一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用

技术领域

本发明涉及一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记、引物对及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

桃蚜是桃树生产上重要的害虫，春季2月中旬至3月中旬，越冬卵孵化的桃蚜幼虫只有取食桃和山桃的叶片才能成活长大，因此对早期桃树萌发的新梢和幼叶造成直接危害。受桃蚜侵食后的植物幼叶向反面横卷或不规则卷曲，阻碍叶片的营养吸收，使叶片营养恶化，甚至黄落。蚜虫排泄在叶片上的蜜露易诱发霉污病，干扰植物的光合作用；幼果被桃蚜叮咬后，果实畸形、品质下降。由于近年来烟碱类杀虫剂的广泛使用，桃蚜已经对其产生抗药性，防治难度增加；另外，广谱型杀虫剂的大量使用对授粉昆虫和天敌昆虫也产生严重危害，并对果园的生态环境造成破坏。因此挖掘抗性资源、开发与抗性性状紧密连锁的分子标记、培育抗桃蚜新品种是桃育种研究工作的重要环节。

有关抗桃蚜性状与分子标记定位的研究，国内外学者均有所涉及。目前的研究发现桃树对蚜虫的抗性分为两类，一种是单基因显性控制的抗性，另一种是多基因控制的抗性。法国科学家Sauge发现，垂枝花桃(weeping flower peach，WFP)和砧木品种‘Rubira’对桃蚜的抗性分别由Rm1和Rm2两个单显性基因控制，两者对桃蚜的抗性均为排趋性，表现为蚜虫在人工接种3-4天内离开寄主植物，并且在蚜虫感染2-3天内，蚜虫侵食的部位出现红色超敏坏死病斑。牛良发现，粉寿星(P.persica var.densa Makino)对蚜虫的抗性是由单基因Rm3显性控制的。Rm1、Rm2和Rm3都定位在桃1号染色体的狭窄区间(Rm1位于43.62～46.50Mb区间内，Rm2位于45.08～46.23Mb区间内，Rm3位于45.66～46.12Mb区间内)。与单基因控制的抗性相比，多基因控制的抗性更难被克服而且效果更持久。2012年，法国科学家Sauge鉴定出山桃(P.davidiana)单株P1908对蚜虫的抗性为韧皮部特异抗生性，对寄生蚜虫的取食和繁殖能力产生影响，这种抗性是由多基因控制的数量性状，8个数量性状位点(QTL)分布在7个连锁群上，其中主效抗性位点MP.SD-3.1位于3号染色体的分子标记AG106(31-38cM)附近。王力荣等通过对郑州的国家果树种质桃资源圃中的419份桃属资源进行抗桃蚜鉴定也发现山桃类品种的抗性最强。因此以山桃为抗性来源构建杂交群体，培育抗桃蚜新品种，对桃育种研究工作有重要意义。而开发与抗性性状紧密连锁的分子标记，在实生苗期就淘汰与抗性性状无关的植株，能够减小选择群体，降低选育成本，提高选育效率。

目前，已有的连锁标记距离抗桃蚜的基因距离较远，在杂交后代的早期鉴定中准确率较低。所以，开发准确性高、操作便捷的分子标记显得很有必要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记、引物对及其应用，该标记在鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜(抗/感)性状时具有很高的准确性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记，包括InDel-1标记和InDel-2标记，其中，InDel-1标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，InDel-2标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的技术方案之一是：一种扩增InDel标记的引物对，包括InDel-1引物对和InDel-2引物对，两组引物对的上下游引物均是根据插入缺失位点的上下游序列进行设计。

所述InDel-1引物对的F端引物序列如SEQ ID NO.3所示，R端引物序列如SEQ IDNO.4所示；

所述InDel-2引物对的F端引物序列如SEQ ID NO.5所示，R端引物序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明的技术方案之一是：一种InDel标记在山桃杂交群体抗/感桃蚜性状分子标记辅助选择育种方面的应用。

本发明的技术方案之一是：一种利用InDel标记鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取DNA：采集待测山桃的叶片，提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板；

(2)PCR扩增：以上述提取的DNA为模板，分别用InDel-1引物对和InDel-2引物对进行PCR扩增，以获得相应的PCR扩增产物；

(3)基因型鉴定：对InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物进行测序，根据检测结果预测山桃抗/感桃蚜性状。

当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物含有89bp的DNA片段，或者InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为A时，则待测山桃为山桃杂交群体中抗桃蚜材料；

当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物仅有一条113bp的DNA片段，并且InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为TTTCCGGCC时，则待测山桃为山桃杂交群体中感桃蚜材料。

本发明的技术方案之一是：一种用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的试剂盒，包括InDel-1引物对和InDel-2引物对。

本发明的技术方案之一是：一种试剂盒在山桃杂交群体抗/感桃蚜性状分子标记辅助选择育种方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明以橡皮油桃×帚形山桃杂交后代F2群体中的179株单株为材料进行BSA定位，用35个InDel进一步加密，定位到950kb的区间，结合抗蚜单株和感蚜单株接种蚜虫后的基因表达数据，筛选到Prupe.3G275300和Prupe.3G262100，在这两条基因的启动子上分别发现了InDel-1(桃基因组第3条染色体的第25387879与第25387902bp之间)和InDel-2(桃基因组第3条染色体的第24761660与第24761668bp之间)。

本发明针对InDel-1和InDel-2标记设计两组InDel引物对，并对InDel-1对应引物对所扩增的PCR扩增产物进行电泳检测，对InDel-2对应引物对所扩增的PCR扩增产物进行测序，根据结果预测山桃抗/感桃蚜性状。

本发明对2个杂交群体共计224份待测单株进行分子标记基因型准确率验证，结果表明，验证准确率达96.88％。这说明利用本发明的核苷酸插入缺失(InDel)标记进行桃蚜抗性的鉴定，具有迅速、便捷、低成本等优点，能够在生产中实现大规模应用。

附图说明

图1为实施例3中InDel-1对应的引物对扩增的PCR扩增产物部分电泳图。

图2为实施例3中InDel-2对应的引物对扩增的PCR扩增产物部分测序图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：核苷酸插入缺失(InDel)标记的获得

本发明以橡皮油桃×帚形山桃杂交后代F2群体中的179株单株为材料进行BSA定位，用35个Indel进一步加密，定位到950kb的区间，结合抗蚜单株和感蚜单株接种蚜虫后的基因表达数据，筛选到Prupe.3G275300和Prupe.3G262100，在这两条基因的启动子上分别发现了InDel-1(桃基因组第3条染色体的第25387879与第25387902bp之间)和InDel-2(桃基因组第3条染色体的第24761660与第24761668bp之间)。

实施例2：利用InDel标记鉴定山桃杂交群体抗桃蚜的方法

1、DNA提取

采用改良的CTAB法提取待测山桃样品组织(叶片)DNA，DNA样品体积不小于30μl。用紫外分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，计算DNA含量和OD

2、引物设计

InDel-1和InDel-2根据缺失位点上下游参考序列(InDel-1约170bp，InDel-2约690bp)设计引物，具体见下表1。

表1 插入位点两端序列信息

注：灰底部分的核苷酸序列为缺失片段序列，其余部分的核苷酸序列为缺失片段上下游参考序列。

引物由生物技术公司合成后，用ddH

表2 引物序列

3、PCR扩增

(1)PCR扩增体系，见表3。

表3 PCR扩增体系

将上述配制好的体系转移到PCR管或板中，放入PCR仪器，进行PCR扩增，扩增程序如表4。

表4 PCR扩增程序

4、基因型鉴定

配制3％琼脂糖凝胶，对InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物进行电泳，130V电压，电泳60-70min，观察条带情况，对InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物进行测序，根据检测结果预测山桃抗/感桃蚜性状，判断标准如下：

当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物含有89bp的DNA片段，或者InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组(Prunus persica Genome v2.0.a1)组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为A时，则待测山桃为山桃杂交群体中抗桃蚜材料；

当InDel-1引物对扩增所得的PCR扩增产物仅有一条113bp的DNA片段，并且InDel-2引物对扩增所得的PCR扩增产物在对应于Lovell基因组组装的Scaffold 3的第24761660碱基处为TTTCCGGCC时，则待测山桃为山桃杂交群体中感桃蚜材料。

实施例3：2个杂交群体利用发明的一组InDel标记进行表现性的盲测验证

1、试验材料的选择

以郑州果树研究所资源圃中种植的常规桃品种为实验材料，从中选取调查过表现型性状的2个山桃杂交群体，共224份单株，具体见表5。

表5 供试杂交群体的名称及群体大小信息

注：帚形山桃为抗桃蚜野生种质，南一区西29-13为抗桃蚜优系，橡皮油桃为感蚜育成品种，Sweet dream为感蚜育成品种。

2、利用本发明一组InDel标记的鉴定方法

利用本发明一组InDel标记，对2个山桃杂交群体共224份单株抗/感桃蚜性状进行盲测鉴定，具体的鉴定方法参照实施例2中的方法。

3、杂交群体中分型结果对表型预测准确性

从表6鉴定结果可以看出，利用本发明一组InDel标记对杂交群体进行表型预测时，抗/感桃蚜性状的鉴定准确率达到96.88％，InDel-1对应的PCR扩增产物部分电泳图见图1，InDel-2对应的PCR扩增产物部分测序图见图2。因此证明本发明的一组InDel标记鉴定准确率高，能够作为分子标记应用在山桃杂交群体抗/感桃蚜辅助育种中。另外，该标记可操作性强，操作步骤简单。

表6 InDel标记在山桃杂交群体中的分型结果

序列表

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 一组用于鉴定山桃杂交群体抗/感桃蚜性状的InDel标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 169

<212> DNA

<213> 山桃(AmygdalusdavidianaCarr.C.deVos)

<400> 1

aacacgaaac gtaacataca gcaacaccag agatgagaca tgacgccacg cccctcctcc 60

tcctcctcct cctcctcctc ctcctcctgc tgctcagtgt tttcaaattt taaaaaattg 120

aacgtatcct tgcatgaccg cgcgtttact aaagaaacgc gacccgcgt 169

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 山桃(AmygdalusdavidianaCarr.C.deVos)

<400> 2

ctacatggcg ctgtcaatat gttatgttat gcataagact actggaatgt tcttttactt 60

tcatgttctg cacttcattc atcttccaag tttttttcaa aaaaatgacg gaataatatt 120

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taatggtgtt ttactatacc gtccccgttt gccacgctag tttacttgta taccctataa 660

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

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<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

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