一种防尿液样本造假的氯胺酮检测卡及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种防尿液样本造假的氯胺酮检测卡及其制备方法与应用。

背景技术

氯胺酮为白色粉末状物质，相对分子质量238，存在两种异构体：左旋结构和右旋结构。左旋氯胺酮常被作为外科手术麻醉剂，右旋氯胺酮具有兴奋及致幻作用。氯胺酮滥用对人体产生的毒副作用主要集中在中枢神经、呼吸系统、消化系统及循环系统。刺激中枢系统表现为幻觉、躁动、惊厥等。刺激呼吸系统表现为呼吸抑制、支气管或喉部痉挛。刺激消化系统产生呕吐、恶心、腹胀、胃出血等。刺激循环系统表现为心率加快、血压升高。因此，氯胺酮滥用者吸食氯胺酮后会产生梦境、幻觉以及恶心呕吐；服用剂量过大会出现意识模糊、呼吸抑制、四肢抽搐甚至呼吸停止等现象，严重者致人死亡；长期滥用氯胺酮会引起失忆、认知功能障碍和其他精神疾病。氯胺酮及其代谢产物可经由尿液排出体外。

氯胺酮的检测方法主要有色谱法(液质联用、气质联用、高效液相和毛细管电泳法)、酶联免疫吸附(ELisa)法、胶体金法。色谱法具有重复性好、灵敏度高、能够定量检出等优点，是毒品检测的金标准，但因其操作过程繁琐，检测成本高，不适宜作为常规检测手段。Elisa是氯胺酮检测常用的方法，具有灵敏度高，成本低，操作简单等优点，但是此种方法整个检测过程需要2-3小时，无法满足现场快检的需求。胶体金免疫层析法具有操作简单，十分钟内就能进行结果判读，得出检测结果，无需配套设备，试剂保存简单，检测成本低等优点，已成为氯胺酮现场快检的理想方式。

现有氯胺酮快速检测卡(胶体金法)的组成及检测原理如下：依次将吸水垫、喷有氯胺酮-BSA抗原(检测线)和羊抗鼠二抗(质控线)的Nc膜、喷有氯胺酮抗体的金标垫和样品吸收垫相互叠搭固定在反应支持板上，再裁切成试纸条，装入塑料模块中，制得氯胺酮测定检测卡。向加样孔中加入待检尿样，层析过程开始，金标垫上的金纳米标记的氯胺酮抗体得以释放，样本中的氯胺酮会与检测线的氯胺酮-BSA抗原竞争结合胶体金标记的氯胺酮抗体，使得检测线的显色反应为淡色或无色，未结合的金纳米标记的氯胺酮抗体颗粒会与质控线处的羊抗鼠二抗结合，发生显色反应，通过目测得到检测结果，实现样品中毒品的快速检出。

然而，在实际检测过程中，将疑似吸毒人员的尿液样本进行检测时，若是吸毒人员将自身的尿液样本通过稀释或调包等造假方式逃避检查，将会对检测结果的准确度造成影响。而现有的氯胺酮快速检测卡(胶体金法)虽然能够实现快速检测，但是无法有效避免因可疑吸毒人员对尿液样本进行稀释、调包等造假而带来的漏检。因此，开发一种防尿液样本造假的氯胺酮快速检测卡具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种能够同时检出尿液样本是否造假和其中氯胺酮含量的检测卡，本发明的另一目的在于提供该检测卡的制备方法及其应用。

为实现上述目的，本发明创造性地引入尿液温度感应区和尿液性质检测区。其中，尿液温度感应区可通过检测尿液温度判断尿液样本是否经过稀释等掺假或调包，尿液性质检测区可通过检测尿液的标志性理化指标判断尿液样本是否经过稀释等掺假，两者结合可实现功能互补和配合，有效提高尿液样本造假的检出率。进一步通过对尿液温度感应区、尿液性质检测区和氯胺酮检测区进行优化，有效避免各检测区之间的相互干扰，在保证对尿液样本造假检测的特异性和灵敏度的同时，保证了氯胺酮检测的特异性和灵敏度。

具体地，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供一种氯胺酮检测卡，其包括温度感应区和反应区；所述反应区包括氯胺酮检测区和尿液性质检测区；其中，所述温度感应区用于检测尿液样本的温度；所述氯胺酮检测区用于检测尿液样本的氯胺酮的含量；所述尿液性质检测区用于检测尿液样本的理化性质，所述尿液的理化性质为选自尿微量白蛋白、尿肌酐、尿钙、蛋白质、白细胞、潜血/隐血、葡萄糖、酮体、尿胆原、比重、胆红素、酸碱度、维生素C、亚硝酸盐中的一种或多种。

利用所述氯胺酮检测卡对尿液样本进行检测，根据氯胺酮检测区的检测结果，判断尿液样本中氯胺酮的含量；根据温度感应区和尿液性质检测区的检测结果，判断待检测尿液样本是否造假。

本发明中，所述尿液理化性质的检测指标具体可为：尿肌酐，或为尿肌酐和尿钙。本发明通过大量研究和实践，确定了相对更适用于与温度感应区互补配合的尿液理化性质检测指标，优选为尿肌酐含量或为尿肌酐和尿钙含量。上述理化性质指标配合温度感应能够更好地提高尿液样本造假检测的灵敏度和特异性。

为更好地保证检测的快速便捷性，所述氯胺酮检测区为免疫层析检测区。优选为胶体金免疫层析。

通过对各检测区的位置关系进行设计和优化，有利于减少各区之间检测的相互干扰，作为优选，所述检测卡的结构为：所述温度感应区设置独立的加样区；所述氯胺酮检测区与所述尿液性质检测区共用一个加样区，沿尿液样本层析方向依次为所述氯胺酮检测区和所述尿液性质检测区。

作为优选，本发明的氯胺酮检测卡的结构具体如下：所述温度感应区包含感温变色塑料；所述尿液性质检测区包含尿液性质检测块；所述尿液性质检测块固定有用于检测尿液理化性质的反应液。

所述感温变色塑料的消色温度区间优选为33℃～37℃。

作为本发明的一种优选方案，所述检测卡包括背衬以及沿所述检测卡的长轴一端到另一端依次粘贴在所述背衬上的感温变色塑料、样品垫、结合物释放垫、氯胺酮反应膜、吸收垫和尿液性质检测块；所述样品垫、结合物释放垫、氯胺酮反应膜、吸收垫和尿液性质检测块中任意相邻两个均部分搭接。所述感温变色塑料无需搭接直接贴于背衬。

所述结合物释放垫包被有标记的氯胺酮抗体；所述氯胺酮反应膜固定有氯胺酮抗原和二抗；所述氯胺酮抗原和二抗分别形成检测线和质控线；所述检测线靠近所述结合物释放垫，所述质控线靠近所述吸收垫。

作为优选，所述感温变色塑料与所述样品垫之间设有2～4mm的间距；结合物释放垫的1/3-1/2被覆盖于样品垫下。

作为优选，所述检测线与所述质控线相互平行且与所述检测卡的长轴方向垂直。

可选地，将所述检测卡包装于卡壳中，在所述感温变色塑料的对应位置设有一个加样孔；所述样品垫的对应位置设有一个加样孔。所述检测卡还可设有2个可视观察窗口，分别位于检测线和质控线的对应位置以及尿液性质检测块的对应位置。

在温度感应区中通过使用能够感应温度并发生颜色变化的可逆温致变色材料，能够简单快速地判断尿液的温度范围。所述感温变色塑料由包括可逆温致变色复配物的原料制备得到；所述可逆温致变色复配物包括如下重量份的组分：隐色剂：热敏玫红或结晶紫内酯 0.3～0.8份；显色剂：双酚A或对羟基苯甲酸苄酯2～5份；溶剂：十四醇25～35份。在温度感应区中采用该可逆温致变色复配物，可更好地与尿液性质检测区配合实现尿液样本的造假检测，同时不影响氯胺酮检测区的检测。

作为本发明的一种优选方案，所述隐色剂、显色剂和溶剂的质量比为1:6:60。

所述可逆温致变色复配物的制备原料还包括塑料原料；所述制备原料中，所述可逆温致变色复配物的质量百分比为20％～30％。

作为本发明的一种实施方式，所述尿液理化性质为尿肌酐含量，用于检测尿液理化性质的反应液包括酶底物和色原。

所述酶底物包括如下酶活单位份数的组分：肌酸酶5～20份，过氧化物酶5～20份：肌酐酶5～20份：肌氨酸氧化酶15～60份。通过将尿肌酐检测试剂中关键反应酶的比例控制在上述范围，更有利于提高检测卡对尿液样本造假检测的灵敏度和特异性。

所述色原为4-氨基安替比林以及选自N-乙基-N(2-羟基-3-丙磺基)-3,5-二甲基苯胺钠、苯酚、对氯酚、对羟基苯甲酸和3,5-二氯-2- 羟基苯磺酸钠中的一种。

优选地，所述用于检测尿液理化性质的反应液包括如下组分：

作为本发明的一种优选方案，所述用于检测尿液理化性质的反应液中，所述肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶的酶活比例为1：1：3：1。所述用于检测尿液理化性质的反应液中4-氨基安替比林与N-乙基-N(2-羟基-3-丙磺基)-3,5-二甲基苯胺钠、苯酚、对氯酚、对羟基苯甲酸或3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠的摩尔比为1:1。

在氯胺酮检测区中，所述标记的氯胺酮抗体优选为胶体金标记的氯胺酮抗体；所述氯胺酮抗原优选为偶连载体蛋白的氯胺酮。

所述载体蛋白包括但不限于BSA、KLH等，优选为BSA。所述二抗的种类根据所述氯胺酮抗体的来源确定，例如可为羊抗鼠二抗等。

作为优选，在进行胶体金标记时，所述氯胺酮抗体与所述胶体金的比例为(3～10)μg氯胺酮抗体/ml胶体金；所述氯胺酮抗原的浓度为0.2～1.8mg/ml；所述二抗的浓度为0.2～0.5mg/ml。

本发明的氯胺酮检测卡可采用如下材料制备：样品垫：玻璃纤维素膜；结合物释放垫：玻璃纤维膜或聚酯膜；氯胺酮反应膜：硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；吸收垫：吸水纸；尿液性质检测块：滤纸/ 尼龙膜；背衬：PVC。

本发明还提供一种氯胺酮检测试剂盒，其包含所述氯胺酮检测卡和尿肌酐反应比色卡；所述尿肌酐反应比色卡的表面设置有不同的尿肌酐浓度量值标示以及与所述尿肌酐浓度量值标示对应的所述尿液性质检测块的标准色标块。

可选地，所述不同的尿肌酐浓度量值标示为0、0.9、4.4、8.8、 17.7、26.5mmol/L。

本发明所述的氯胺酮检测卡的检测原理如下：将新采集的尿液样本加入温度感应区加样孔，尿液在温度感应区进行温度感应，正常尿液样本的温度在37℃左右，感温变色塑料发生变色反应(消色温度区间33℃～37℃)，颜色变浅；而经稀释等掺假或调包的尿液样本的温度一般低于33℃，感温变色塑料不发生颜色变化，仍保持原来颜色；将尿液样本从反应区加样孔加入，尿液样本从样品垫沿着层析方向到达金标垫，释放出金纳米颗粒标记的氯胺酮抗体，尿液样本中的氯胺酮与检测线(T线)上包被的氯胺酮抗原竞争结合胶体金标记的氯胺酮抗体，导致检测线上的氯胺酮抗原无法结合到胶体金标记的氯胺酮抗体，使得检测线呈淡色或无色；剩余的胶体金标记的氯胺酮抗体继续层析体到达质控线(C线)时，与质控线上包被的二抗特异性结合并显色。氯胺酮的阴性结果为检测线和质控线都显色；阳性结果为检测线变浅或消失，质控线显色；质控线不显色则为失效；最后尿液样本到达尿液性质检测块，与反应块上的固定的反应液组分发生显色反应(其中，尿肌酐检测原理为：尿液中的肌酐会在相关酶的催化下产生过氧化氢，过氧化氢和4-氨基安替比林在过氧化物酶的催化作用下发生显色反应)，若尿液样本经稀释或掺假，尿肌酐的浓度下降，与比色卡对比，低于正常值。

另一方面，本发明还提供所述氯胺酮检测卡的制备方法，包括如下步骤：

(1)感温变色塑料的制备：将溶剂完全熔融后加入隐色剂和显色剂，反应得到可逆温致变色复配物；将所述可逆温致变色复配物按 20％～30％质量比加入到塑料原料中，成型，得到带有凹槽的塑料片；

(2)包被有标记的氯胺酮抗体的结合物释放垫的制备：将玻璃纤维膜或聚酯膜用pH 7.0～8.0的缓冲液浸泡2～3h，干燥；将标记的氯胺酮抗体按照5～25μl/cm喷涂于经浸泡和干燥的玻璃纤维膜或聚酯膜上；

(3)氯胺酮反应膜的制备：将氯胺酮抗原溶液和二抗溶液分别按照5～10μL/cm和5～15μL/cm喷涂在硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜上分别形成检测线(T线)和质控线(C线)；(4)尿液性质检测块的制备：按比例配制用于检测尿液理化性质的反应液，将滤纸或尼龙膜浸泡在所述反应液的中2～3h；

(5)检测卡的组装：依次将样品垫、结合物释放垫、氯胺酮反应膜、吸收垫和尿液性质检测块相邻两个部分搭接粘贴于所述背衬上，将感温变色塑料无需搭接直接黏贴于背衬上，裁切。

本发明还提供所述氯胺酮检测卡或所述氯胺酮检测试剂盒的如下任一种应用：

(1)在氯胺酮含量检测中的应用；

(2)在氯胺酮的尿液样本掺假检测中的应用。

本发明还提供一种检测尿液样本中氯胺酮并排除尿液样本造假的方法，包括：取待测尿液样本，利用所述氯胺酮检测卡或所述氯胺酮检测试剂盒进行检测，根据氯胺酮检测区的检测结果，判断待测尿液样本中氯胺酮的含量；根据温度感应区和尿液性质检测区的检测结果，判断待测尿液样本是否造假。

具体地，所述检测方法包括：将80～130μl新鲜采集的尿液样本沿温度感应区加样孔和反应区加样孔加入，反应1～2min通过温度感应区观察窗口观察温度感应区的检测结果，反应3～8min通过反应区观察窗口读取结果；结果判读方法为：阴性结果(尿液样本未造假且氯胺酮检测阴性)：温度感应区颜色消色，T线与C线均显色，尿肌酐反应块显色与尿肌酐反应比色卡比较为正常值；阳性结果(尿液样本未造假且氯胺酮检测阳性)：温度感应区颜色消色，T线淡色或无色，C线显紫红色、尿肌酐反应块显色与尿肌酐反应比色卡比较为正常值；造假结果(尿液样本造假)：温度感应区不消色或尿肌酐反应块显色浅于尿肌酐反应比色卡的正常值，或者温度感应区不消色且尿肌酐反应块显色浅于尿肌酐反应比色卡的正常值；无效结果：C线不显色。

本发明的有益效果在于：本发明的氯胺酮检测卡包含温度感应区、氯胺酮检测区和尿液性质检测反应区，能够在一个检测卡上同时实现尿液样本中氯胺酮含量的检测和尿液样本是否经稀释等造假的检测，且对于尿液样本的造假检测和对于氯胺酮的含量检测均具有较高的特异性和灵敏度；利用本发明的氯胺酮检测卡能够有效防止因可疑吸毒人员将尿液样本进行稀释或掺假等造假而导致的漏检，提高氯胺酮检测的准确性，在氯胺酮检测中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1、2和3中氯胺酮检测卡的结构示意图。

图2为本发明实施例1、2和3中氯胺酮检测卡的俯视图。

图1和图2中，1：感温变色塑料，2：样品垫，3：金标垫，4：氯胺酮反应膜，5：检测线(T)，6：质控线(C)，7：吸收垫，8：背衬，9：尿液性质检测块，10：温度感应区加样孔，11：反应区加样孔。

图3为本发明实验例1中实施例1和对比例1的氯胺酮检测卡的检测结果图；其中，尿肌酐比色卡的浓度单位为mmol/L。

图4为本发明实验例8中氯胺酮检测卡的检测结果图；其中，尿肌酐比色卡的浓度单位为mmol/L。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，氯胺酮抗体购自隆基生物公司，货号为MD01101；氯胺酮-BSA抗原购自隆基生物公司，货号为AD01101；羊抗鼠二抗购自菲鹏公司。

实施例1氯胺酮检测卡(1)

本实施例提供一种氯胺酮检测卡，其结构示意图如图1所示，俯视图如图2所示，制备方法如下：

(1)感温变色塑料的制备：称取30g的十四醇，在70℃条件下搅拌熔融，完全熔融后同时加入0.5g热敏玫红和3g双酚A，搅拌反应得到可逆温致变色复配物；自然冷却后按30％质量比例加入到78g PE原料中，通过成型手段制成带有凹槽的塑料片；

(2)胶体金的制备：将50mL 0.01％的氯金酸水溶液加热至沸腾，加入750μl 1％的柠檬酸三钠溶液，待溶液由金黄色变至紫红色后继续煮沸10分钟，待自然冷却后定容至50ml；

(3)金标垫的制备：将玻璃纤维膜用20mM pH7.4 PBS缓冲液 (含0.1％Tween20、0.8％NaCl、0.3％BSA和1％的海藻糖)浸泡2h， 37℃下烘干2h备用；将50ml胶体金溶液pH调节至7.8，在搅拌状态下加入150μg氯胺酮抗体，然后加入250μl 5％PEG20000，继续搅拌30分钟，最后加入2.5ml 5％BSA溶液，封闭1小时；3000rpm离心处理15分钟得到胶体金抗体沉淀，用复溶液(含有0.1％Tween20、 0.1％BSA和2％海藻糖的20mM pH7.4 PBS缓冲液)复溶至50ml；按照25μl/cm的参数喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥3h，置于干燥环境中备用；

(4)氯胺酮反应膜的制备：用5ml 20mM pH7.4 PBS缓冲液配制0.5mg/mL氯胺酮-BSA抗原，按照10μl/cm参数喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线；用10ml 20mM pH7.4 PBS缓冲液配制0.2mg/mL羊抗鼠二抗，按照15μl/cm参数包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃干燥3h，置于干燥环境中备用；

(5)尿肌酐反应块的制备：配制用于尿肌酐检测的反应液，配方如下(50ml)：20mMpH7.4 PBS缓冲液(溶剂)、Tween20 0.1％、蔗糖1％、proclin300 0.1％、维生素C氧化酶2U/mL、肌酸酶5U/mL、肌酐酶5U/mL、过氧化物酶5U/mL、肌氨酸氧化酶15U/mL、4-氨基安替比林2mmol/L、N-乙基-N(2-羟基-3-丙磺基)-3,5-二甲基苯胺钠2mmol/L；将滤纸浸泡在配制好的反应液中2h，于37℃干燥3h，置于干燥环境中备用；

(6)检测卡的组装：按照从检测卡长轴的一端到另一端的顺序依次将感温变色塑料1、样本垫2、金标垫3、氯胺酮反应膜4、吸收垫7、尿肌酐反应块9相互搭接粘贴于背衬8上，其中结合物释放垫的1/3被覆盖于样品垫下，其余相邻部分搭接时覆盖长度为1mm，感温变色塑料无需搭接直接贴于PVC背衬；将拼接好的试纸裁切成 4mm宽度后组卡；上卡壳分别在感温变色塑料上方设有加样孔10、样品垫上方设有加样孔11，并在检测线5和质控线6的上方以及尿肌酐反应块的上方分别设有2个可视观察窗口；检测卡组装好后装入铝箔袋，加入干燥剂封口，放置于4～30℃干燥环境下可保存24个月。

该氯胺酮检测卡配套使用的尿肌酐反应比色卡的制备方法如下：用尿肌酐反应块分别检测肌酐浓度为0、0.9、4.4、8.8、17.7、26.5mmol/L 的尿液样本，拍照记录显色结果，将各浓度数值和颜色相对应，印刷制作出比色卡。

实施例2氯胺酮检测卡(2)

本实施例提供一种氯胺酮检测卡，其结构示意图如图1所示，俯视图如图2所示，制备方法如下：

(1)感温变色塑料的制备：称取30g的十四醇，在70℃条件下搅拌熔融，完全熔融后同时加入0.5g热敏玫红和3g双酚A，搅拌反应得到可逆温致变色复配物；自然冷却后按20％质量比例加入到134g PE 原料中，通过成型手段制成带有凹槽的塑料片；

(2)胶体金的制备：将50mL 0.03％的氯金酸水溶液加热至沸腾，加入500μl 1.5％的柠檬酸三钠溶液，待溶液由金黄色变至紫红色后继续煮沸15分钟，待自然冷却后定容至50ml；

(3)金标垫的制备：将玻璃纤维膜用pH 7.6的HEPES缓冲液 (含0.2％Tween80、0.9％NaCl、0.5％BSA和2％海藻糖)浸泡2h，干燥；将50ml胶体金溶液的pH调节至8.0，在搅拌状态下加入250μg 氯胺酮抗体，然后加入250μl的10％的PEG 4000，继续搅拌60分钟，最后加入2.5ml的5％的BSA溶液，封闭1小时，5000rpm离心处理 15分钟得到胶体金抗体沉淀，用复溶液(复溶液：含0.1％Tween80、 0.3％BSA和2％蔗糖50mM 7.6HEPES缓冲液)复溶至50ml，按照 15μl/cm参数喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥4小时，置于干燥环境中备用；

(4)氯胺酮反应膜的制备：用10ml 50mM pH7.6 HEPES缓冲液配制1mg/mL氯胺酮-BSA抗原，按照7μl/cm参数喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线；用20ml 50mM pH7.6 HEPES缓冲液配制0.3mg/mL 羊抗鼠二抗，按照7μL/cm参数喷涂在硝酸纤维素膜上形成质控线；将包被好的硝酸纤维素膜于37℃干燥4h，置于干燥环境中备用；

(5)尿肌酐反应块的制备：配制用于尿肌酐检测的反应液，配方如下(50ml)：50mMpH7.6 HEPES缓冲液(溶剂)、Tween80 0.2％、蔗糖1.5％、proclin300 0.2％、维生素C氧化酶6U/ml、肌酸酶10U/mL、肌酐酶10U/mL、过氧化物酶10U/mL、肌氨酸氧化酶30U/mL，4-氨基安替比林4mmol/L、N-乙基-N(2-羟基-3-丙磺基)-3,5-二甲基苯胺钠 4mmol/L；将滤纸浸泡在配制好的反应液中2h，于37℃干燥4h，置于干燥环境中备用；

(6)检测卡的组装：按照从检测卡长轴的一端到另一端的顺序依次将感温变色塑料1、样本垫2、金标垫3、氯胺酮反应膜4、吸收垫7、尿肌酐反应膜9相互搭接粘贴于背衬8上，其中结合物释放垫的1/3被覆盖于样品垫下，其余相邻部分搭接时覆盖长度为1mm，感温变色塑料无需搭接直接贴于PVC背衬。将拼接好的试纸裁切成 4mm宽度后组卡；上卡壳分别在感温变色塑料上方设有加样孔10、样品垫上方设有加样孔11，并在检测线5和质控线6的上方以及尿肌酐反应块的上方分别设有2个可视观察窗口；检测卡组装好后装入铝箔袋，加入干燥剂封口，放置于4～30℃干燥环境下可保存24个月。

该氯胺酮检测卡配套使用的尿肌酐反应比色卡的制备方法如下：用尿肌酐反应块分别检测肌酐浓度为0、0.9、4.4、8.8、17.7、26.5mmol/L 的尿液样本，拍照记录显色结果，将各浓度数值和颜色相对应，印刷制作出比色卡。

实施例3氯胺酮检测卡(3)

本实施例提供提供一种氯胺酮检测卡，其结构示意图如图1所示，俯视图如图2所示，制备方法如下：

(1)感温变色塑料的制备：称取30g十四醇，在70℃条件下搅拌熔融，完全熔融后同时加入0.5g结晶紫内酯和3g对羟基苯甲酸苄酯，搅拌反应得到可逆温致变色复配物；自然冷却后按照25％的质量比加入到100.5g PE原料中，通过成型手段制成带有凹槽的塑料片；

(2)制备胶体金：将50ml 0.05％氯金酸水溶液加热至沸腾，加入 750μl氯金酸水溶液体积的2％柠檬酸三钠溶液，待溶液由金黄色变至紫红色后继续煮沸20分钟，待自然冷却后定容至50ml；

(3)金标垫的制备：将聚酯膜用100mM pH8.0 Tris缓冲液(含 0.5％TritonX、0.8％NaCl、1％BSA和1％蔗糖)浸泡3h，37℃下烘干5h备用；将50ml胶体金溶液的pH至8.2，在搅拌状态下加入500μg 氯胺酮抗体，然后加入250μl 10％PVP，继续搅拌30分钟，加入500μl 10％BSA溶液，封闭2小时；7000rpm离心处理20分钟得到胶体金抗体沉淀，用复溶液(含0.5％TritonX、0.5％BSA和5％蔗糖的100mM pH8.0 Tris缓冲液)复溶至50ml；按照5μl/cm喷涂于玻璃纤维膜或聚酯膜上，37℃干燥5h，置于干燥环境中备用；

(4)氯胺酮反应膜的制备：用15ml 100mM pH8.0 Tris缓冲液配制1.8mg/mL氯胺酮-BSA抗原，按照5μl/cm喷涂在硝酸纤维素膜上形成检测线；用15ml 100mM pH8.0 Tris缓冲液配制0.5mg/mL羊抗鼠二抗，按照5μL/cm包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；检测线靠近金标垫、质控线靠近吸收垫；将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃干燥5h，置于干燥环境中备用；

(5)尿肌酐反应块的制备：配制用于尿肌酐检测的反应液，配方如下(50ml)：100mMpH8.0 Tris缓冲液(溶剂)、TritonX 0.5％、海藻糖2％、NaN

(6)检测卡的组装：按照从检测卡长轴的一端到另一端的顺序依次将感温变色塑料1、样本垫2、金标垫3、氯胺酮反应膜4、吸收垫7、尿肌酐反应膜9相互搭接粘贴于背衬8上，其中结合物释放垫的1/3被覆盖于样品垫下，其余相邻部分搭接时覆盖长度为1mm，感温变色塑料无需搭接直接贴于PVC背衬；将拼接好的试纸裁切成 4mm宽度后组卡；上卡壳分别在感温变色塑料上方设有加样孔10、样品垫上方设有加样孔11，并在检测线5和质控线6的上方以及尿肌酐反应块的上方分别设有2个可视观察窗口；检测卡组装好后装入铝箔袋，加入干燥剂封口，放置于4～30℃干燥环境下可保存24个月。

该氯胺酮检测卡配套使用的尿肌酐反应比色卡的制备方法如下：用尿肌酐反应块分别检测肌酐浓度为0、0.9、4.4、8.8、17.7、26.5mmol/L 的尿液样本，拍照记录显色结果，将各浓度数值和颜色相对应，印刷制作出比色卡。

实施例4氯胺酮的检测方法

将实施例1～3制备的检测卡恢复至室温，从铝箔袋中取出，将 100μl新鲜采集的尿液样本沿温度感应区加样孔和反应区加样孔加入，反应1分钟，观察温度感应区结果，反应5分钟，通过观察窗读取氯胺酮和尿肌酐检测结果。

结果判读方法如下：阴性结果(尿液样本未造假且氯胺酮检测阴性)：温度感应区颜色消色(颜色显著变浅或变为无色)，T线与C 线均显色，尿肌酐反应块显色与尿肌酐反应比色卡比较为正常值 (4.4～17.7mmol/L)；阳性结果(尿液样本未造假且氯胺酮检测阳性)：温度感应区颜色消色，T线淡色或无色，C线显紫红色、尿肌酐反应块显色与尿肌酐反应比色卡比较为正常值(4.4～17.7mmol/L)；造假结果(尿液样本造假)：温度感应区不消色(仍保持原始玫红或蓝紫色)或尿肌酐反应块显色浅于尿肌酐反应比色卡的正常值 (4.4～17.7mmol/L)，或者温度感应区不消色且尿肌酐反应块显色浅于尿肌酐反应比色卡的正常值；无效结果：C线不显色。

对比例1

本对比例提供一种氯胺酮检测卡，其与实施例1的检测卡的区别仅在于：缺少尿肌酐反应块，仅保留温度感应区和氯胺酮检测区。实验例1氯胺酮检测卡防造假检测的准确性分析

分别利用实施例1～3和对比例1的氯胺酮检测卡进行尿液样本的检测，具体方法如下：

(1)尿液样本的制备：用氯胺酮阴性尿和氯胺酮标准品配置氯胺酮浓度为1000ng/ml的样本1，将样本1稀释10倍得到样本2；

(2)将样本1和样本2升温至37℃立即用实施例1和对比例1 的检测卡进行检测，检测方法同实施例4。

检测结果如下：对于样本1，实施例1和对比例1的检测卡结果均显示氯胺酮阳性；对于样本2，对比例1的无尿肌酐反应块的检测卡结果为阴性，实施例1的尿肌酐反应块的颜色浅于正常浓度范围 (4.4～17.7mmol/L)所对应的颜色，颜色与0.9mmol/L对应的颜色接近，判定为造假的阴性结果(图3)。结果表明，尿肌酐反应块与温度感应区协同作用能够更好的起到防造假的目的。

实施例2和3制备的检测卡对于样本1和2的检测结果与实施例1相同。

实验例2氯胺酮检测卡的灵敏度分析

用于灵敏度评估的的标准品为：氯胺酮标准品(批号为 171257-201603)，购于中国药品生物制品检定所。

用氯胺酮阴性尿液和氯胺酮标准品配制氯胺酮终浓度为100、 200、300、400、500、600、700、800、900、1000ng/ml的尿液样本，用实施例1制备的检测卡对尿液样本进行检测，检测方法同实施例4，每个浓度重复检测5次。检测结果显示，600～1000ng/ml的尿液样本5次均检出氯胺酮阳性。

进一步配制氯胺酮浓度为525、550、575ng/ml的样品进行检测，检测方法同实施例4，每个浓度重复5次。检测结果显示，当浓度为 575ng/ml时结果均为阳性，浓度为550ng/ml时结果均为弱阳性，浓度为525ng/ml时结果均为阴性。结果表明，该检测卡的最低检出限为550ng/ml。

实施例2和3制备的检测卡的最低检出限结果与实施例1相同。

实验例3阴性参考品符合率分析

向阴性尿液中分别加入甲基安非他明、可卡因、地西泮、麻黄碱、伪麻黄碱、苯巴比妥、曲马多、吗啡、加替沙星、雷尼替丁、咖啡因、普鲁卡因至终浓度为100μg/ml，加入△9-四氢大麻酚酸至终浓度为 10μg/mL，分别用实施例1～3制备的检测卡对配制的尿液样本进行检测，检测方法同实施例4，每个浓度重复检测5次。

检测结果显示，实施例1～3的检测卡均无阳性结果检出，阴性参考品符合率为100％。

实验例4阳性参考品符合率分析

用于阳性参考品评估的的标准品为：氯胺酮标准品(批号为 171212-201605)，购于中国药品生物制品检定所。

用氯胺酮阴性尿液和标准品配制氯胺酮终浓度为600、900、1200ng/ml的尿液样品，分别利用实施例1～3的检测卡进行检测，检测方法同实施例4，每个样品检测10次。检测结果显示，每次的检测结果均为阳性，阳性参考品符合率为100％。

实验例5氯胺酮检测卡的重复性分析

用于重复性评估的的标准品为：氯胺酮标准品(批号为 171212-201605)，购于中国药品生物制品检定所。

用氯胺酮阴性尿液和氯胺酮标准品配制成氯胺酮浓度分别为 600、1000ng/ml的尿液样品，取同一批次的20支实施例1～3的检测卡，每个浓度重复检测10次。检测结果显示，各样品的所有检测结果均为阳性，表明实施例1～3的检测卡的检测重复性良好。

实验例6氯胺酮检测卡防造假检测能力验证

用阴性尿配制氯胺酮浓度为1000ng/ml的样本1，将样本1进行逐级稀释5，10，20，50，100倍分别得到样本2～6，将样本温度保持在 37℃，分别用实施例1～3的检测卡和实施例4的检测方法进行检测，各样本重复检测10次。

检测结果显示，所有样本利用实施例1～3的检测卡进行检测时，温度感应区均消色，样本2～6的氯胺酮检测均为阴性，样本3～6的尿肌酐反应块显色均浅于尿肌酐反应比色卡的正常值，表明实施例1～3的检测卡可检出的尿液最低稀释倍数为10倍稀释，上不设限。

实验例7氯胺酮检测卡效期稳定性

将同一批次的实施例1～3的检测卡，在室温下储存，采用实验例2、 4、5的的检测方法分别于储存3，6，12，18，20，22，24，25个月时检测各检测卡的灵敏度、阴阳符合率、重复性等性能。

检测结果显示，储存3～25个月时，检测卡的灵敏度、阳性参考品符合率、重复性均达标，表明本发明的氯胺酮检测卡能够在室温下稳定储存24个月，仍保持较高的准确性和灵敏度。。

实验例8氯胺酮检测卡在尿液样本造假检测中的应用

待测人员基本情况：性别男，年龄42岁，毒品稽查部门对某家娱乐场所临检。利用实施例1的检测卡，按照实施例4的检测方法对其提供的新采集尿液样本进行检测，检测结果如图4所示，感温变色塑料未消色，氯胺酮检测结果呈阴性，通过与尿肌酐反应比色卡比较发现尿肌酐浓度低于正常值，表明该样本为造假样本。重新采集新鲜尿液样本进行检测(复测)，感温变色塑料消色，氯胺酮检测结果呈阳性，尿肌酐浓度在正常值范围内，表明该待测人员存在吸毒行为。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。