嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗癫痫药物技术领域，具体涉及嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫疾病的药物中的应用。

背景技术

癫痫是神经元异常放电导致大脑功能短暂性失常的慢性神经系统疾病。60％～70％癫痫患者可通过抗癫痫发作药物(Antiseizure medications，ASMs)控制，但仍有约30％～40％为药物难治性，即合理使用两种ASMs治疗后仍不能控制发作而发展为难治性癫痫。反复癫痫发作对患者的认知和行为、儿童患者的脑功能发育、以及患者及家庭的生活质量均造成不同程度的影响。因此寻求癫痫的治疗方法，特别是难治性癫痫的治疗方法具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫疾病的药物中的应用。嗅黏膜间充质干细胞能够减轻癫痫发作的症状与次数，实现癫痫的治疗，减轻炎症免疫反应，从而改善脑组织微环境，促进受损神经元的修复，最终逆转难治性癫痫所致的脑萎缩。

本发明提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫疾病的药物中的应用。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备改善癫痫所致以下(a)～(c)任一项或两项以上功能降低的药物中的应用：(a)认知功能，(b)运动功能，(c)触觉功能。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备减轻癫痫所致炎症免疫反应的药物中的应用。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备减少促炎症因子TNF、IL-1b和IL-6的表达和增加抗炎症因子IL-10的表达的药物中的应用。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备免疫调节药物中的应用。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫所致脑萎缩的药物中的应用。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备改善癫痫导致的脑组织微环境破坏的药物中的应用。

优选的是，所述癫痫为难治性癫痫。

优选的是，所述药物的剂型包括注射剂。

优选的是，所述嗅黏膜间充质干细胞包括人源嗅黏膜间充质干细胞。

本发明提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫疾病的药物中的应用。试验结果表明，人源嗅黏膜间充质干细胞经大脑立体定位注射注入慢性癫痫小鼠颅内后，能够减轻癫痫发作的次数与症状；改善慢性癫痫小鼠的认知功能、运动功能和触觉功能。而且，人源嗅黏膜间充质干细胞能够通过减少促炎症因子TNF，IL-1b和IL-6的表达，增加抗炎症因子IL-10的表达，减轻炎症反应；提高调节性T细胞CD4/FOXP3，CD4/CD25的表达，有效发挥免疫调节作用；同时，通过人源嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的生成，促进少突胶质细胞和神经元的生成，从而减少脱髓鞘和神经元丢失，改善脑组织微环境，促进受损神经元的修复，最终逆转慢性癫痫所致的脑萎缩。

附图说明

图1为本发明提供的流式细胞仪检测人源嗅黏膜间充质干细胞表面标记物的表达结果图；其中，A为OM-MSCs表达CD73表面标记物，B为OM-MSCs表达CD90表面标记物，C为OM-MSCs表达CD105表面标记物，D为不表达CD31表面标记物，E为不表达CD34表面标记物，F为不表达CD45表面标记物；

图2为本发明提供的脑电图及脑核磁共振MRI评估嗅黏膜间充质干细胞移植后改善癫痫症状及脑萎缩结果图；其中，A为嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫脑电图检测结果图，B和C为嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫所致的脑萎缩的核磁共振MRI检测后脑室面积量化结果及扫描图结果图；

图3为本发明提供的行为学评估嗅黏膜间充质干细胞移植后促进认知功能的恢复结果图；其中，A和B为Y迷宫试验，C和D为对象位置试验，E和F为新对象识别试验；

图4为本发明提供的行为学评估嗅黏膜间充质干细胞移植后促进运动功能及触觉的恢复结果图；其中，A为旋臂试验，B为平衡木试验，C为握力试验，D和I为足迹试验，J为vonFrey试验；

图5为本发明提供的mRNA、ELISA和免疫荧光检测嗅黏膜间充质干细胞移植后改善炎症反应，提高免疫调节作用结果图；其中，A为促炎症因子白介素-1b(IL-1b)mRNA表达水平的变化，B为白介素-16(IL-16)mRNA表达水平的变化，C为肿瘤坏死因子(TNF)mRNA表达水平的变化，D为抗炎症因子白介素-10(IL-10)mRNA表达水平的变化，E为促炎症因子白介素-1b(IL-1b)蛋白表达水平的变化，F为白介素-16(IL-16)蛋白表达水平的变化，G为肿瘤坏死因子(TNF)蛋白表达水平的变化，H和K为调节性T细胞中CD4+CD25+双阳性和CD4+FOXP3+细胞数量变化的免疫荧光图及量化结果；

图6为本发明提供的免疫荧光与免疫组化检测嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后改善脑组织微环境结果图；其中，A为小鼠海马组织区域星形胶质细胞GFAP表达免疫荧光图，B为小鼠海马组织区域小胶质细胞IBA1表达免疫荧光图，C为小鼠海马组织区域少突胶质细胞OLIG2表达免疫组化图，D为小鼠海马组织区域神经元MAP2表达免疫荧光图，E为小鼠海马组织区域神经元TUBB3表达免疫荧光图。

具体实施方式

本发明提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫疾病的药物中的应用。在本发明中，所述癫痫优选为难治性癫痫，本发明优选采用慢性癫痫小鼠模型模拟难治性癫痫疾病特点。难治性癫痫因治疗周期长，且疗效欠佳，故在动物模型的选择上本发明优选采用慢性癫痫动物模型对难治性癫痫进行研究。本发明优选采用慢性癫痫小鼠模型模拟难治性癫痫疾病发生发展过程，采用小动物脑立体定位采用微注射器注射嗅黏膜间充质干细胞。在本发明中，效果的验证试验优选将人源嗅黏膜间充质干细胞经脑立体定位注射注入慢性癫痫小鼠颅内。试验结果表明，嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型小鼠的癫痫发作次数、症状。在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂。在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞优选包括人源嗅黏膜间充质干细胞。即本发明所述嗅黏膜间充质干细胞的来源优选为人嗅黏膜组织。本发明对嗅黏膜间充质干细胞的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规方法即可，如S1：采用鼻内窥镜获取人鼻腔内黏膜组织；S2:采用贴壁培养法培养嗅黏膜间充质干细胞。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备改善癫痫所致以下(a)～(c)任一项或两项以上功能降低的药物中的应用：(a)认知功能，(b)运动功能，(c)触觉功能。在本发明中，所述癫痫优选包括慢性癫痫或难治性癫痫。在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂。在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞优选包括人源嗅黏膜间充质干细胞。实施例结果表明，嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型小鼠的认知功能，可显著促进慢性癫痫模型小鼠的运动及触觉功能的恢复。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备减轻癫痫所致炎症免疫反应的药物中的应用。在本发明中，所述癫痫优选包括慢性癫痫或难治性癫痫。在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂。在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞优选包括人源嗅黏膜间充质干细胞。实施例结果表明，嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型中的炎症反应。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备减少促炎症因子TNF、IL-1b和IL-6的表达和增加抗炎症因子IL-10的表达的药物中的应用。在本发明中，所述癫痫优选包括慢性癫痫或难治性癫痫。在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂。在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞优选包括人源嗅黏膜间充质干细胞。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备免疫调节药物中的应用。在本发明中，所述癫痫优选包括慢性癫痫或难治性癫痫。在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂。在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞优选包括人源嗅黏膜间充质干细胞。实施例结果表明，嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著提高免疫调节作用。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫所致脑萎缩的药物中的应用。在本发明中，所述癫痫优选包括慢性癫痫或难治性癫痫。在本发明中，所述药物的剂型优选包括注射剂。在本发明中，所述嗅黏膜间充质干细胞优选包括人源嗅黏膜间充质干细胞。实施例结果证明，嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善脑萎缩现象。

本发明还提供了嗅黏膜间充质干细胞在制备改善脑组织微环境的药物中的应用。嗅黏膜间充质干细胞治疗还能够改善神经炎症和损伤的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生；与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠脑组织中的少突胶质细胞标志物OLIG2和神经元标志物MAP2和TUBB3的含量显著升高，嗅黏膜间充质干细胞治疗改善了改善了脱髓鞘和神经元细胞丢失的情况；嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型中的脑组织微环境。

下面结合具体实施例对本发明所述的嗅黏膜间充质干细胞在制备治疗癫痫疾病的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.人源嗅黏膜间充质干细胞的获取、培养及鉴定(参考专利CN201711318656.8)：

人源嗅黏膜间充质干细胞的获取均来自健康受试者，在签署自愿同意书及伦理委员会批准后操作。操作前进行鼻毛清理，滴加氯霉素滴剂，一天四次，每次两滴，连续三天。获取鼻黏膜前进行鼻内浸润麻醉，于中鼻甲内侧根部，取2～3块直径约为0.5cm的组织块。鼻黏膜组织块取出后立即置于低温PBS保存；随后采用含青霉素200U/ml和链霉素200U/ml的高糖DMEM/F12培养基漂洗3次去除血迹，转移至含10％胎牛血清(去除血清外泌体)的完全培养基，用眼科剪分离成0.5mm

2.慢性癫痫小鼠模型制备及实验分组：

本发明采用雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体重18～25g。小鼠在无菌隔离器中每笼饲养5只小鼠，在22℃和50％的湿度下进行12小时的光-暗循环。建立匹罗卡品癫痫小鼠模型。先用东莨菪碱(1mg/kg，腹腔注射)预处理小鼠30min，然后用匹罗卡品(300mg/kg，40mg/mL，腹腔注射)给药。造模成功后，30分钟内小鼠发生抽搐，2小时内出现癫痫发作。癫痫状态持续24小时，潜伏期无抽搐(4～44天)，然后进入慢性期每周癫痫发作2～3次，每周1次。

在潜伏期间给予通过小动物立体定向仪注射嗅黏膜间充质干细胞。用20μL/g0.3％戊巴比妥钠短暂麻醉小鼠。剃去小鼠颅骨上的毛发后，用两根耳棒将小鼠固定在外耳道内，直至小鼠头部水平且不能自由移动。开颅术，中线切口后，观察前囟，然后将注射器放置在定位器上定位前囟，然后定位海马(前囟下方2.3mm，矢状线旁1.8mm)并标记。用3.0％H

实验分组：将小鼠随机分为4组(每组n＝10):正常对照组(Vehiclegroup)、正常对照+人源嗅黏膜间充质干细胞治疗组(Vehicle+OM-MSCsgroup)、慢性癫痫模型组(Pilogroup)，和慢性癫痫模型+人源嗅黏膜间充质干细胞治疗组(Pilo+OM-MSCs group)。

3.组织标本的留取：

实验的小鼠在植入人源嗅黏膜间充质干细胞后1个月实施安乐死。实验小鼠用20uL/g 0.3％戊巴比妥钠深度麻醉，经心脏灌注30mL生理盐水，然后加入40mL 4％多聚甲醛，快速取出大脑，用4％多聚甲醛固定4～6h，然后用PBS冷冻保存。

4.主要观察指标：

①各实验组癫痫症状及发作次数的记录，磁共振MRI检测各实验组脑萎缩情况；②各实验组行为学评估；③mRNA，ELISA和免疫荧光检测各实验组脑组织炎症因子及调节性T细胞的标志物的表达；④免疫荧光检测各实验组脑组织神经元，少突胶质细胞及小胶质细胞标志物的表达。

5.统计学分析：

实验中涉及到计量资料用x±s表示，采用SSPS 17.0软件进行统计学分析，检验水平为α＝0.05。样本均数间的多重比较，方差行F检验判断方差齐性，方差齐性检验合格时用LSD-t检验，方差不齐时采用秩和检验，P<0.05为有差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。

6.结果：

1)嗅黏膜间充质干细胞表面标记物鉴定结果：参照图1，经流式细胞术检测人嗅黏膜间充质干细胞表达间充质干细胞一般标记物，包括图1中的A、B和C中表面标记CD73、CD90、CD105高表达，图1中的D、E和F中造血干细胞标记物CD31、CD34、CD45低表达。综上所述，图1结果提示该细胞为来源于嗅黏膜的间充质干细胞。

2)改善慢性癫痫发作的次数与症状及脑萎缩现象：参照图2中的A，通过脑电图评估各组小鼠的癫痫发作次数和症状的变化，N＝每组10只；图2中的A的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠的脑电图的振幅和频率明显降低。参照图2中的B和C，通过核磁共振MRI评估各组小鼠的脑萎缩变化情况，比例尺:3毫米；图2中的B和C的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠的脑室明显缩小。综上所述，图2结果提示嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型小鼠的癫痫发作次数、症状，并改善脑萎缩现象，实现癫痫的治疗。

3)认知功能的恢复：参照图3，通过Y迷宫试验(图3中的A和B)评估空间记忆能力，对象位置试验(图3中的C和D)和新对象识别试验(图3中的E和F)评价小鼠的学习记忆能力变化情况。N＝每组10只，每只小鼠3次重复。数值以均数±SD表示。图3结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠的认知能力明显提高，包括空间记忆能力及学习记忆能力的显著改善。综上所述，图3结果提示嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型小鼠的认知功能。

4)运动功能及触觉的恢复：参照图4中的A～图4中的I，通过转棒疲劳试验检测运动协调功能和疲劳影响(图4中的A)、平衡木试验(图4中的B)检测小鼠平衡能力、肌力以及运动协调力变化，握力试验(图4中的C)检测肢体的握力变化，和足迹试验(图4中的D～图4中的I)评估小鼠的步态、步距与运动协调力变化；图4中的A～图4中的I的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠的运动能力明显改善。参照图4中的J，采用von Frey试验评估触觉(J)。N＝每组10只，每只小鼠3次重复。数值以均数±SD表示。图4中的J的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠的触觉能力显著恢复。综上所述，图4结果提示嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著促进慢性癫痫模型小鼠的运动及触觉功能的恢复。

5)改善炎症反应，提高免疫调节作用：参照图5中的A～图5中的D，通过实时荧光定量PCR检测各组小鼠的脑组织中促炎症因子白介素-1b(IL-1b)mRNA表达水平的变化(图5中的A)、白介素-16(IL-16)mRNA表达水平的变化(图5中的B)、肿瘤坏死因子(TNF)mRNA表达水平的变化(图5中的C)，抗炎症因子白介素-10(IL-10)mRNA表达水平的变化(图5中的D)，每组N＝18，数值以均数±SD表示；图5中的A～图5中的D的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠脑组织中促炎症因子白介素-1b(IL-1b)、白介素-16(IL-16)、肿瘤坏死因子(TNF)的mRNA表达水平明显降低，抗炎症因子白介素-10(IL-10)表达水平明显升高。参照图5中的E～图5中的G，通过ELISA分析各组小鼠脑组织中促炎症因子白介素-1b(IL-1b)蛋白表达水平的变化(图5中的E)、白介素-16(IL-16)蛋白表达水平的变化(图5中的F)、肿瘤坏死因子(TNF)的蛋白表达水平的变化(图5中的G)；图5中的A～图5中的D的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠脑组织中促炎症因子白介素-1b(IL-1b)、白介素-16(IL-16)、肿瘤坏死因子(TNF)的蛋白表达水平明显下降。参照图5中的H～图5中的K，通过免疫荧光染色检测各组小鼠脑组织中调节性T细胞中CD4+CD25+双阳性和CD4+FOXP3+免疫荧光图(图5中的H)JI细胞数量量化结果(图5中的K)；图5中的H～图5中的K的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠脑组织中CD4+CD25+双阳性和CD4+FOXP3+数量明显升高，提示调节性T细胞被募集到损伤脑组织中，嗅黏膜间充质干细胞移植治疗可有效提高免疫调节作用。综上所述，图5结果提示嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型中的炎症反应，提高免疫调节作用。

6)改善脑组织微环境；参照图6中的A和图6中的B，通过免疫荧光染色检测各组小鼠海马组织区域星形胶质细胞(图6中的A，GFAP红色)，小胶质细胞(图6中的B，IBA1红色)含量的变化；图6中的A和图6中的B的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠脑组织星形胶质细胞标志物GFAP和小胶质细胞标志物IBA1的含量降低，提示嗅黏膜间充质干细胞治疗改善了神经炎症和损伤的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生。参照图6中的C～图6中的E，通过免疫组化和免疫荧光染色检测各组小鼠海马组织区域少突胶质细胞(图6中的C，OLIG2棕色)，神经元(图6中的D，MAP2红色，图6中的E，TUBB3绿色)含量的变化，DAPI染色的细胞核显示为蓝色；图6中的C～图6中的E的结果显示：与慢性癫痫模型组相比，经人嗅黏膜间充质干细胞移植治疗慢性癫痫模型组中小鼠脑组织中的少突胶质细胞标志物OLIG2和神经元标志物MAP2和TUBB3的含量显著升高，提示嗅黏膜间充质干细胞治疗改善了改善了脱髓鞘和神经元细胞丢失的情况。综上所述，图6结果提示嗅黏膜间充质干细胞移植治疗后可显著改善慢性癫痫模型中的脑组织微环境。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。