放电光谱成像实时监测气溶胶中病毒检测装置及方法

技术领域

本发明涉及一种利用特斯拉线圈高频高压放电作用于气溶胶样本，导致弱光辐射的变化来检测气溶胶中是否含有病毒的系统技术。本发明构建的检测装置及方法应用于医学、卫生健康、生物医学、生物医学工程和生物光子学领域。

背景技术

长期以来，通过气溶胶传播的致病性病毒对人类和动物健康构成严重威胁，特别是未知病毒的出现，通常在引起人类和动物明显疾病之前很难提前预测和监控，因为需要从受感染的人或动物身上获取生物样本，然后通过存在的技术来检测和分析核酸，特异性抗原和抗体。这种传统的检测流程通常会导致病毒监控的时间窗口延迟。因此，开发新的技术能实时预测、筛选和监测空气中，以及人类和动物呼出气体中未知或存在的病毒是非常必要的。

发明内容

本发明的目的提供一种放电光谱成像实时监测气溶胶中病毒检测装置及方法，本发明基于特斯拉放电光谱成像对气溶胶中病毒进行实时检测，具有灵敏度、快速、操作性和拓展性好、可实现无人远距离操控和实时监控等优点，可广泛用于涉及人类和动物致病病毒监控的各种场景，如人类生活和公共活动场地、海关、机场、学校和医院等以及动物的饲养和处理场地等。

一种放电光谱成像实时监测气溶胶中病毒检测装置，包括特斯拉高频高压放电器、金属容器、高透光圆形玻片、电动滤光镜转盘、成像镜头、光子成像或检测器件、气溶胶进样器、气溶胶后处理装置，其特征在于：特斯拉高频高压放电器的放电电极插入金属容器内，金属容器上设有高透光圆形玻片、进气口和出气口，进气口与气溶胶进样器相连，出气口与气溶胶后处理装置相连；高透光圆形玻片上方设有电动滤光镜转盘、成像镜头、光子成像或检测器件，光子成像或检测器件通过成像镜头、电动滤光镜转盘和高透光圆形玻片实现对放电电极诱发金属容器内气溶胶样品弱光辐射的成像或检测。

本发明还包括空气泵，空气泵连接在金属容器的进气口，空气泵进行容器中空气或气溶胶样本清理。

用特斯拉线圈进行高频高压放电，用放电电极诱发金属容器内气溶胶病毒样本弱光辐射、用弱光检测器件进行成像或光子检测，用手动或自动加样器进行气溶胶样本加载、用气溶胶后处理装置对已检测的气溶胶样本进行处理、用电动滤光镜转盘实现分波段成像、外部控制系统控制本发明的各活动部件进行自动控制检测、数据处理和检测结果报告等。

所述特斯拉高频高压放电器的供电电压在1.5-3.0V之间的直流电。

所述放电电极安装于金属容器的内的适当位置，用于金属容器内放电。

所述金属容器是一个圆柱形的中空容器，内径为直径33mm,高37mm，中空体积30毫升。

所述高透光圆形玻片是一个圆形石英玻片，直径35毫米，厚1毫米，固定安装在金属容器的上方。

所述电动滤光镜转盘用于加载滤光片或陷光片，辅助弱光光谱成像，电动滤光镜转盘的动作受外部控制系统控制。

所述成像镜头用于弱光成像的图像聚焦，与光子成像或检测器件的光子成像器件匹配。

所述气溶胶后处理装置用于气溶胶样本放电检测后的安全处理，包括两个串联的瓶子，第一个瓶子内装有纯化水，第二个瓶子装有1％的次氯酸盐消毒剂，确保检测后的气溶胶病毒样本在处理后可以安全排放到空气中。

所述光子成像或检测器件用于检测弱光信号，其工作流程受外部控制系统控制，成像器件可为：电子倍增CCD即EMCCD、像增强CCD、CMOS、雪崩光电二极管APD阵列等。光子检测可为低噪光电倍增管PMT等。

所述气溶胶进样器用于气溶胶进样，可手动或电动控制，进样可结合使用或不使用气溶胶过滤器。

使用本发明装置时，与超弱生物光子成像系统(UBIS)一起使用，超弱生物光子成像系统(UBIS)为专利授权的技术系统，专利号201310524951.4。

一种放电光谱成像实时监测气溶胶中病毒检测装置的检测方法，其特征在于按以下步骤进行：基于特斯拉放电的气溶胶弱光辐射光谱成像流程在675秒内完成，使用电动滤光镜转盘进行七个不同局部测试窗口LTWs的光谱成像测试，其中LTW-1和LTW-7为不加载陷光片或滤光片，其它五个LTW-2至LTW-6加载不同波长的陷光片或滤光片；

利用UBIS系统对弱光辐射进行检测，EMCCD作为光子成像器件，抽取气溶胶样品注射到金属容器内，并在6-8秒内完成，设置外部控制系统控制电动滤光镜转盘(5)在成像过程中按实验设计定时开关，完成相关动作，使实验过程自动进行；设置完成后，开始气溶胶手动进样或自动进样完成一次测试；将EMCCD成像获得的一系列图像文件进行存储，使用EMCCD控制程序提取每帧图像的平均灰度值GV，以适当的数据文件格式进行储存，做进一步分析；利用每帧图像的平均灰度值GV分析和比较气溶胶样品在不同局部测试窗口中的弱光辐射变化；进行数据分析和比较，使用受试者操作特征(ROC)曲线分析评估预测阳性病毒检测结果的最佳截止值，使用曲线下面积(AUC)进行敏感性和特异性评估值的确定，为进一步的样品测试建立标准。

本发明可以通过实时成像特斯拉放电引起的弱光变化来检测和监控气溶胶中含有的病毒。尽管自然界存在许多病毒，但只有少数种类的病毒能通过气溶胶传播并引起人类和动物疾病。因此，这种相对非特异性病毒监测技术在预测新病毒的出现和早期监测已知病毒，展示了现有技术不可替代的优势。

本发明由于采取以上技术方案，使其具有以下优点：

(1)高灵敏度：当以安道尔iXon ultra-897型EMCCD为光子成像器件，使系统灵敏度水平达到检测2800病毒颗粒/微升(vp/ml)。

(2)具有很好的操作性：由于计算机对时程控制器进行编程，进而控制整个成像测试系统，使测试过程完全自动化并可实现远距离实时操控。

(3)具有灵活广泛的应用范围，可广泛应用各种场景，如人类生活和公共活动场地、海关、机场、学校和医院等以及动物的饲养和处理场地等。

(4)具有很好的拓展和升级潜力：在该系统中，各子部件相对独立，根据具体的应用情况可进行灵活的改进、升级和拓展。

附图说明

图1为本发明装置的示意图。

图2a为使用五种不同波长的陷光片(488、514、533、561和596nm)的基于光谱分析的盐水和病毒气溶胶的特征变化图。

图2b为代表性未过滤盐水(b)气溶胶样品的RGV散点图。

图2c为代表性未过滤病毒(c)气溶胶样品的RGV散点图。

图2d为比较未过滤和过滤的盐水气溶胶之间的ARIs或ASC指数图。

图2e为中等浓度的代表性过滤病毒气溶胶样品RGV散点图。

图2f为中等浓度的代表性未过滤(f)病毒气溶胶样品RGV散点图。

图2g为未过滤和过滤的病毒气溶胶之间ARIs或ASC指数的比较图。

图2h为未过滤的生理盐水和过滤的病毒气溶胶之间ARIs或ASC指数的比较图。

图2i为在未过滤的病毒气溶胶样品(r2＝0.8668)中发现ASC指数的浓度依赖性变化图，但在过滤的样品中没有发现(r2＝0.2874)ASC指数的浓度依赖性变化图。

图3a为不同浓度的未过滤盐水气溶胶中ASC指数与未过滤病毒气溶胶中ASC指数的比较图。

图3b为不同浓度的过滤病毒气溶胶(b)中ASC指数与未过滤病毒气溶胶中ASC指数的比较图。

图3c、图3d、图3e、图3f分别为作为未过滤病毒气溶胶预测因子的未过滤盐水气溶胶或过滤病毒气溶胶ASC指数的接收器工作特性曲线(ROC)。AUC：曲线下的面积；虚线是无预测值的线，即AUC＝0.5图。

图3g为参考曲线显示了未过滤盐水(S-NF)、过滤病毒(V-F)和未过滤病毒中高浓度(V-NF-M+H)气溶胶样品中五种测试窗口的ARI-Ratios变化图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的具体内容、操作流程和实际性能。但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，本领域技术人员可以对本发明作各种改进、升级和拓展等，这些等价形式同样在本申请所列权利要求书限定范围之内。

如图1所示，一种放电光谱成像实时监测气溶胶中病毒检测装置，包括特斯拉高频高压放电器1、金属容器3、高透光圆形玻片4、电动滤光镜转盘5、成像镜头6、光子成像或检测器件7、气溶胶进样器、空气泵10、气溶胶后处理装置11，其特征在于：特斯拉高频高压放电器1的放电电极2插入金属容器3内，金属容器3上设有高透光圆形玻片4、进气口和出气口，进气口与两个气溶胶进样器(8，9)和空气泵10相连，出气口与气溶胶后处理装置11相连；高透光圆形玻片4上方设有电动滤光镜转盘5、成像镜头6、光子成像或检测器件7，光子成像或检测器件7通过成像镜头6、电动滤光镜转盘5和高透光圆形玻片4实现对放电电极诱发金属容器3内气溶胶样品弱光辐射的成像或检测。空气泵10用于进行空气或检测后的气溶胶样本清理。所述特斯拉高频高压放电器1的供电电压是在1.5-3.0V之间的直流电。

所述放电电极安装于金属容器的内的适当位置，用于金属容器内放电。

所述金属容器3是一个圆柱形的中空容器，内径为直径33mm,高37mm，中空体积30毫升。

所述高透光圆形玻片4是一个圆形石英玻片，直径35毫米，厚1毫米，固定安装在金属容器的上方。

所述电动滤光镜转盘5用于加载滤光片或陷光片，辅助弱光光谱成像，电动滤光镜转盘5的动作受外部控制系统控制。

所述成像镜头6用于弱光成像的图像聚焦，与光子成像或检测器件7的光子成像器件匹配。

所述气溶胶后处理装置11用于气溶胶样本放电检测后的安全处理，包括两个串联的瓶子，第一个瓶子内装有纯化水，第二个瓶子装有1％的次氯酸盐消毒剂，确保检测后的气溶胶病毒样本在处理后可以安全排放到空气中。

所述光子成像或检测器件7用于检测弱光信号，其工作流程受外部控制系统控制，成像器件可为：电子倍增CCD即EMCCD、像增强CCD、CMOS、雪崩光电二极管APD阵列等。光子检测可为低噪光电倍增管PMT等。

所述气溶胶进样器(8，9)用于气溶胶进样，可手动或电动控制，进样可结合使用或不使用气溶胶过滤器。

所述空气泵10用于金属容器的气溶胶样本的空气清理和干燥。

使用本发明装置时，与超弱生物光子成像系统UBIS一起使用，超弱生物光子成像系统UBIS为专利授权的技术系统，专利号201310524951.4。

利用本发明所述的检测装置和方法，以EMCCD(安道尔，iXon ultra-897)为光子成像器件，以含不同浓度的鸡新城疫苗病毒的气溶胶样本，来检测和评估该技术的可行性以及敏感性和特异性。

实施例：鸡新城疫苗病毒的检测以及敏感性和特异性评估。

一、检测材料：

所用鸡新城疫苗病毒原液样本，通过专业代理购自有资质的动物疫苗生产公司。该疫苗病毒能在普通的生物实验室进行实验和测试。

二、检测步骤

1、气溶胶病毒样品的制备和病毒浓度的估算

本发明所采用气溶胶样品，用一种PVC材料制备了体积约为3.8L(195mm×140mm×140mm)的可密封立方体容器。容器外的医用雾化器通过出口管与雾化器终端连接，对容器内的液体样品进行雾化，产生小于3μm的气溶胶颗粒。雾化器的雾化能力约为0.3ml/min。如果每次雾化时间为2min，则可对2ml液体样品重复雾化3次。因此，参考每次添加到雾化器终端的液体病毒样品中的病毒总数，可估算雾化2min后产生的气溶胶中的病毒浓度：

气溶胶中的病毒浓度(病毒颗粒/微升)≈样本总病毒数×158×10

本实例测试的三个气溶胶病毒浓度分别为280、2800和28000病毒颗粒/微升(vp/ml)。

2、检测流程

基于特斯拉放电的气溶胶弱光辐射光谱成像方流程在675秒(11.25分钟)内完成(图2a)。在气溶胶样品使用或不使用PES过滤器注射完成后，使用电动陷光片或滤光片转轮进行七个不同局部测试窗口(local test window,LTW)的光谱成像测试，其中LTW-1和LTW-7为不加载陷光片或滤光片，其它五个LTWs(LTW-2至LTW-6)加载不同波长的陷光片或滤光片。具体测试流程如下：

1)设置弱光检测系统。

利用UBIS系统对弱光辐射进行了检测，EMCCD作为光子成像器件，EMCCD成像的关键参数是：(1)EMCCD的冷却温度达到-80℃；(2)每帧的曝光时间为500ms；(3)在正常模型下，EMCCD的增益为20；(4)图像读出模式为1×1。

2)取样、过滤和进样

为了确保完全更换进样管(约20ml，160mm长，4mm内径)和检测容器(约30ml)中的滞留空气，每次测试使用100ml气溶胶样品。根据测试方案，在雾化完成后立刻用雾化注射器(250ml)在雾化容器中间的一个接口上手动抽取200ml气溶胶样品，根据测试流程通过样本注射口将100ml样本推注到检测系统中，并在6-8秒内完成。另100ml样本等待下一次检测，方法一样，但推注过程中用PES膜过滤器(0.02μm)过滤，以比较测试同一个气溶胶样品在过滤和非过滤条件下的差异。

3)样本测试

开始正式成像：在电脑上设置时程控制器，外部控制系统各活动部件包括电动陷光片或滤光片转轮在成像过程中按实验设计定时开关，完成相关动作，使实验过程自动进行。设置完成后，按上面所述方法开始气溶胶进样和自动完成一次测试。

3、数据存储和提取

将EMCCD成像获得的一系列图像文件进行存储，使用EMCCD控制软件提取每帧图像的平均灰度值(GV)，以适当的数据文件格式进行储存，做进一步分析。

4、气溶胶光谱变化指数(ASC-index)的数据分析与算法

利用每帧图像的平均灰度值(GV)分析和比较气溶胶样品在不同局部测试窗口(LTWs)中的弱光辐射变化。

局部测试窗口相对GV(RGV)的计算定义如下：

RGV＝Y-X

Y是放电测试的GV，X是帧图像中非放电背景的GV。

气溶胶样品的平均辐射强度(ARI)由相对灰度值(RGVs)定义。

平均辐射强度比(ARI-Ratio)计算如下：

ARI-Ratio＝Y/X

而Y是七个测试LTWs的起始LTW的平均RGVs，X是五个带有陷光片的LTWs之一的平均RGV(ARI-ratio

气溶胶光谱变化指数(ASC-index)的算法定义如下：

ASC-index＝ARI-ratio

1.检测标准建立

结合使用商业软件程序进行数据分析和比较。使用受试者操作特征(ROC)曲线分析评估预测阳性病毒检测结果的最佳截止值。使用曲线下面积(AUC)进行敏感性和特异性评估值的确定，为进一步的样品测试建立标准。

三、测试结果

图2b和图2c是两个代表性盐水气溶胶样品在PES过滤(S-F)和未过滤(S-NF)条件下检测的成像结果相对灰度值散点图，统计分析五个LTWs的ARI-ratios及ASC-index没有显著差异(图2d)，这表明气溶胶颗粒大小不能改变光谱特征。

图2e和图2f是两个代表性病毒气溶胶样品在PES过滤(V-F)和未过滤(V-NF)条件下检测的成像结果相对灰度值散点图，统计分析五个LTWs的ARI-ratios及ASC-index有显著差异(图2g)，其中过滤后的病毒气溶胶中的ARI比率和ASC指数比未过滤的气溶胶中的ARI比率和ASC-index显著降低，但与未过滤的盐水气溶胶中的ARI比率相比显著增加(图2h)。

未过滤的病毒气溶胶中的ASC-index呈现浓度依赖性变化(r2＝0.8668)，但过滤后无变化(r

使用未过滤盐水(S-NF)或过滤病毒(V-F)气溶胶的ASC-index作为参考，评估了未过滤病毒气溶胶(V-NF)的敏感性和特异性(图3a，图3b)。无论浓度差异如何，ASC-index识别病毒气溶胶的ROC曲线显示曲线下面积(AUC)为0.79(95％可信区间，0.69至0.89，p<0.0001)(S-NF与V-NF)或0.84(95％可信区间，0.75至0.93，p<0.0001)(V-F与V-NF)。ASC--index的两个临界值(>3.166和>3.167)显示出最佳的敏感性和特异性，分别为0.71(95％可信区间，0.54至0.85)和0.72(95％可信区间，0.56至0.85)(S-NF与V-NF之比)(图3c)，以及0.70(95％可信区间，0.53至0.84)和0.76(95％可信区间，0.59至0.88)(V-F与V-NF之比)(图3d)。ASC-index识别病毒气溶胶中高浓度组合的ROC曲线显示曲线下面积(AUC)为0.80(95％可信区间，0.69至0.90，p<0.0001)(S-NF与V-NF)或0.85(95％可信区间，0.75至0.94，p<0.0001)(V-F与V-NF)。ASC-index两个临界值(>3.167和>3.168)显示出最佳的敏感性和特异性，分别为0.71(95％可信区间，0.52至0.86)和0.72(95％可信区间，0.56至0.85)(S-NF与V-NF之比)(图3e)，以及0.70(95％可信区间，0.51至0.85)和0.76(95％可信区间，0.59至0.88)(V-F与V-NF之比)(图3f)。

这些结果表明，当气溶胶病毒浓度高于2800粒/微升(vp/ml)时，这种新的检测方法的灵敏度和特异性可以达到70％和76％。因此，可以通过使用ASC-index一个截止值(>3.168)和两条参考曲线(正和负)来建立测试参考标准(RS)，这两条曲线分别显示未过滤和过滤的病毒气溶胶样品中五种LTW的ARI比率变化(图3g)。如果ASC指数为≥3.168，且测试样品的曲线与未过滤病毒气溶胶的阳性RS曲线重叠或以上，表示检测样品阳性。

以上所述，仅是用以说明本发明的具体实施案例而已，并非用以限定本发明的可实施范围，举凡本领域熟练技术人员在未脱离本发明所指示的精神与原理下所完成的一切等效改进、升级和拓展等，仍应由本发明权利要求的范围所覆盖。