管构成细胞层。本发明的细胞片层是非常有用的，因为它在植活率和功能性方面是优异的，并且还可以治疗严重的脉络膜视网膜变性疾病，对此，简单的视网膜色素上皮细胞移植并不能容易地提供充分的治疗效果，诸如脉络膜视网膜变性疾病，特别是高度近视和严重葡萄膜炎等，它们与脉络膜视网膜萎缩相关。

附图说明

图1显示了移植有本发明的细胞片层的宿主组织切片的免疫组织化学染色。

图2显示了（A）显示出通过每种培养基中的血管内皮祖细胞所形成的血管数量的曲线图，以及（B）显示通过使用基质胶的每种培养基中的血管内皮祖细胞所形成的血管数量的曲线图。

图3显示了视网膜色素上皮细胞片层的细胞因子分泌能力的测试结果。

实施方案描述

对本发明如下进行详细说明。

本发明提供了生产细胞片层的方法，所述细胞片层包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层，所述方法包含层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层的步骤（本发明的生产方法）。

本发明中的血管形成细胞层是由具有血管形成能力的细胞（血管形成细胞）所构成的。当将通过本发明的生产方法获得的细胞片层移植到视网膜变性患者的脉络膜中的缺损部位时，细胞片层中所包含的血管形成细胞会在移植部位重建血管（优选脉络膜血管），其供应氧气和营养物给视网膜色素上皮细胞等。因此，通过本发明的生产方法所获得的细胞片层可以展现优异的治疗效果，通过移植到特别是患有与脉络膜缺损相关的视网膜变性疾病的患者的脉络膜缺损部位中。

尽管本发明的血管形成细胞可以是源自任何哺乳动物的细胞，只要它是源自哺乳动物（例如，人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等），但它优选源自人的细胞。

本发明中要使用的血管形成细胞的例子包括成血管细胞、血管内皮祖细胞、血管内皮细胞等。在这些细胞中，血管内皮祖细胞等作为血管形成细胞是优选的，因为这些细胞被认为在移植后的体内血管形成过程中能够容易地并入已有血液血管网中。血管形成细胞层可以包含除血管形成细胞外的细胞以及除了细胞外的组分，以及可以由包含血管形成细胞的细胞群或组织所构成。通常，构成血管形成细胞层的的细胞不少于70％（优选不少于80％，更优选不少于90％，最优选100％）是血管形成细胞（优选血管内皮祖细胞）。

血管内皮祖细胞是指具有分化成血管内皮细胞的能力和致力于分化成血管内皮细胞的细胞。已报导过血管内皮祖细胞的细胞表面标志物的多种表达模式，且已知基于细胞表面标志物表达模式的至少统一的定义是困难的。过去报导过的血管内皮祖细胞表面标志物的表达模式的例子包括用于外周血单核细胞来源的CD34阳性血管内皮细胞的CD34

众所周知，血管内皮祖细胞包含在卵黄囊、外周血、骨髓、脐带血、它们的单核细胞等中，并且可以从这些组织或细胞通过已知分离方法进行制备。分离方法的例子包括使用细胞表面标志物诸如CD34、VEGF受体2（KDR）等的表达作为指标以及使用磁珠和FACS的分离方法；利用市售内皮细胞集落形成单位（CFU-ECS）（N Engl J Med.2003; 348: 593-600）的方法等。作为外周血单核细胞或骨髓单核细胞来源的血管内皮祖细胞的生产方法的具体例子，以下方法是已知的，包括通过常规使用的方法在包含细胞因子诸如VEGF等的血管内皮促分化培养基中培养分离自外周血或骨髓的单核细胞、并作为粘附细胞而回收血管内皮祖细胞的方法；作为CD34阳性细胞而从外周血分离和回收血管内皮祖细胞的方法，其已通过使用G-CSF从骨髓募集（Yakugaku Zasshi 2007 125(5) 841-845等），等等。

另外，可以诱导各种细胞分化为血管内皮祖细胞。例如，通过去分化从成纤维细胞诱导分化的方法；从多能干细胞诸如ES细胞、iPS细胞等诱导血管内皮祖细胞的分化（WO2008/056779、WO 2009/035217等）等方法是已知的。这些血管内皮祖细胞可以单独使用或者可以组合使用其多种。作为本发明的血管内皮祖细胞，可以使用包含其他细胞的细胞混合物。例如，包含血管内皮祖细胞的骨髓细胞、外周血单核细胞、骨髓单核细胞等也可直接使用。

可以通过诸如以下方法的已知方法来制备血管内皮细胞，包括通过使用细胞表面标志物诸如CD31等的表达作为指标并使用磁珠和FACS而从活体血管组织分离细胞的方法；通过在诱导物诸如VEGF等存在下培养上述血管内皮祖细胞而诱导分化的方法，等等。另外，也可以诱导各种细胞分化为血管内皮细胞，并且已知，例如，血管内皮细胞的分化可以从成体干细胞诸如间质干细胞、源自干细胞的脂肪组织等；祖细胞诸如心肌祖细胞、神经元前体细胞等；多能干细胞诸如ES细胞、iPS细胞等诱导；等等。此外，作为血管内皮细胞的市售产品，人微血管内皮细胞（HMVEC）、人脐带血管内皮细胞（HUVEC）、人主动脉内皮细胞（HAEC、HAOEC）等是可以获得的。

成血管细胞是血管内皮祖细胞和造血干细胞的共同祖先细胞，并且可以通过使用细胞表面标志物诸如CD133、CD144、CD45等的表达作为指标而从活体血管组织制备，通过已知方法诸如使用磁珠和FACS等的分离方法。作为成血管细胞的细胞表面标志物的表达模式，例如，已报导了D133

作为本发明中要使用的血管形成细胞，可以使用源自要用由本发明生产方法所获得的细胞片层移植的患者组织或细胞，或者源自具有与该患者HLA型相匹配的HLA型的供体的细胞等等。作为本发明中要使用的血管形成细胞，血管内皮祖细胞是特别优选的。

作为优选用于自体移植用途的血管形成细胞，例如，患者的组织、由此采集的细胞、以及源自由患者体细胞所建立的iPS细胞（患者iPS细胞）的细胞是优选使用的，因为对患者的负担小。为了侵袭性更小，患者的外周血、由此采集的单核细胞、源自患者外周血单核细胞的细胞、源自患者iPS细胞的细胞等等是优选使用的。这些细胞可以使用源自患者的细胞通过前述方法进行制备。

作为优选用于异体移植的血管形成细胞，例如，优选使用源自具有与患者HLA型相匹配的HLA型的供体的细胞来抑制排斥。源自具有与患者HLA型相匹配的HLA型的供体的细胞包括：源自匹配患者HLA型的供体组织的细胞、由此采集的细胞、由具有与患者HLA型相匹配的HLA型的供体所建立的iPS细胞（HLA-匹配供体iPS细胞）等等。具有匹配HLA型的组织和细胞也可以从骨髓库、细胞库等获得。具体而言，具有显示出与其他HLA型低排斥的具有3基因座（HLA-A、HLA-B、HLA-DR）纯合的细胞优选作为供体细胞，因为它与许多患者的HLA型相匹配。

血管形成细胞层优选层压在视网膜色素上皮细胞层上，使得血管形成细胞层接触视网膜色素上皮细胞层的基底面。血管形成细胞层仅需要层压在视网膜色素上皮细胞层的至少一部分上。血管形成细胞相对于视网膜色素上皮细胞层的密度没有特别限制，并可以考虑移植部位脉络膜病况、对已有血液血管网的亲和力等方面来确定适当的密度。血管形成细胞相对于视网膜色素上皮细胞层的密度是，例如约1×10

作为层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层的步骤（层压步骤），可以利用已知方法作为层压多层细胞层的方法。这样的方法的例子包括以下方法：层压多层片层状细胞层的方法，包括将构成一层细胞层的细胞接种到另一片层状细胞层上的方法，包括将一层片层状细胞层放置到培养于培养容器中的另一细胞层上的方法，包括将构成一层细胞层的细胞接种到培养于培养容器中的其他细胞层上的方法，等等。在本发明中，优选层压两层细胞层，使得血管形成细胞层接触视网膜色素上皮细胞层的基底面。例如，将片层状视网膜色素上皮细胞层放置在培养于培养容器中的血管形成细胞层上，由此使血管形成细胞层接触视网膜色素上皮细胞层的基底面。通过在培养容器中层压各层而获得的细胞片层可以直接投入使用。

在本发明优选的层压步骤实施方案中，使用培养容器中的培养基接种血管形成细胞并在培养容器中培养形成血管形成细胞层，将分开形成的视网膜色素上皮细胞片层放置在血管形成细胞层上，以及将培养基吸出，由此层压这两层细胞层，使得血管形成细胞层接触视网膜色素上皮细胞层的基底面。前述培养基没有特别限制，只要它是能够维持培养血管形成细胞和视网膜色素上皮细胞的组合物。通常，可以使用用于血管形成细胞培养的培养基和用于血管内皮祖细胞培养的培养基两者。例如，作为用于血管内皮祖细胞培养的培养基，可以使用市售产品诸如EGM-2培养基（由Takara Bio制造）等。血管形成细胞接种后，优选静置细胞持续至少细胞粘附到培养容器表面上并形成血管形成细胞层所必需的时间（例如，约10 hr-24 hr），以及在必要时，可以设定约1天-3天的培养期以实现生长到达到所希望的细胞数。

本发明的生产方法可以进一步包含回收细胞片层的步骤，其中视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层是层压的（回收步骤）。回收细胞片层的方法没有特别限制，只要它可以回收片层同时保持片层结构，并且可以使用已知方法。这样的方法的例子包括以下方法：通过酶处理将细胞片层从培养容器分离的方法，使用不粘附培养容器的细胞的方法，包括通过使用表面已处理为细胞粘附性的培养容器而层压细胞层、并通过用酶等处理来分离所形成的细胞片层的方法，等等。在本发明中，当血管形成细胞粘附于培养容器表面上、并在层压步骤中固定时，视网膜色素上皮细胞层很容易层压在血管形成细胞层上。因此，以下方法是优选的：包括通过使用表面已处理为细胞粘附性的培养容器而层压细胞层，并将所形成的细胞片层从培养容器分离。在一个实施方案中，在表面已用温度响应性聚合物处理过的培养容器中形成细胞片层，并通过温度变化的处理来分离细胞片层。温度响应性聚合物是指具有以温度依赖方式变化的水合力的聚合物，以及例如，具有在0-80℃温度范围内变化的水合力的温度响应性聚合物描述于JP-A-2-211865中。具体而言，例如，它可以通过以下单体的均聚或共聚而获得。可使用的单体的例子包括（甲基）丙烯酰胺化合物、N-（或N,N-二）烷基取代的（甲基）丙烯酰胺衍生物，以及乙烯基醚衍生物。在共聚物的情况下，可以使用任何两种或更多种这些单体。此外，除了上述单体以外的的单体，与离子单体共聚以改善细胞的粘附性和生长、聚合物的移植或共聚、或者聚合物和共聚物的混合物都可以使用。温度响应性聚合物发生水合和脱水来响应温度变化，并且其温度范围为0℃-80℃，优选10℃-50℃，更优选20℃-45℃。优选的温度响应性聚合物是，例如，聚（N-异丙基丙烯酰胺）。聚（N-异丙基丙烯酰胺）是具有31℃的低临界溶液温度的聚合物。当它是游离形式时，它在不低于31℃的水中发生脱水，在此温度下，聚合物链凝固并且聚合物混浊了。反之，在低于31℃的温度下，聚合物链是水合的并且聚合物溶解在水中。当聚（N-异丙基丙烯酰胺）固定在培养容器表面上时，聚（N-异丙基丙烯酰胺）在不低于31℃时脱水，以及培养容器表面获得了疏水性并显示出对细胞（例如，血管形成细胞、视网膜色素上皮细胞）的粘附性。在低于31℃的温度下，聚（N-异丙基丙烯酰胺）是水合的，以及培养容器表面获得了亲水性并显示出对细胞的无粘附性。利用这样的温度响应性，在层压步骤中将细胞培养在不低于低临界溶液温度（对于聚（N-异丙基丙烯酰胺）为31℃）的温度（例如，37℃）下，以实现细胞片层粘附到培养容器上，在回收步骤中提供低于低临界溶液温度的温度（例如，20℃），以使得不应用酶处理就能够将细胞片层从培养容器中分离。涂有这样的温度响应性聚合物的培养容器描述于JP-A-2-211865、JP-A-05-192138、JP-A-2008-220354等中。另外，这样的培养容器是作为温度敏感的培养容器市售的（由Cellseed,、UpCell（注册商标）制造）。接种在培养容器中的血管形成细胞优选粘附于培养容器上，使得它们将肯定会转移到视网膜色素上皮细胞层上。

在优选的实施方案中，在不低于低临界溶液温度（31℃）的温度（例如，37℃）下，将血管形成细胞粘附培养在涂有聚（N-异丙基丙烯酰胺）的温度响应性培养容器中，以形成血管形成细胞层。然后，将分开制备的视网膜色素上皮细胞层（视网膜色素上皮细胞片层）层压在血管形成细胞层上，同时保持不低于低临界溶液温度的温度（例如，37℃），使得血管形成细胞层接触视网膜色素上皮细胞层的基底面。在不低于低临界溶液温度的温度（例如，37℃）下孵育足以使血管形成细胞层和视网膜色素上皮细胞层彼此粘附的时间后，将培养物冷却至低于低临界溶液温度的温度（例如，20℃），由此将所形成的细胞彼此从培养容器分离。进行冷却和分离，例如，通过吸出培养基，将具有低于低临界溶液温度的温度（例如，20℃）的培养基添加至培养容器中，将其静置从培养容器分离细胞片层所必需的时间（例如，不少于30 min），并回收所层压的细胞片层。培养基与层压步骤的优选实施方案中作为例子而列举的那些培养基相同。当添加冷却培养基后的静置时间太长，则细胞片层的分离会变得困难。因此，优选在添加培养基的一天之内回收片层。

本发明的生产方法还可以包含将血管形成处理应用到血管形成细胞层上的步骤。血管形成处理步骤可以是层压视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层步骤的预先步骤或后续步骤。血管形成处理可以通过已知方法来进行，以及例如，诱导管道形成的已知方法，诸如在诸如VEGF、IGF-1、PDGF等因子存在下在胶原凝胶中培养血管形成细胞的方法，将血管形成细胞层与基质胶相接触的方法等等都可以应用。由于视网膜色素上皮细胞分泌VEGF，因此也可以将视网膜色素上皮细胞培养物的上清液用于血管形成。

当应用血管形成处理时，构成血管形成细胞层中的所有血管形成细胞都可具有血管结构，或者仅其一部分可具有血管结构。在血管形成细胞层中，希望的是构成具有适于体内移植部位的环境的结构的血管。例如，当将由本发明的生产方法所获得的细胞片层在没有任何从体外到体内血管形成处理且没有血管结构的情况下进行移植时，所移植的血管形成细胞自发地在体内形成血管，在此过程期间，血管被连接到已有血管上而容易地形成功能性血液血管网。另一方面，当脉络膜上的损伤较大且残留血管在数量上显著少时，基于所移植血管结构的血液血管网的重建可以优选通过应用血管形成处理到血管形成细胞层上来促进。

血管形成细胞层可以包含一种或多种除血管形成细胞之外的细胞，例如，支持血管形成或血管发生的细胞诸如造血干细胞等，除血管内皮细胞之外的血管构成细胞诸如血管平滑肌细胞、血细胞等，等等。血管形成细胞层可以进一步包含除细胞之外的组分，例如，促进血管发生的因子，等等。

本发明中要使用的视网膜色素上皮细胞可以是从眼球直接采集的原代细胞，或者几次传代后的细胞。原代视网膜色素上皮细胞可以通过已知方法进行分离。例如，在眼球来源的视网膜色素上皮细胞的情况下，分离尸体眼球，迅速在赤道部分开，除去玻璃体和视网膜并在必要时用胶原酶、透明质酸酶等处理，通过使用细胞刮刀刮取、或者用胰蛋白酶或EDTA溶液处理以从布鲁赫膜（Bruch's membrane）释放细胞来收集细胞，在培养基中静置以诱导粘附于培养皿上并生长，以及将以所要求的数量生长的细胞用胰蛋白酶处理等而适当传代，以充分地确保细胞数量。

此外，这些细胞也可以是通过诱导未分化的多能干细胞（诸如胚胎干细胞（ES细胞）、经诱导的多能干细胞（iPS细胞）等）、包括成体干细胞诸如神经干细胞等的干细胞、或者包括神经祖细胞和视网膜祖细胞的祖细胞的分化而获得的细胞。ES细胞还可以是通过体细胞的核重编程而产生的ES细胞。另外，作为干细胞，目标细胞可以通过诱导近年所报导的经诱导的多能干细胞（iPS细胞）的分化进行制备。 iPS细胞是体细胞来源的经诱导的干细胞，其具有等同于ES细胞的那些性质，可以通过将特定的核重编程物质（核酸、蛋白质、低分子量化合物等）引入到体细胞中来产生[Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126:663-676 (2006); Takahashi, K. et al., Cell, 131:861-872 (2007)]。用于将前述干细胞分化为目标分化细胞的条件和培养基可以遵循常规已知的条件和培养基，或者可以由本领域普通技术人员适当确定。在本发明中，通过诱导干细胞或祖细胞（优选多能干细胞）的分化而获得的细胞优选用作要用于细胞片层的视网膜色素上皮细胞，这是因为可以制备适当成熟阶段的视网膜色素上皮细胞，以及特别地，可以制备比较不成熟的视网膜色素上皮细胞，并可以有利地形成细胞片层。另外，当由本发明生产的细胞片层是用于移植时，使用iPS细胞是优选的，因为使用接受移植的对象的体细胞（作为iPS细胞的来源）而获得的细胞片层，不会对该对象具有抗原性。当诱导干细胞分化时，例如，将人ES细胞或者多能干细胞诸如iPS细胞等培养在ES细胞分化培养基中，该培养基中添加有Wnt拮抗剂诸如DKK-1、CKI-7等以及Nodal拮抗剂诸如Lefty A、SB-431542等。当培养规定期间时，表达视网膜祖细胞标志物Rx、Pax6和Mitf，以及人视网膜色素上皮细胞可以通过用光学显微镜进行形态观察、通过确认具有多边形形状和色素的细胞来获得[Neuroscience Letters 2009年7月24日 458(3) 126-31, Journal of Cell Science 2009年9月1日 122(Pt 17) 3169-79]。

本发明的视网膜色素上皮细胞层是由排列在平面上的视网膜色素上皮细胞层构成的，并且例如，可以由包含通过已知方法生产的视网膜色素上皮细胞的细胞片层所构成。作为这样的细胞片层（视网膜色素上皮细胞层）的生产方法，例如，描述于WO 2011/142364中的方法是已知的。

本发明细胞片层的优选实施方案是这样的细胞片层，其中视网膜色素上皮细胞层是通过包括以下步骤的方法（下文将称为“胶原方法”）所生产的：

（1）将视网膜色素上皮细胞接种并培养在胶原凝胶上以形成由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层，以及

（2）用胶原酶降解所述胶原凝胶以分离由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层。

尽管要在步骤（1）中接种的视网膜色素上皮细胞可以是源自任何哺乳动物的细胞，只要它源自哺乳动物（例如，人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等），优选源自人的细胞。

在胶原方法中，视网膜色素上皮细胞是通过接种在胶原凝胶上进行培养的。用于胶原凝胶的胶原可以是任何胶原，只要它源自哺乳动物（例如，人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等），以及例如，使用人或猪来源的胶原。源自胶原的组织的例子包括腱、皮肤等。尽管胶原种类可以是任何种类，构成人基底膜的胶原之外的一种是优选的，IV型胶原之外的一种是特别优选的。在这些胶原中，I型胶原是优选使用的。尽管胶原凝胶可以通过例如常规已知的生产方法进行生产，在本发明中，由胶原纤维网所构成的凝胶是通过诱导胶原的纤维发生进行生产的，如在下述实施例中所描述的。由于纤维化胶原具有组合的强度和柔韧性，其易于处理，显示出细胞增殖和细胞分化的良好维持，以及优选作为本发明中要使用的胶原凝胶。另外，要在本发明中使用的胶原需要将接种在胶原凝胶上的细胞维持在凝胶表面而不使它们沉入凝胶层。作为胶原，因此，优选的是其中凝胶具有细胞增殖所需强度的胶原，以及例如，具有大量分子间交联的胶原是优选的。作为这样的胶原，可以提及源自腱的胶原。

尽管前述胶原凝胶的胶原浓度可以在任何范围，只要它能提供的凝胶具有允许视网膜色素上皮细胞植入和生长的强度、以及令人满意的促进胶原酶降解的溶解性、使得易于操作的粘度等等，但是优选0.1% (W/V)-0.5% (W/V)，更优选0.2% (W/V)-0.3% (W/V)。当胶原凝胶的胶原浓度低于0.1% (W/V)时，胶原凝胶的强度变得不足，并且因此，视网膜色素上皮细胞的定殖率和细胞增殖率都会降低。当胶原凝胶的胶原浓度超过0.5% (W/V)时，胶原酶处理降解胶原凝胶的时间变长，这恐怕会对细胞产生不良影响。

尽管用于生产前述胶原凝胶的胶原凝胶混合溶液的体积随细胞培养所用培养面积和培养基材形状而变化，但是优选约100 μl-约250 μl，更优选约150 μl-约200 μl，每单位面积（cm

在步骤（1）中，由视网膜色素上皮细胞所构成的细胞片层可通过在细胞培养基材的胶原凝胶上接种并培养前述视网膜色素上皮细胞进行生产。本发明中的细胞培养基材没有特别限制，只要它是用于细胞培养的。其例子包括具有多孔膜的培养容器诸如transwell等、烧瓶、组织培养瓶、平皿、培养皿、组织培养皿、多皿、微量培养板、微孔板、多板、多孔板、腔室玻片、培养皿、管、托盘、培养袋和转瓶。具有多孔膜的培养容器是优选的，因为方便进行胶原酶处理和细胞片层的切割操作。例如，市售的transwell是优选使用的。本说明书中的细胞培养基材材料的例子包括，但不限于，无机材料诸如金属、玻璃、陶瓷、硅等，由弹性体、塑料（例如，聚酯树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂、尼龙、丙烯酸树脂、氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、酚醛树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、氯乙烯树脂）所代表的有机材料。

要接种的视网膜色素上皮细胞的数量可以是任何范围，只要它是能够形成细胞片层的细胞密度。然而，当细胞密度太低时，细胞形状不好，达到汇合之前的培养时间长，以及进一步地，细胞成熟并着色所需的时间长。当细胞密度太高时，类似地，细胞增殖被抑制，达到汇合之前的培养时间往往变长，并且细胞可能死于过于拥挤。因此，要接种细胞的密度优选为约4.5×10

由视网膜色素上皮细胞所构成的单层细胞群（细胞片层）可以通过在培养基中培养接种在胶原凝胶上的视网膜色素上皮细胞而形成。可以使用的培养基没有特别限制，只要它是通常用于相关领域中的细胞培养培养基。例如，描述于Asakura Shoten出版的“Japan tissue culture conference ed., Technique of Tissue Culture 3rdedition”第581页的基本培养基都是可以使用的，诸如F-10培养基、F12培养基、MEM、BME培养基、DMEM、αMEM、IMD培养基、ES培养基、DM-160培养基、Fisher培养基、WE培养基、RPMI1640培养基等。而且，血清（胎牛血清等）、各种生长因子（EGF、FGF、HGF、PDGF等）、抗生素、氨基酸等都可以添加到基本培养基中。培养基的pH优选为约6-约8。对于培养而言，例如，原代培养通常在约30-约40℃进行约15-约60 hr，直至视网膜色素上皮细胞形成汇合。此后，进行继代培养约1周-约2个月，同时改变培养基，在此之后，必要时同时通气并搅拌而进行培养，直至细胞片层的形成。将构成由这样的培养所获得的细胞片层的细胞维持为视网膜色素上皮细胞。细胞作为视网膜色素上皮细胞的维持可以通过检测作为特异性分化标志物的BEST1、RPE65、MERTK、CRALBP等来确认。

由于步骤（1）中形成的细胞片层粘附于胶原凝胶，例如，当它被直接用于移植等的时候，就会担心胶原凝胶妨碍在移植受体中的植活。另外，令人担心的是胶原凝胶可能妨碍血管形成细胞层和视网膜色素上皮细胞层的结合和粘附。如果可以预先除去胶原凝胶，这有助于解决这样的问题。在本发明的步骤（2）中，将粘附于步骤（1）中所形成细胞片层的胶原凝胶通过胶原酶降解。本领域普通技术人员可根据用于制备胶原凝胶的胶原种类选择适当的胶原酶。尽管用于降解胶原凝胶的胶原酶没有特别限制，只要它具有消化胶原凝胶的活性，但不易降解构成人基底膜的胶原的胶原酶（例如，IV型胶原等）是优选的。例如，可以使用源自从梭菌（溶组织梭菌（Clostridium histolyticum））或链霉菌（微细链霉菌（Streptomycesparvulus））所诱导的微生物的胶原酶，它们是在商业水平供应的、安全的并具有高酶活性。

作为上述胶原酶活性，相对于胶原凝胶中的胶原重量的比活性是重要的，而不是每单位重量胶原酶的活性和每单位体积胶原酶水溶液的活性。用于溶解胶原凝胶的胶原酶比活性（胶原酶活性/胶原重量）优选不低于0.1 U/mg。当胶原酶的比活性低于0.1 U/mg时，胶原凝胶的溶解可能要不利地花太长时间，或者凝胶可能不利地未充分溶解。更优选的是0.1-10,000 U/mg的范围，进一步优选1-3,000 U/mg。

在胶原方法中，让胶原酶作用于胶原凝胶的方法没有特别限制。使用培养基或具有缓冲能力的等渗溶液作为溶剂而制备的胶原酶溶液可以添加到培养基中，或者从细胞培养皿分离的粘附有细胞的胶原凝胶可以浸入前述胶原酶溶液中。由于transwell用作本发明中的细胞培养基材，胶原凝胶层可以通过回收小室（insert）并除去小室底部上的膜而暴露，并且暴露的胶原凝胶优选直接浸入上述胶原酶溶液中。

在胶原方法中，通过胶原酶溶解胶原凝胶的时间没有特别限制。当胶原酶起作用的时间太长时，细胞功能诸如粘附能力、增殖能力等可能不利地降低。尽管经胶原酶溶解的时间会由于胶原酶比活性、温度、胶原凝胶形状、胶原酶处理方法等而发生变化，但其通常为15 min-60 min。胶原酶处理可以是单次处理或进行多次。

胶原方法中经胶原酶处理胶原凝胶期间的温度优选设定在10-42℃的范围，更优选30-40℃，进一步优选36-38℃，这是因为当活有机体内的温度变低不少于10℃时（在人类中约30℃）时，细胞的细胞质流动性通常会降低，并且代谢能力会降低，当温度超过42℃时，蛋白质会变性且细胞功能会降低，以及胶原酶的最适温度大多是37℃，且低于这个水平的温度会延长溶解时间。

在胶原方法中，当胶原凝胶的溶解进行时，细胞片层逐渐从凝胶上分离，并最终释放在胶原酶溶液中。为回收细胞片层，可以将细胞片层从剩余凝胶上机械分离，或者可以在凝胶完全溶解后进行回收。尽管机械分离缩短了细胞片层回收的时间，但是由于细胞片层可能被破坏，优选在凝胶完全溶解后进行回收。

尽管如上所述回收的细胞片层可以直接用于血管形成细胞层的层压步骤，但是由于残余胶原酶可能抑制对血管形成细胞层的粘附，优选用培养基或具有缓冲能力的等渗溶液进行冲洗。清洗期间的温度可以根据经胶原酶的胶原凝胶溶解处理来确定。为充分除去残余的胶原酶，优选将片层用培养基或具有缓冲能力的等渗溶液冲洗一次或多次。

在由通过胶原方法所获得的视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层中，特异于视网膜色素上皮细胞的细胞因子以与活生物体中类似的极性进行分泌，以及细胞间紧密粘附结合指标的跨上皮电阻（TER）如活生物体内那样上升。因此，它具有类似于活生物体内的细胞层屏障功能。根据胶原方法，可以获得由视网膜色素上皮细胞构成并具有类似于活生物体内的那些功能的细胞片层。

在通过胶原方法所获得的细胞片层中，在视网膜色素上皮细胞之间形成了紧密连接，并且在与胶原凝胶的接触面上形成了基底膜。在本说明书中，“基底膜”是从视网膜色素上皮细胞所产生的组分而形成的膜，以及意指包含至少一部分基底膜组分的膜（后文称为“视网膜色素上皮细胞基底膜”）。活生物体中视网膜色素上皮细胞的基底膜是作为视网膜色素上皮细胞层和构成布鲁赫膜的内胶原层之间的薄膜而存在的，并且是具有IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（perlecan）、巢蛋白等作为代表性组分的细胞外基质。布鲁赫膜是视网膜色素上皮细胞层和脉络膜之间的薄膜，并具有视网膜色素上皮细胞基底膜、内胶原层、弹性蛋白层、外胶原层、以及脉络膜毛细血管板基底膜的5层结构。由通过胶原方法所获得的视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层包含布鲁赫膜结构的一部分（视网膜色素上皮细胞基底膜）。紧密连接的形成可以通过观察六边形紧密粘附的细胞形式、以及通过免疫染色观察细胞之间紧密连接蛋白（occludin）、ZO-1等的表达来确认。基底膜的形成可通过免疫染色观察基底膜标志物诸如层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（perlecan）、巢蛋白、或IV型胶原等在细胞表面上的表达，或者用扫描电子显微镜观察来确认。

通常，培养在培养皿上的视网膜色素上皮细胞会产生基底膜组分，但很难将细胞以可用的视网膜色素上皮细胞片层的形式从培养皿上分离（Invest.Ophthalmol.Vis.Sci., 36(2), 1995, 381-390）。根据胶原方法，视网膜色素上皮细胞与由视网膜色素上皮细胞所生产的基底膜一起可以作为片层回收，而不利用人工膜。由于视网膜色素上皮细胞形成单层结构，因此当它们被单独处理时，片层结构会解体，以及细胞会分散成细胞单元。因此，其作为片层的移植是极困难的。另一方面，由于由通过胶原方法所获得的视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层伴随有基底膜，并具有足够的刚度，所以在回收期间不易起皱，这使得其处理非常容易。结果，由于血管形成细胞层的层压操作能够平稳进行，以及安装细胞移植器件和移植操作都能够平稳进行，因此细胞移植可以以最小侵入进行，以及效果和预后两者都预期得到改善。另外，由于由通过胶原方法所获得的视网膜色素上皮细胞所构成的细胞片层伴随有基底膜，因此对于其中基底膜同时患病的疾病中的移植来说是极为有利的。例如，年龄相关性黄斑变性有时伴随有布鲁赫膜病。当将通过胶原方法所获得的视网膜色素上皮细胞片层用作本发明上述生产方法中的视网膜色素上皮细胞层时，由该方法生产的细胞片层的基底膜补偿了病性部分，由此细胞片层的植活率能够得到改善，并且其治疗效果也可预期。因此，在本发明的生产方法中，当将通过胶原方法获得的视网膜色素上皮细胞片层用作视网膜色素上皮细胞层时，所生产的细胞片层优选作为用于带有病性基底膜的疾病的移植的片层，并且可以优选用作特别是靶向年龄相关性黄斑变性的移植片层。

胶原方法可进一步包含以下步骤（3）：

（3）确认已分离的细胞片层和胶原凝胶之间的接触面上基底膜的存在与否。

在步骤（3）中，具有由视网膜色素上皮细胞和基底膜所构成的细胞层的细胞片层的形成可通过细胞片层基底膜的存在与否来确认。基底膜的存在与否可通过类似于基底膜形成的前述确认方法进行确认，例如，基底膜标志物的表达、用扫描电子显微镜观察等等。对于基底膜检测来说，基底膜标志物的表达可以在细胞的任何部位（例如，细胞质、细胞膜、核膜等）进行确认。优选地，在与胶原凝胶的接触面上表达的标志物是目标。

本说明书中的基底膜标志物包括在基底膜中特异性表达的基因的转录产物、翻译产物或降解产物。这样的基因的例子包括层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（perlecan）、巢蛋白、IV型胶原等。其中，层粘连蛋白、IV型胶原等是优选使用的，它们是基底膜的主要组分。

用于“确认已分离的细胞片层和胶原凝胶之间的接触面上基底膜的存在与否”的样品没有特别限制，只要它包含源自步骤（2）所分离的细胞片层（或细胞）的基底膜标志物（例如，RNA、蛋白质、其降解产物等）。

当上述样品是RNA时，基底膜标志基因表达的检查可以通过从步骤（2）分离的细胞片层的细胞制备RNA（例如，总RNA、mRNA）级分、并检测级分中所包含的标志基因的转录产物，或者直接检测细胞中的标志基因产物而不从细胞中提取RNA。

当从细胞制备RNA（例如，总RNA、mRNA）级分时，它可以使用已知方法诸如胍-CsCl超离心法、AGPC法等进行制备。使用市售的RNA提取试剂盒（例如，RNeasy Mini Kit；由QIAGEN等制造），可以迅速且方便地从痕量样品制备高纯度的总RNA。检测RNA级分中基底膜标志基因转录产物的方法的例子包括使用杂交（Northern印迹、斑点印迹、DNA芯片分析等）的方法，使用PCR（RT-PCR、竞争性PCR、实时PCR等）的方法等。定量PCR方法诸如竞争性PCR、实时PCR等是优选的，因为基底膜标志基因的表达变化可以从痕量样品迅速且方便地检测到，并且DNA芯片分析是优选的，因为多个标志基因的表达变化可以全部检测到，并且还可以通过选择检测方法来改善定量性能，等等。

当采用Northern印迹或斑点杂交时，基底膜标志基因可以使用能与该基因的转录产物杂交的核酸（探针）进行检测。这样的核酸的例子包括能在高严谨条件下与基底膜标志基因的转录产物杂交的核酸。“高严谨条件”的例子包括在45℃下于6×SSC（氯化钠/柠檬酸钠）中的杂交反应，接着在65℃下于0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次，等等。本领域普通技术人员可以通过适当改变杂交溶液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针长度、错配数、杂交反应时间、洗涤的盐浓度、洗涤温度等而容易地调节到所希望的严谨度。核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA嵌合体，优选DNA。

要作为探针使用的核酸可以是双链的或单链的。当为双链时，它可以是双链DNA、双链RNA或者DNA:RNA杂合体。当为单链时，可以使用反义链。尽管核酸的长度没有特别限制，只要它能够与靶核酸特异性杂交，它是例如不少于约15个碱基，优选不少于约30个碱基。为了靶核酸能够检测和定量，要用作探针的核酸优选进行标记。标记试剂的例子包括放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的例子包括[

当采用Northern杂交时，将如上所述制备的RNA级分通过凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯等的膜上，在上述“高严谨条件”下于包含如上所述制备的标记探针的杂交缓冲液中杂交，并通过合适方法测量每个条带结合到膜上的标志物的量，由此可以测量每个基底膜标志基因的表达水平。并且在斑点印迹的情况下，将用RNA级分点过的膜进行类似的杂交反应（对每个标志基因都进行），并测量斑点处的标志物的量，由此可以测量每个标志基因的表达水平。

当采用DNA芯片分析时，例如，通过逆转录反应引入合适启动子诸如T7启动子等的cDNA是从如上所述制备的RNA级分合成的，cRNA是使用RNA聚合酶（在这种情况下，标记的cRNA是通过使用标记有生物素等作为底物的单核苷酸而获得的）合成的。将标记的cRNA与其上固定有上述探针的芯片相接触以进行杂交反应，并测量固相上与每个探针结合的标志物的量，由此可以测量每个基底膜标志基因的表达水平。这种方法就快速性和便利性而言是有利的，因为所检测的分化标志基因的数量（因此，被固相化的探针）增加了。

另一方面，当不从细胞中提取RNA而检测标志基因时，原位杂交可以用作检测手段。在该方法中，通过用固定剂处理细胞将细胞固定，固定剂优选沉淀固定剂例如丙酮，或者通过在缓冲甲醛溶液中短时间孵育细胞，而不从细胞中提取RNA。imrecruitment后，将细胞包埋在石蜡中以形成块，并且由此切出的切片可以用作样品。良好制备的石蜡包埋的样品可以在室温下保存很多年。作为要用作探针的核酸，可以使用类似于上述例子的那些。原位杂交在本发明中是优选使用的，因为能够直接确认细胞和胶原凝胶之间的接触面上的基底膜标志物的表达。

可选地，步骤（2）的已分离细胞片层中基底膜标志物的表达可以通过制备来自细胞片层（或细胞）的蛋白质级分、并检测级分中所包含的标志基因的翻译产物（即，标志蛋白）进行确认，或者直接检测细胞片层（或细胞）中的标志基因的翻译产物、而不从细胞片层（或细胞）中提取蛋白质。标志蛋白可以通过免疫学测量方法（例如，ELISA、FIA、RIA、Western印迹等）使用每种蛋白质的抗体进行检测，以及在显示可测量的生理活性的蛋白质诸如酶等的情况下，它可以通过已知方法测量各标志蛋白的生理活性进行检测。可选地，标志蛋白还可以通过质谱法诸如MALDI-TOFMS等进行检测。

每种标志蛋白的抗体可以根据通常使用的多克隆抗体或单克隆抗体生产技术、并使用标志蛋白或蛋白质或其部分肽作为免疫抗原来获得。

当各免疫学测量方法分别应用于本发明时，特殊条件、操作等的设定是不必要的。基底膜标志蛋白的测量系统可以通过在每种方法的一般条件和操作方法中加入本领域普通技术人员的一般技术考虑进行构建。对于这些一般技术手段的细节，可以参考综述（compendia）、书籍等。例如，可以参考Hiroshi Irie主编的 “Radioimmunoassay”（Kodansha, 1974年出版），Hiroshi Irie主编的“cont. Radioimmunoassay”（Kodansha,1979年出版），Eiji Ishikawa等主编的“Enzyme Immunoassay”（Igaku-Shoin, 1978年出版），Eiji Ishikawa等主编的“Enzyme Immunoassay”（第2版）（Igaku-Shoin, 1982年出版），Eiji Ishikawa等主编的“Enzyme Immunoassay”（第3版）（Igaku-Shoin, 1987年出版），“Methods in ENZYMOLOGY”第70卷（Immunochemical Techniques（A部）、同上第73卷（Immunochemical Techniques（B部））、同上第74卷（Immunochemical Techniques（C部））、同上第84卷（Immunochemical Techniques（D部：Selected Immunoassays））、同上第92卷（Immunochemical Techniques（E部：Monoclonal Antibodies and General ImmunoassayMethods））、同上第121卷（Immunochemical Techniques（I部：Hybridoma Technology andMonoclonal Antibodies））（都由Academic Press出版）等等。

血管形成细胞层可以直接层压在前述视网膜色素上皮细胞层上，或者血管形成细胞层可以经由其他层进行层压。在本发明中，视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层优选直接层压。

本发明还涉及包含视网膜色素上皮细胞层和血管形成细胞层的细胞片层，其通过本发明的上述生产方法获得。本发明的细胞片层优选包含由通过干细胞或祖细胞的从体外到体内分化诱导而获得的视网膜色素上皮细胞所形成的细胞层以及血管形成细胞层。当视网膜色素上皮细胞层通过上述胶原方法生产时，本发明的细胞片层进一步包含从视网膜色素上皮细胞层所分泌的基底膜。本发明的细胞片层优选作为用于眼科疾病患者的视网膜治疗的移植材料。眼科疾病的例子包括脉络膜视网膜变性疾病诸如年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、糖尿病视网膜病变、视网膜脱离、视网膜中央动脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、脉络膜萎缩、视网膜色素上皮脱离、葡萄膜炎（Behcet病、Harada病等）、过度近视（病理性近视）等。

由于本发明的细胞片层包含血管形成细胞层，因此它可以对同时涉及病性脉络膜的疾病以高植活率进行移植。因此，通过本发明生产方法获得的细胞片层优选用于治疗上述作为例子的脉络膜视网膜变性疾病，其中特别是与脉络膜视网膜萎缩相关的眼科疾病，对于它们，视网膜色素上皮细胞的排他移植不易提供治疗效果（年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、脉络膜萎缩、视网膜色素上皮脱离、葡萄膜炎（Behcet病、Harada病等）以及过度近视（病理性近视）等）。

另外，由于本发明的细胞片层具有从类似于活生物体的那些组分制备的基底膜，因此它也可以用于各种筛选目的，诸如前述眼科疾病中的疗效筛选、毒性评价等。对于前述眼科疾病的疗效筛选，例如，可以将本发明的细胞片层应用于筛选对前述眼科疾病具有效果的物质，根据JP-A-2007-500509中所描述的方法进行。具体而言，本发明的细胞片层在候选物质存在或不存在下进行培养，所述候选物质在可能引起前述眼科疾病的应激条件下（例如，光（例如，白光、蓝光；诱导视网膜细胞特别是感光细胞死亡的光），并且可以是黄斑变性激发因子），A2E[类视色素（retinoid）N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺]（A2E的累积被认为促成了视网膜细胞的年龄相关性神经变性，特别是黄斑变性的表达），香烟烟雾聚集物（吸烟被认为是黄斑变性的危险因素），外部压力（例如，流体静力压；眼内压的增加被怀疑与青光眼有关））具有效果，并且可以基于表达视紫红质的光感受器的数量并通过使用抗半胱天冬酶3（caspase 3）抗体的免疫染色进行评价。对于毒性评价，本发明的细胞片层可根据JP-A-2007-517210中所描述的方法应用于筛选毒性物质。具体而言，本发明的细胞片层在毒性候选物质存在或不存在下进行培养，并使用JP-A-2007-517210中所描述的整联蛋白标志肽，在488 nm波长下用激光激发，并检测520 nm下的荧光进行评价。而且，本发明的细胞片层还可以用作体外模型，用于评价视网膜色素上皮细胞的各种体内功能，诸如与视觉细胞维持相关的功能诸如光感受器外节的吞噬能力、神经保护作用等，视网膜血管屏障功能诸如泵送作用、紧密连接等。

本发明用于移植的细胞片层可以用于人类和除人之外的哺乳动物（例如，猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等）中上述疾病的治疗。

本发明用于移植的细胞片层可以应用的疾病面积的范围是根据施用对象的目标疾病、动物种类、年龄、性别、体重以及症状等等而适当确定的。

本发明用于移植的细胞片层可以一次性或者分几部分进行移植。移植的应用次数是由卫生保健专业人员根据疾病和准则进行确定的。例如，当疾病是年龄相关性黄斑变性疾病时，本发明用于移植的细胞片层可以视其严重性进行两次或更多次移植。当移植进行多次时，间隔时间没有特别限制，并且可以安排数天至数周的期间。

本发明用于移植的细胞片层是由卫生保健专业人员根据符合准则的适当移植方法进行移植的。当本发明用于移植的细胞片层在视网膜下移植时，可以采用的移植方法包括：将片层在来自穿刺注射针的水流上进行递送，直到眼球视网膜下的移植部位，或者也可以使用专用于移植的治疗装置。

具体实施方式

实施例

通过参考实施例对本发明进行如下更详细的解释，实施例仅为示例，且不以任何方式限制本发明的范围。

作为要在下面的生产实施例2中使用的视网膜色素上皮细胞，所使用的是通过诱导人iPS细胞的分化而获得的成熟视网膜色素上皮细胞（253G1、K11PD2、59M8、59SV2、59SV3、59SV9、46a、K21EV15、101EV3、K11EV9、454E2），以及通过诱导ES细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞（hES、CMK6），根据Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131中所描述的方法进行。

<人iPS来源的视网膜色素上皮细胞>

253G1是通过源自健康人的人iPS细胞（253G1）的分化诱导而获得的视网膜色素上皮细胞，如Nature Biotechnology 26, 101-106, 2008中所描述的。

59SV2、59SV3和59SV9是通过诱导源自同一色素性视网膜炎患者的人iPS细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞。iPS细胞是通过如下方法建立的，所述方法包括通过使用仙台病毒将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc引入到人皮肤来源的成纤维细胞中，根据Proc.Jpn.Acad., Ser.B 85 (2009) 348-362中所描述的方法进行。

K21EV15、101EV3、K11EV9和454E2是通过诱导源自互不相同的色素性视网膜炎患者的人iPS细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞。 iPS细胞是通过如下方法建立的，所述方法包括通过使用附加型载体将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和LIN28引入到人皮肤来源的成纤维细胞中，根据Nat Methods.2011年5月; 8(5):409-12中所描述的方法进行。

<猴iPS来源的视网膜色素上皮细胞>

46a是通过诱导猴（食蟹猴）iPS细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞，根据Jpn.J. Transplant.44 (2009) 231-235中所描述的方法进行。

hES是通过诱导人ES细胞系khES-1的分化而获得的视网膜色素上皮细胞。 CMK6是通过诱导猴ES细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞，根据Neuroscience Letters 458(2009) 126-131中所描述的方法进行。

<胶原凝胶混合溶液的制备>

制备以下溶液A、溶液B和溶液C。

溶液A：猪腱来源的酸溶性I型胶原Cellmatrix I-A（Nitta Gelatin, 3.0 mg/ml），

溶液B：5倍浓度的浓缩培养基[DMEM/F12（Invitrogen，12500-062，3 g）溶于MilliQ水中，并且过滤器处理总体积（50 ml）]，以及

溶液C：用于重构的缓冲液

[1N的NaOH（50 mM，5 ml）、NaHCO

在冷却下，将溶液B（2体积）与溶液A（7体积）不鼓泡混合（浅黄色）。然后，添加溶液C（1体积），并将混合物混合（淡粉色），得到0.21％的胶原凝胶混合溶液。

<视网膜色素上皮细胞片层的制备>

将0.21％的胶原凝胶混合溶液（200 μl）添加到12 mm的transwell小室（0.4 μmPore Polyester膜；Corning，3460）的小室中，并将混合物在37℃孵育30 min。然后，将F10-10％FBS [F-10（Sigma，N6908，445 ml）、FBS（50 ml）、青霉素-链霉素（Invitrogen，15140-122，5 ml）] 1500 μl添加到小室外部以及500 μl添加到小室内部，并将transwell在37℃孵育24 hr。其后，将小室的内部和外部用F10-10％FBS洗涤一次，将生产实施例1中获得的视网膜色素上皮细胞接种5×10

<切除>

从培养开始进行6周后，除去小室的膜，在小室下添加胶原酶L（Nitta Gelatin，PBS(+)：Sigma，2600 U/ml，100 μl），以及将小室在37℃孵育60 min，并用PBS（+）洗涤3次。滴加SFRM-B27以使视网膜色素上皮细胞片层不会变干，并用PALM MicroBeam（ZEISS）切成所希望的大小。

<特性>

通过组织切片的免疫组织化学，确认了所制备的细胞片层具有以下结构，其中视网膜色素上皮细胞片层由基底膜（层粘连蛋白、IV型胶原阳性）下包被，该片层中形成了紧密连接（ZO-1阳性），并且用于片层形成的I型胶原没有残留（I型胶原阴性）。

实施例1 血管内皮祖细胞层和视网膜色素上皮细胞层的层压细胞片层的生产

<血管内皮祖细胞的制备>

使用内皮细胞培养试剂盒-2（EGM-2培养基（包含2％FBS）；由Takara Bio制造，B3162），将人血管内皮祖细胞（ECFCs；由Takara Bio制造，PT056）以1.3×10

<血管内皮祖细胞在视网膜色素上皮细胞片层上的堆叠>

经过15 hr后，将生产实施例1中所获得的人iPS细胞来源的视网膜色素上皮细胞片层放在温度响应性培养皿中的血管内皮祖细胞上。将培养基轻轻吸出，并将细胞片层安排置于温度响应性培养皿中央。此后，为防止变干，添加20℃下的100μl的 EGM-2培养基，并将混合物静置30 min，以将培养皿表面上的温度响应性聚合物转变成亲水性的，从而分离细胞片层。

用EGM-2培养基洗涤细胞片层一次，并将所获得的细胞片层转移到用于粘附细胞的培养皿（Lumox dish 35；由Greiner制造，077331；底面可以通过用解剖刀切割而除去）中。使用激光显微切割（PALM MicroBeam；由ZEISS制造），并将细胞片层切成所希望的大小以得到这样的细胞片层，其中人血管内皮祖细胞和人视网膜色素上皮细胞是层压的。

实施例2 细胞片层移植

将实施例1中获得的层压细胞片层经皮下移植到NOD/SCID小鼠的背阔肌中。一周后制备组织切片。通过使用抗CD31抗体（内皮细胞）、抗HLA-1抗体（移植的人细胞）和DAPI的免疫组织化学，观察到了移植的细胞片层的植入以及源自移植细胞的血管结构的形成（在图1中，箭头“毛细管（供体）”）。结果证实，血管内皮祖细胞在移植后成熟为内皮细胞，并且可以形成血管。

实施例3 细胞片层移植

将实施例1中获得的层压细胞片层移植到具有部分缺失的视网膜色素上皮细胞和脉络膜的兔视网膜下。一周后制备组织切片。通过使用抗CD31抗体（内皮细胞）、抗HLA-1抗体（移植的人细胞）和DAPI的免疫组织化学，能够确认移植的细胞片层的植入以及源自移植细胞的血管形成。

比较实施例1

将生产实施例2中获得的人视网膜色素上皮细胞片层（没有人血管内皮祖细胞）移植到具有部分缺失的视网膜色素上皮细胞和脉络膜的兔视网膜下。一周后制备组织切片。通过使用抗CD31抗体（内皮细胞）、抗HLA-1抗体（移植的人细胞）和DAPI的免疫组织化学，发现片层结构被破坏了，检测到了分散方式的少量移植细胞，与实施例3相比，观察到了显著降低的移植细胞植活率的现象。

参考实施例1. 血管形成

通过在包含VEGF的培养基中培养的血管内皮祖细胞形成血管是通过以下方法确认的。

（培养基）

“EM”：EGM-2培养基（包含2％FBS；由Takara Bio制造，B3162）

“F10”:F10-10％FBS（F-10（Sigma，N6908）445 ml，FBS 50 ml，青霉素-链霉素（Invitrogen，15140-122）5 ml）。通过使用该培养基作为血管形成培养基而获得的结果显示为图2中的“F10”。

“F10-1”:将生产实施例2中生产的视网膜色素上皮细胞片层放在12 mm的transwell小室（0.4 μm Pore Polyester膜；Corning，3460）的小室中，并分别添加F10-10％FBS到小室内部和外部500 μl、1500 μl。将细胞片层培养一天，并回收培养上清液。通过使用该培养上清液作为血管形成培养基而获得的结果显示为图2中的“F10-1”。

“F10-2”:将生产实施例2中生产的视网膜色素上皮细胞片层放在12 mm的transwell小室（0.4 μm Pore Polyester膜；Corning，3460）的小室中，并分别添加F10-10％FBS到小室内部和外部500 μl、1500 μl。将细胞片层培养两天，并回收培养上清液。通过使用该培养上清液作为血管形成培养基而获得的结果显示为图2中的“F10-2”。

（血管形成）

使用上述4种培养基，将人血管内皮祖细胞（ECFCs；由Takara Bio制造，PT056）以1.3×10

测量所使用的4种培养基中VEGF的浓度。结果，EM为1.44 ng/ml，F10为0 ng/ml，F10-1为2.64 ng/ml，并且F10-2为2.80 ng/ml。没有VEGF的F10显示出了显著少量的血管形成。除F10之外的培养基显示出了许多血管形成，这确认了VEGF促进通过血管内皮祖细胞的血管形成。同样，从该结果可以确认，血管形成处理可以适用于细胞片层形式，其中血管内皮祖细胞层和视网膜色素上皮细胞层是层压的，这是因为视网膜色素上皮细胞的培养上清液可能促进血管形成。

参考实施例2. 基质胶的使用

通过参考实施例1中相同的方法，除了使用包被基质胶的培养皿外，使用4种培养基培养人血管内皮祖细胞，并对所形成血管的数量进行计数。对每种所使用的培养基，以3次重复实验获得的所形成血管的数量的结果显示于图2（B）中（

与参考实施例1相比，血管形成数量在使用基质胶的所有培养基中都得到了显著改善。具体而言，没有VEGF的F10显示了显著少量的血管形成（参考实施例1），但通过使用基质胶促进了血管形成。这些结果确认了可以通过利用基质胶促进血管形成，无论VEGF是否存在。

视网膜色素上皮细胞片层的生产条件

以与生产实施例2相同的方式进行，除了在生产实施例2中使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生产细胞片层的步骤中，分别（A）使用猪皮来源的I型胶原TE（特殊订购产品：主要包含I型胶原、少量的Ⅲ型胶原，Nitta Gelatin，5 mg/ml）作为0.35％胶原混合溶液/孔，（B）使用猪腱来源的I型胶原T-1002（特殊订购产品：I型胶原，Nitta Gelatin，5.1mg/ml）作为0.35％胶原混合溶液/孔，（C）使用FITC-标记的I型胶原（Chondrex，1 mg/ml）作为0.07 ％胶原混合溶液/孔，（D）使用FITC-标记的I型胶原（特殊订单，Chondrex，3 mg/ml）作为0.21％胶原混合溶液/孔，（E）使用缺端胶原（atelocollagen）（KOKEN，3 mg/ml）作为0.21％胶原混合溶液/孔，以及（F）使用细胞培养用渗透性胶原膜（KOKEN），分别代替猪腱来源的酸溶性I型胶原Cellmatrix I-A（Nitta Gelatin，3 mg/ml）作为0.21％胶原混合溶液/孔，生产细胞片层并切得视网膜色素上皮细胞片层。

将生产实施例2和使用前述各胶原的情形的测试结果进行了比较，并以4项进行评价[1.凝胶强度；2.细胞粘附；3.细胞增殖；4.安全性]。结果，（A）{1.差；2.同等；3.差；4.良好}，（B）{1.良好（5.1 mg/ml）；2.同等；3.差；4.良好}，（C）{1.差（1 mg/ml）；2.差；3.未知；4.未知}，（D）{1.同等（3 mg/ml）；2.同等；3.差；4.未知}，（E）{1.同等（3 mg/ml）；2.差；3.未知；4.良好}，以及（F）{未被胶原酶溶解，因此不可用}。对于凝胶强度，需要一定水平的强度以使视网膜色素上皮细胞能够生长。从这样的角度来看，特别优选的胶原种类和浓度是以上述浓度使用的生产实施例2的猪腱来源的酸溶性I型胶原Cellmatrix I-A和（B）猪腱来源的I型胶原T-1002。当基质不具有一定水平的强度，视网膜色素上皮细胞不会生长，并且不能用于本发明。

以与生产实施例2相同的方式进行，除了在生产实施例2使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生产细胞片层的步骤中，将要使用的胶原凝胶混合溶液的量从200 μl变为100μl或300 μl，生产细胞片层并切出，由此回收视网膜色素上皮细胞片层。

与生产实施例2相比，当胶原凝胶混合溶液的使用量为100 μl时，由于少量胶原凝胶混合溶液所引起的表面张力的影响而在中央部分形成了薄的胶原凝胶层，以及随着培养的进行，所接种的视网膜色素上皮细胞容易直接接触底膜，这引起了操作切出片层期间视网膜色素上皮细胞片层的破损。当胶原凝胶混合溶液的使用量为300 μl时，由于胶原凝胶混合溶液的量较高，形成了厚的胶原凝胶层，这相对降低了能够在小室中保留的培养基的量，以及因此，不容易进行维持培养，胶原酶处理需要时间，并担心细胞片层上的受损变大。

以与生产实施例2相同的方式进行，除了在生产实施例2使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生产细胞片层的步骤中，将1％胶原酶L（Nitta Gelatin）或I型胶原酶（Roche）与视网膜色素上皮细胞层接触，以10 μl的量接触10 min，以10 μl的量接触20 min，以10 μl的量接触30 min，以10 μl的量接触60 min，以20 μl的量接触20 min，以20 μl的量接触60min，以及以30 μl的量接触50 min，而不是以30 μl的量接触30 min，生产细胞片层并切出，由此回收视网膜色素上皮细胞片层。

结果，当胶原酶处理以10 μl的量进行60 min或20 μl的量进行60 min时，观察到了与30 μl进行30 min相同水平的胶原降解。

以与生产实施例2相同的方式进行，除了在实施例1使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生产细胞片层的步骤中，将小室中要接种的细胞数从5×10

与生产实施例2相比，（A）和（B）由于少量的细胞而需要更长时间达到细胞汇合，并且（C）显示了缓慢的生长且也往往需要更长的时间达到细胞汇合。

从生产自生产实施例2的253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）的细胞片层生产冰冻切片（冷冻切片），并进行免疫组织化学染色。紧密连接的形成通过ZO-1的表达确认，以及基底膜的形成通过层粘连蛋白和IV型胶原的表达确认。对于每种蛋白质的检测，使用了由Zymed制造的兔抗ZO-1（1:100稀释）、由Abcam制造的兔层粘连蛋白（1:200稀释）、以及由Calbiochem制造的鼠抗人IV型胶原抗体（ 1:40）的相应抗体。此外，从细胞核染色状态确认了视网膜色素上皮细胞片层具有单层上皮形式，该染色使用了由Molecular Probes制造的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1 μg/ml）。

视网膜色素上皮细胞片层的评价

在生产实施例2中从59SV3、59SV9（iPS-视网膜色素上皮细胞）生产细胞片层的步骤中，在经过1周、4周、2个月后，通过RT-PCR确认构成片层的细胞中BEST1、RPE65、MERTK、CRALBP的表达，其中在细胞汇合后当培养基变为SFRM-B27时的天为第0天。结果，观察到了与阳性对照（人视网膜色素上皮细胞总RNA（由ScienCell制造，Cat No.6545））相同水平的表达。 这里，BEST1、RPE65、MERTK是视网膜色素上皮细胞中特异性表达的基因。 CRALBP是视网膜色素上皮细胞和米勒细胞（Muller cells）中表达的基因。

在胶原酶处理前和后，通过从生产自生产实施例2的253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）的各细胞片层切出而生产冰冻切片（冷冻切片），并进行免疫组织化学染色。用Molecular Probes制造的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1 μg/ml）染色细胞核，并用Calbiochem制造的兔抗人I型胶原抗体（1:40稀释）染色I型胶原。结果，未从胶原酶处理后的片层中检测到胶原，并证实胶原酶除去了包被在培养皿上的胶原。另一方面，从胶原酶处理前切出的片层中检测到了胶原。

在生产实施例2中从253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）和454E2（iPS-视网膜色素上皮细胞）所生产的细胞片层切出视网膜色素上皮细胞片层的步骤之前，回收transwell中顶面（Apical side）和底面（Basal side）上的培养基，并根据Arvydas M, IOVS. 2006;47: 3612-3624中所描述的方法经ELISA检测VEGF和PEDF的生产量。结果，确认了类似于Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624中所报导的人类胚胎来源的视网膜色素上皮，VEGF主要在底面上分泌，并且PEDF主要在顶面上分泌（图4）。 表明了生产实施例2中从253G1和454E2所生产的视网膜色素上皮细胞片层具有类似于活生物体中的细胞因子分泌能力，并且在功能上优异。

发现了细胞层的屏障功能和阻抗即跨上皮/跨内皮电阻（TER）之间的强相关性。在生产实施例2中从454E2（iPS-视网膜色素上皮细胞）所生产的视网膜色素上皮细胞片层的切出步骤之前，根据MILLIPORE描述的方法（使用Millicell ERS-2）将探针放置在小室内部和外部的培养基中，并电测量TER。结果，TER为640Ω･cm

将生产实施例2中从从猴ES细胞来源的视网膜色素上皮细胞CMK6所生产的猴视网膜色素上皮细胞片层移植到猴的一只眼中，其根据Invest Ophthalmol Vis Sci.1995年2月; 36(2):381-90中所描述的方法进行。在移植前，进行视网膜光凝固以使待进行移植的眼视网膜患病。在移植到猴的其中形成有视网膜光凝固黄斑的一只眼中起第28天，拍摄眼底照片，并通过使用OCT（光学相干断层扫描）生成眼底断层图像为组织切片，在此基础上确认了视网膜的状态。结果，通过荧光素血管造影术没有发现荧光泄露，移植物存活，并且没有发现诸如感官视网膜变薄等病状。

将生产实施例2中从从猴iPS细胞来源的视网膜色素上皮细胞46a所生产的猴视网膜色素上皮细胞片层移植到用于自体移植的一只眼的视网膜下，和移植到用于交叉移植的三只眼的视网膜下，其根据Invest Ophthalmol Vis Sci.1995年2月; 36(2):381-90中所描述的方法进行。移植达一年后，拍摄眼底照片，并通过使用OCT（光学相干断层扫描）生成眼底断层图像为组织切片，在此基础上观察了随时间推移的视网膜状态。在交叉移植中，发现了明显的排斥反应，诸如移植物外周的纤维性变化、通过荧光素血管造影术的荧光渗漏、以及通过OCT的视网膜下高亮度病变。另一方面，在自体移植中，没有观察到这样明显的排斥，通过荧光素血管造影术没有发现荧光泄漏，移植物存活，并且未发现诸如感官视网膜变薄等病症。

工业实用性

根据本发明，有可能容易并稳定地生产视网膜色素上皮细胞的层压片层，其具有构成血管的细胞层，能够补充活体中缺损的脉络膜血管并在移植后供给氧气和营养物给视网膜。本发明的细胞片层是非常有用的，因为它在植活率和功能性方面是优异的，并且还可以治疗严重的脉络膜视网膜变性疾病，对此，简单的视网膜色素上皮细胞移植并不能容易地提供充分的治疗效果，诸如脉络膜视网膜变性疾病，特别是与脉络膜视网膜萎缩相关的高度近视和严重葡萄膜炎等。

通过引用将本说明书中所引用的任何出版物包括专利和专利申请中所公开的内容，都以其整体并入本文，达到它们已在本文中公开的程度。

本申请基于在日本提交的专利申请No. 2012-185932（申请日：2012年8月24日），其内容全部并入本文。