一种用于多重定量检测多种真菌毒素的免疫层析试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及免疫层析分析技术领域，具体涉及一种用于多重定量检测多种真菌毒素的免疫层析试纸条及其应用，其技术原理为竞争法。

背景技术

免疫层析试纸条因其简单、快速、方便等优点已被广泛应用于临床诊断、食品安全检测以及环境监控等领域。但是传统免疫层析方法一般用于单目标分析物的检测，然而，单一目标物分析在癌症治疗、药物残留、病原微生物感染、真菌毒素监控等一些特殊领域，往往不能获得足够的样本信息，从而无法对样品做出准确地评估。因此，发展多重检测的免疫层析技术对提升检测结果的准确性与可靠性等具有重要的意义。

近些年，已有相关研究者使用胶体金纳米粒子与胶体碳纳米粒子等颜色型标记探针构建了多重免疫层析方法用于多种真菌毒素的同时检测。但由于多条T线区域颜色无差别，尤其当T线区域显色较弱时，在进行多重检测结果判读时易出现相互干扰情况。尽管通过增加T线之间距离或者使用多颜色的标记物可解决这一缺陷，但颜色型纳米粒子较低的呈色能力，导致以其为标记探针的多重免疫层析方法灵敏度偏低，进一步限制了其适用范围。

相比于颜色型标记物，荧光标记物具有信噪比高、背景干扰少、颜色对比明显等优势，因此被广泛用于免疫层析方发法中以提高其检测灵敏度。目前已报道的各类新型的荧光标记物包括上转换荧光纳米粒子、时间分辨荧光微球、有机染料荧光微球以及量子点荧光微球等。虽然以上标记物可有效地提高免疫层析方法的检测性能，但这些材料均具有明显缺陷，如上转换荧光纳米粒子表面亲水性修饰难、时间分辨荧光微球的环境耐受性差、量子点荧光微球的生物毒性以及有机染料荧光微球的聚集诱导淬灭效应等。

聚集诱导发光材料是一类在稀溶液状态下不发光或者发弱光，但是在固态或者聚集状态下荧光大大增强的一类纳米材料。聚集诱导发光材料的出现为有效解决传统聚集导致淬灭型有机荧光材料所面临的诸多难题提供了新方案。此外，聚集诱导发光材料还具有Stokes位移大、光稳定性好、耐光漂白、背景噪声低等特点，在传感检测领域得以广泛应用，并取得了令人瞩目的发展。此外聚集诱导发光材料具有多色无毒无害，结构易修饰，可制备出发射波长可调控可控的荧光探针，为多重多色检测提供更多的机会。因此，本发明拟采用微乳液自组装的方法制备系列具有不同发射波长的多色聚集诱导发光微球，并以其作为检测探针，以构建一种新型多色荧光免疫层析试纸条，实现痕量目标物浓度下的定性检测。相较于传统的多色荧光标记，本发明使用高发光强度的聚集诱导发光微球作为标记探针显著增强试纸条检测线上的信号强度，大大提高了检测方法的灵敏度。

发明内容

本发明旨在针对传统胶体金免疫层析试纸条中探针信号强度偏弱导致检测灵敏度偏低并且只能进行单一目标物检测的缺点，使用聚集诱导发光材料显著增强试纸条检测线上探针的输出信号强度，并且通过标记不同的聚集诱导发光微球作为输出信号，提供了一种提高免疫层析方法检测灵敏度的新技术，并且能够同时对多种目标检测物进行现场快速检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于多重定量检测多种真菌毒素的免疫层析试纸条，采用多色荧光免疫层析试纸条，其在传统免疫层析试纸条的基础上引入具有不同发射波长的多色聚集诱导发光微球作为标记材料。

进一步地，多色荧光免疫层析试纸条包括依次固定于PVC塑料底板上样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸；所述结合垫为喷涂有不同聚集诱导发光微球标记的多种真菌毒素抗体和抗鼠抗体的硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜上设有检测线和一条质控线，检测线上包被有真菌毒素抗体，质控线上包被有抗鼠抗体溶液；所述多色荧光免疫层析试纸条的检测线为单线或多线。

进一步地，单线的多色荧光免疫层析试纸条中各个聚集诱导发光微球的真菌毒素抗体间隔式地喷涂于玻璃纤维膜并连接成同一条检测线上。

进一步地，多线的多色荧光免疫层析试纸条中每个聚集诱导发光微球的真菌毒素抗体均喷涂于玻璃纤维膜绘制成一条检测线，进而形成多条平行的检测线。

本发明还提供了上述的用于多重定量检测多种真菌毒素的免疫层析试纸条的应用，免疫层析试纸条用于同时对多种真菌毒素检测，包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1。

进一步地，免疫层析试纸条的使用方法，包括以下步骤：取50～120μL待测样品溶液加入到试纸条的检测卡加样孔中，于室温反应5～20min，使用荧光读取仪进行读数即可；

本发明适用于粮油作物中多种真菌毒素的检测，包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏马毒素B1等，特别是适合于待检物的现场快速灵敏检测。样品处理按照常规处理方法即可。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明是在传统胶体金免疫层析试纸条的基础上，通过改变其标记物，以荧光作为输出信号实现免疫层析试纸条的检测灵敏度的提高。

2、本发明以聚集诱导发光材料取代常规的胶体金对真菌毒素特异性单克隆抗体进行标记，采用竞争法原理对真菌毒素进行定性检测和定量分析，硝酸纤维素膜上同时包被多条检测线，分别为待检真菌毒素全抗原，可同时对多种真菌毒素进行检测，所制备的层析试纸条具有良好的灵敏度和稳定性，且操作简便快捷，特别适用于现场的快速诊断。此外在免疫方法中荧光信号输出在市场中已经占据了越来越重要的地位，因此本方法具有良好的应用前景。

3、本发明所构建的聚集诱导发光微球免疫层析试纸条特别适用于痕量目标分析物的灵敏检测，在现场检测中具有广泛的应用前景，如粮油作物中多种真菌毒素的检测等。

附图说明

图1为本发明中基于多线的聚集诱导发光多色免疫层析试纸条的结构示意图。

图2为本发明中基于单线的聚集诱导发光多色免疫层析试纸条的结构示意图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

用于多重定量检测多种真菌毒素的免疫层析试纸条在传统免疫层析试纸条的基础上引入具有不同发射波长的多色聚集诱导发光微球作为标记材料。多色聚集诱导发光微球可采用红色、黄色、绿色、蓝色、橙色等聚集诱导发光微球。

多色荧光免疫层析试纸条包括依次固定于PVC塑料底板上样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水纸；所述结合垫为喷涂有不同聚集诱导发光微球标记的多种真菌毒素抗体和抗鼠抗体的硝酸纤维膜，所述硝酸纤维膜上设有多线或单线的检测线、一条质控线，检测线上包被有真菌毒素抗体，质控线上包被有抗鼠抗体溶液；

如图1所示，多线的多色荧光免疫层析试纸条中每个聚集诱导发光微球(如红色、黄色、绿色、蓝色、橙色AIE微球)的真菌毒素抗体均喷涂于玻璃纤维膜上，并各自绘制成一条检测线进而形成多条平行的检测线。如图2所示，单线的多色荧光免疫层析试纸条中各个聚集诱导发光微球(如红色、黄色、绿色、蓝色AIE微球)的真菌毒素抗体间隔式地喷涂于玻璃纤维膜并连接成同一条检测线上。

实施例2

基于多色聚集诱导发光微球双重定量检测食品中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮荧光免疫层析试纸条的制备，具体制备过程如下：

1)聚集诱导发光微球的制备：将聚集诱导发光染料、聚马来酸酐十八碳烯(PMAO)溶于三氯甲烷中，其中聚集诱导发光染料溶于三氯甲烷后的浓度为10～100mg/mL，PMAO溶于三氯甲烷后的浓度为10～500mg/mL，之后加入质量浓度为0.1～10％的十二烷基磺酸钠溶液，混匀，超声，将溶液用细胞破碎仪破碎，将该乳液进行旋蒸除去三氯甲烷，然后离心去上清，沉淀物用超纯水洗三次，复溶于超纯水中，即制得聚集诱导发光微球。

2)聚集诱导发光微球标记抗体的制备：在进样瓶中加入0.01～0.1M pH 6.0～8.0磷酸缓冲液，加入聚集诱导发光微球，再加入待标记抗体，使其抗体终浓度为1～100ug/mL，加入三次对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺后其终浓度为0.01～1mg/mL，每次反应30～60min，加入封闭剂封闭1～2h，封闭剂的终浓度为1～10％，且所述封闭剂选自酪蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、聚乙二醇、脱脂牛奶中的任意一种。加入封闭剂反应后的溶液离心的转速为5000～20000rpm，时间为10～50min。离心后的沉淀用0.01～0.1M pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液复溶为起始体积的1倍至1/10倍，即可制成聚集诱导发光荧光微球复合物，并可于4℃保存备用。

3)聚集诱导发光微球免疫层析试纸条的制备：a)结合垫的制备是将聚集诱导发光微球1-黄曲霉毒素B1单克隆抗体标记物与聚集诱导发光微球2-玉米赤霉烯酮单克隆抗体标记物，37℃干燥4小时备用；b)取30cm硝酸纤维膜用喷膜仪喷两条检测线，一条质控线。检测线1喷涂AFB1-BSA浓度为0.5-1mg/mL，检测线2喷涂ZEN-BSA浓度为0.5-1mg/mL，质控线羊抗鼠抗体浓度为0.5～1mg/mL。置于37℃烘箱中干燥过夜；c)聚集诱导发光微球免疫层析试纸条组装：在聚氯乙烯底板表面依次布置样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水纸，相邻垫或膜间彼此搭接；在硝酸纤维素膜上质控线位于吸水纸一侧；结合垫、样品垫、吸水纸的宽度分别为1.7cm，2.2cm和1.7cm，然后用切条机将其切成4mm试纸条，密封干燥，于室温保存。

检测原理：当加入含有两种小分子待测物的样品，待测液在毛细管力的作用下涌动，小分子待测物在经过结合垫时，会与喷涂在其上的两种聚集诱导发光微球-抗体复合物结合，从而不能识别两条检测线上的真菌毒素全抗原，只在质控线上与二抗结合，在激发光的照射下C线显色。当加入仅含有小分子待测物1的样品，待测液在毛细管力的作用下涌动，小分子待测物1在经过结合垫时，会与喷涂在其上相应的聚集诱导发光微球-抗体1复合物结合，聚集诱导发光微球-抗体2复合物会与检测线2上的全抗原结合，从而显现荧光。未与检测线结合的复合物继续向前涌动，在质控线上与二抗结合，在激发光的照射下C线显色；当加入仅含有小分子待测物2的样品，待测液在毛细管力的作用下涌动，小分子待测物2在经过结合垫时，会与喷涂在其上相应的聚集诱导发光微球-抗体2复合物结合，聚集诱导发光微球-抗体1复合物会与检测线1上的全抗原结合，从而显现荧光。未与检测线结合的复合物继续向前涌动，在质控线上与二抗结合，在激发光的照射下C线显色。当加入不含小分子待测物的样品，待测液在毛细管力的作用下涌动，在经过结合垫时，会与喷涂在其上相应的聚集诱导发光微球-抗体复合物一起向前涌动，聚集诱导发光微球-抗体复合物会分别与两条检测线上相应的全抗原结合，从而两条T线均显现荧光。未与检测线结合的复合物继续向前涌动，在质控线上与二抗结合，在激发光的照射下C线显色。若C线不显现荧光，则表明检测结果失效。计算检测线/质控线的荧光比值，以真菌毒素标准品浓度对数为横坐标，以相对应的荧光比值为纵坐标建立标准曲线，对样本中真菌毒素的浓度进行定量分析。

采用玉米进行研磨破碎，加入不同浓度的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮，进行加标回收实验。应用双重定量聚集诱导发光微球荧光免疫层析试纸条对加标的二十份样本进行了检测，并与高效液相色谱仪检测结果进行了对比。定量检测的灵敏度已达到国家标准，可用于食品中赭曲霉毒素A与黄曲霉毒素B1的快速定性检测与定量分析。

特别说明：虽然本发明的实施例中只列举了竞争原理同时对两种真菌毒素进行定性检测和定量分析。在本发明提供所述基于聚集诱导发光材料和免疫层析技术的同时检测两种真菌毒素的方法后，本领域技术人员能够根据其掌握的技能举一反三，实现同时检测多种真菌毒素的目的。

以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的前提下，本发明及其应用还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。