RNA m6A甲基化检测试剂在制备预测乳腺癌抗HER2治疗疗效产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及RNA m6A甲基化水平的检测试剂在制备预测乳腺癌抗HER2治疗疗效产品中的应用。

背景技术

根据最新的全球统计数据，乳腺癌已超过肺癌，成为全球发病率最高的恶性肿瘤，2020年估计有230万新病例。人类表皮生长因子受体2(HER2)的扩增和/或过表达发生在所有乳腺癌病例的14–30％中，这些病例被定义为HER2阳性乳腺癌；该亚型与较差的生存结果相关。曲妥珠单抗(商品名为赫赛汀)是第一种人源性抗HER2单克隆抗体，可显著延长早期或转移性HER2阳性乳腺癌患者的生存期。尽管曲妥珠单抗疗效显著，但其耐药性的产生耐药性已成为HER2阳性乳腺癌患者治疗失败的主要原因。曲妥珠单抗耐药在接受辅助治疗的HER2阳性乳腺癌患者中很常见，HERA试验中曲妥珠单抗治疗后1年复发率接近15％，10年复发率超过31％。用曲妥珠单抗治疗的晚期乳腺癌患者的中位无进展生存期约为11个月，大多数患者在接受曲妥珠单抗治疗后一年内出现继发性耐药。虽然已经开发出一系列全新的抗HER2药物并进入临床应用，但仍有一部分患者存在耐药性。在APHINITY研究中，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双重抗HER2策略在治疗早期HER2阳性乳腺癌方面取得了很大进展，然而仍有大约十分之一的患者在六年内复发。在治疗转移性乳腺癌的HER2 CLIMB临床试验中，超过60％的患者在tucatinib(一种抗HER2酪氨酸激酶抑制剂)和曲妥珠单抗治疗后出现进展性疾病。根据HER2阳性转移性乳腺癌的第二线治疗EMILIA临床试验的结果，超过一半的患者对曲妥珠单抗emtansine(TDM-1)治疗无反应。因此，目前迫切需要阐明抗HER2耐药的潜在分子机制，并制定新的治疗策略来克服耐药性。

先前的研究已经揭示了HER2阳性乳腺癌中抗HER2耐药的几种分子机制。首先，HER2的细胞外结构域上曲妥珠单抗结合位点的丧失。例如，p95 HER2截短蛋白或MUC4过表达分别导致曲妥珠单抗结合位点的丧失并随后保护HER2免于在膜外被结合阻断。其次，HER2下游通路的持续性激活是由乳腺癌细胞中下游信号组分的失调引起的，包括PIK3CA突变或PTEN丢失。第三，受体酪氨酸激酶(RTK)的增强表达导致旁路信号传导途径的代偿性激活。例如，IGF1R表达在抗HER2耐药乳腺癌中上调，并在HER2阻断后维持细胞内信号通路激活。第四，肿瘤免疫浸润(TIL)，包括淋巴细胞，树突状细胞和自然杀伤细胞，也参与抗HER2治疗的耐药作用。例如，内吞作用通过降低ADCC介导作用降低对曲妥珠单抗阻断的反应。尽管先前研究已发现许多介导耐药的分子机制，乳腺癌中介导抗HER2耐药的分子机制的完整图景仍不清楚。针对这些靶标开发的大多数抑制剂在临床试验中未能克服抗HER2治疗的耐药。更重要的是，目前缺乏准确预测抗HER2治疗后患者的治疗反应和复发风险的生物标志物。因此，发现新的乳腺癌抗HER2治疗耐药的机制并开发准确的预测检验方法，是当今迫在眉睫的任务。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供RNA m6A甲基化检测试剂在制备预测乳腺癌抗HER2治疗疗效产品中的应用。

具体的，本发明的目的在于提供RNA m6A甲基化水平的检测试剂在制备预测乳腺癌抗HER2治疗敏感性和/或耐药性产品中的应用。

优选的，若乳腺癌组织RNA m6A甲基化水平高，乳腺癌抗HER2治疗敏感性高；若乳腺癌组织RNA m6A甲基化水平低，乳腺癌抗HER2治疗敏感性低。

优选的，所述的产品为定量检测乳腺癌组织RNA m6A甲基化水平的试剂盒。

N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修饰是细胞内RNA表达的重要转录后调控机制。本发明通过斑点印迹分析发现，与曲妥珠单抗敏感细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞中的总m6A甲基化水平极度降低(图1A)。免疫荧光成像还揭示了曲妥珠单抗耐药细胞中总体RNA m6A甲基化水平的降低，表明m6A甲基化水平的下降可能在anti-HER2耐药中起重要作用(图1B)。

病理完全缓解(Pathologic Complete Response,pCR)：术前新辅助anti-HER2治疗后，术后切除的乳腺原发灶中找不到恶性肿瘤的组织学证据，或仅存原位癌成份，是药物敏感的表现。

为了验证乳腺癌组织RNA的m6A甲基化修饰水平是否能预测anti-HER2新辅助治疗疗效，我们提取抗HER2的新辅助治疗前穿刺取样的56个HER2阳性乳腺癌新鲜组织RNA，通过EpiQuik M6A RNA甲基化定量检测试剂盒，检测样本中RNA m6A甲基化水平。发现乳腺癌组织表达低m6A甲基化水平的病人，pCR的比例更低，即对anti-HER2治疗耐药；高m6A甲基化水平的病人，pCR的比例更高，即对anti-HER2治疗敏感(图2A)。同样，将病人根据是否pCR分成2组，发现non-pCR组比pCR组的病人，m6A甲基化的水平更低(图2B)。另外，接受者操作特征曲线(ROC)表明RNA m6A甲基化水平可用作新辅助抗HER2治疗前pCR的预测因子(图3)。

因此，本发明首次发现HER2阳性乳腺癌新鲜组织RNA的m6A甲基化修饰水平对乳腺癌抗HER2治疗疗效具有良好的临床预测价值。通过检测乳腺癌患者新鲜组织中的RNA m6A甲基化修饰水平，从而预测患者生存、预后及抗HER2治疗敏感性情况。本发明的提出为乳腺癌抗HER2治疗提供新的治疗反应预测标志物，同时也为改善乳腺癌抗HER2耐药提供新的治疗靶点。

附图说明

图1为曲妥珠单抗治疗敏感的人乳腺癌细胞和曲妥珠单抗治疗耐药的人乳腺癌细胞RNA的m6A甲基化水平检测结果。A：斑点印迹分析显示，与曲妥珠单抗敏感细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞中的总m6A甲基化水平极度降低。B：免疫荧光成像显示，与曲妥珠单抗敏感细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞中的m6A甲基化水平降低。其中，Parental：原代(敏感细胞)，TrazR：诱导后(耐药细胞)。MB：亚甲基蓝染色。

图2为HER2阳性乳腺癌患者新鲜组织RNA的m6A甲基化水平检测结果。A：乳腺癌组织RNA m6A甲基化水平低的病人，pCR的比例更低，即对抗HER2治疗耐药，RNA m6A甲基化水平高的病人，pCR的比例更高，即对抗HER2治疗敏感。B：将病人根据是否pCR分成2组，发现non-pCR组比pCR组的病人，m6A甲基化的水平更低。其中，pCR：Pathologic CompleteResponse，即病理完全缓解。

图3为接受者操作特征曲线(ROC)分析乳腺癌组织RNA m6A甲基化修饰水平可用作新辅助抗HER2治疗前pCR的预测因子。其中，pCR：Pathologic Complete Response，即病理完全缓解。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1.细胞系和试剂

人乳腺癌细胞系(SKBR3，BT474和AU565)购自American Type CultureCollection并按照制造商的说明进行培养。通过三个月的1μM曲妥珠单抗处理进行选择来诱导rSKBR3，rBT474和rAU565细胞。将这些获得的曲妥珠单抗耐药细胞系(rSKBR3，rBT474和rAU565细胞)在含有曲妥珠单抗的常规培养基中连续培养，曲妥珠单抗在实验的前四周会进行撤药处理。细胞系传代不超过六个月，并通过STR分析进行鉴定。任何细胞系均未发现支原体感染。曲妥珠单抗获取自Roche(Basel，Switzerland)。

2.斑点印迹分析

首先，使用Trizol分别提取上述曲妥珠单抗敏感的人乳腺癌细胞系、曲妥珠单抗耐药人乳腺癌细胞系的RNA。通过在95℃加热3分钟使分离的RNA(每组200ng)变性，然后立即置于冰上冷却。将稀释液点样在核酸转移优化的Amersham Hybond-N+膜上(GEHealthcare)。膜在紫外光下交联并用1×PBST缓冲液洗涤。用PBST中的5％脱脂乳封闭膜后，将其与抗m6A抗体(202003，Synaptic Systems)在4℃温育过夜。然后，将膜与二抗AlexaFluor-488(1:2000，Invitrogen)在室温下温育1小时。使用化学发光试剂(Beyotime)显影免疫印迹。将相同的200ng mRNA点在膜上，用0.3M乙酸钠(pH 5.2)中的0.02％亚甲蓝染色2小时，并用RNase-free的水洗涤1小时。

结果见图1A。图1A结果显示，与曲妥珠单抗敏感细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞中的总体RNA m6A甲基化修饰水平极度降低。

3.免疫荧光成像

首先将细胞置于薄玻璃底培养皿进行贴壁处理，待细胞完全贴壁后，吸干培养基，随后在细胞上覆盖一层PBS稀释的4％甲醛，室温下固定细胞15分钟，后吸干固定液，用PBS漂洗3次，每次5分钟。在封闭缓冲液中封闭标本60分钟，后吸去封闭缓冲液，将切片与抗m6A一抗(Synaptic Systems,202003)在4℃下进一步温育过夜。然后，将样品用PBS洗涤3次，并与抗兔二抗，即Alexa Fluor-488(1:2000，Invitrogen)一起温育。后滴上含荧光猝灭剂的DAPI并封片。使用Zeiss LSM 880共聚焦显微镜观察结果，并获得图像。

结果见图1B。图1B结果显示，与曲妥珠单抗敏感细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞中的总体RNA m6A甲基化修饰水平降低。

4.HER2阳性乳腺癌新鲜组织RNA m6A甲基化水平的检测

为了验证乳腺癌组织RNA m6A甲基化水平是否能预测anti-HER2新辅助治疗疗效，我们提取抗HER2的新辅助疗法之前获得的56个HER2阳性乳腺癌新鲜组织RNA，通过EpiQuikM6A RNA甲基化定量检测试剂盒(比色法)(购自武汉艾美捷科技有限公司，货号：P-9005)检测样本中m6A甲基化水平。发现乳腺癌组织表达低m6A甲基化水平的病人，pCR的比例更低，即对anti-HER2治疗耐药；高m6A甲基化水平的病人，pCR的比例更高，即对anti-HER2治疗敏感(图2A和表1)。同样，将病人根据是否pCR分成2组，发现non-pCR组比pCR组的病人，m6A甲基化的水平更低(图2B)。另外，接受者操作特征曲线(ROC)表明m6A甲基化水平可用作新辅助抗HER2治疗前pCR的预测因子(图3)。

表1.HER2阳性乳腺癌新鲜组织RNA m6A甲基化水平与pCR的关系

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。