一种四类酒中食品添加剂的检测方法

技术领域

本发明属于食品添加剂检测技术领域，具体地说，涉及一种四类酒中食品添加剂的检测方法。

背景技术

目前，由于生产厂家原辅料进厂把关不严，检测手段和技术设备比较落后，对与添加剂相关的标准、法规了解不够，理解把握不足，以及生产工艺和口感的要求等原因，酒类饮品超范围、超限量使用食品添加剂的现象屡见不鲜，如白酒中甜蜜素、糖精钠；葡萄酒中三氯蔗糖；果酒中苯甲酸、合成着色剂；露酒中甜蜜素、三氯蔗糖等添加剂常常被超范围或超限量使用。

目前我国国家标准和行业标准中没有能够同时检测这四类酒中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、三氯蔗糖、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝的方法标准。如果要检测这12种添加剂，则需要用到多个检验方法，其周期长、检测成本高、对企业和监管时效都不利。

发明内容

针对现有技术中上述的不足，本发明的目的在于提供了一种四类酒中食品添加剂的检测方法；该方法应用特定工艺条件下的高效液相色谱-三重四级杆质谱技术，能够同时测定四类酒中12种食品添加剂，探索了同时使用分子离子、特征碎片离子和保留时间作为定性依据，能够适用于对多种食品添加剂进行检测。

为了达到上述目的，本发明采用的解决方案是：

本发明提供了一种四类酒中食品添加剂的检测方法，食品添加剂包括苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、三氯蔗糖、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝；将各食品添加剂配置成1000mg/ml的标准物质溶液；

检测方法包括：(1)样品处理：称取酒样2.5g，置于50mL烧杯中，于60℃水浴上30min，用初始流动相洗涤残渣并全部转移至25mL容量瓶中，定容并摇匀，经0.22μm水相微孔滤膜过滤，获得待测样品，上液相色谱-质谱联用仪检测；初始流动相包括体积比为5：95的A相和B相；A相包括体积比为2：1的甲醇和乙腈，B相为5mmol/L的乙酸铵水溶液；

需要说明的是，在本发明中，由于检测项目涉及多种食品添加剂，前处理必须兼顾绝大多数组分的提取效率，在本申请中，大多数添加剂均为钠盐或钾盐，具有较好的水溶性，但实验偶然发现，采用初始流动相溶解标准物质相较于采用纯水溶解，能够显著增加几种合成着色剂的响应值；此外，实验表明：流动相A采用本申请上述甲醇+乙腈(2+1)能够更好地减小峰面积的重复性误差，流动相B采用5mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1％氨水)能够使各组分响应值达到相对较高值；

(2)所用仪器的条件设定：色谱的条件包括：色谱柱为AcclaimTM120 C18柱；流动相：A相和B相；色谱柱温为40℃；进样量为30μL；洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.4mL/min；检测所用时间为6min；

需要说明的是，本申请中，由于检测组分多达12种，且含有胭脂红和苋菜红两种同分异构体，快速、高效的分离尤为重要；本申请采用上述工艺条件下进行液相色谱检测，尤其是采用了AcclaimTM120 C18柱(3μm，30×100mm，赛默飞公司)做为分析柱，配合本申请的流动相进行梯度洗脱，结果表明绝大多数添加剂分离良好，全部组分在6min内出峰，包括系统平衡和冲洗残留物在内，仅需20.001min即可完成一个样品的筛查；

质谱的条件包括：离子化模式为电喷雾离子源；扫描方式为负离子模式；检测方式为多反应监测；离子化电压为-4500V；喷雾气压力为55Psi；辅助加热气压力为55Psi；气帘气压力为15Psi；离子源温度为300℃；喷撞气为:5；接口加热：打开；去簇电压为15-70V；碰撞能量为7-79eV；

需要说明的是，去簇电压和碰撞能量是质谱参数中最重要的2个；去簇电压能给个直接影响各组分的灵敏度，随着去簇电压的升高，各添加剂响应值逐渐增强，但去簇电压过高可能导致色素分子离子在离子源内发生碰撞解离，反而影响母离子的灵敏度；在本申请中，控制去簇电压15～70V、碰撞能量为7-79eV，结果表明绝大部分添加剂可获得较强的子离子；

(3)各食品添加剂的保留时间和监测离子的确定：称取2.5g四类酒阴性基质(即为不包含待检测食品添加剂的酒样)于25ml容量瓶中，加入相应的标准物质溶液，用初始流动相定容，得到标准工作液；将标准工作液通过质谱仪进行母离子的扫描，确定各食品添加剂的监测离子和定量离子对，然后将标准工作液进行液相色谱检测，确定各食品添加剂的保留时间；

(4)待测样品的测试：取待测样品进样，进样体积为30μL，作液相色谱-质谱检测，根据保留时间和12种食品添加剂的监测离子对待测样品进行定性分析。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，乙酸铵溶液含有0.1％的氨水。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，乙酸铵溶液的配置包括：称取0.39g的乙酸铵，用水溶解并稀释至1000mL，摇匀后经0.22μm水相微孔滤膜过滤备用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，梯度洗脱的参数设置如下：初始至5min时A相的体积占5％，B相的体积占95％；5min～10min时，A相的体积为70％，B相的体积为30％；10min～12min时，A相的体积为5％，B相的体积为95％；12min～20.001min时，A相的体积为5％，B相的体积为95％。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，液相色谱仪采用赛默飞UltiMate3000型高效液相色谱仪。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，质谱仪采用AB SCIEX API3200型三重四级杆质谱仪。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，四类酒包括白酒、葡萄酒、果酒和露酒。

本发明提供的一种四类酒中食品添加剂的检测方法的有益效果是：

本发明提供的该种四类酒中食品添加剂的检测方法采用本申请特定工艺条件下的高效液相色谱-三重四级杆质谱方法，能够同时实现对白酒、果酒、葡萄酒、露酒中多种食品添加剂进行检测，具有分离效率高、定性定量结果准确的特点，可用于多种食品添加剂的检测，该方法具有广阔的应用前景。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种四类酒中食品添加剂的检测方法，包括：

食品添加剂包括苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、三氯蔗糖、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝；将各食品添加剂配置成1000mg/ml的标准物质溶液；

(1)样品处理：称取酒样2.5g，置于50mL烧杯中，于60℃水浴上30min，用初始流动相洗涤残渣并全部转移至25mL容量瓶中，定容并摇匀，经0.22μm水相微孔滤膜过滤，获得待测样品，上液相色谱-质谱联用仪检测；初始流动相包括体积比为5：95的A相和B相；A相包括体积比为2：1的甲醇和乙腈，B相为5mmol/L的乙酸铵水溶液；

(2)所用仪器的条件设定：色谱的条件包括：液相色谱仪采用赛默飞UltiMate3000型高效液相色谱仪；色谱柱为AcclaimTM120 C18柱；流动相：A相和B相；色谱柱温为40℃；进样量为30μL；洗脱方式为梯度洗脱；流速为0.4mL/min；检测所用时间为6min；

梯度洗脱的参数设置如下：初始至5min时A相的体积占5％，B相的体积占95％；5min～10min时，A相的体积为70％，B相的体积为30％；10min～12min时，A相的体积为5％，B相的体积为95％；12min～20.001min时，A相的体积为5％，B相的体积为95％；

质谱的条件包括：质谱仪采用AB SCIEX API3200型三重四级杆质谱仪；离子化模式为电喷雾离子源；扫描方式为负离子模式；检测方式为多反应监测；离子化电压为-4500V；喷雾气压力为55Psi；辅助加热气压力为55Psi；气帘气压力为15Psi；离子源温度为300℃；喷撞气为:5；接口加热：打开；去簇电压为15～70V；碰撞能量为7-79eV；上述12种添加剂的主要参考质谱参数见表1：

表1 12种添加剂的主要参考质谱参数

(3)各食品添加剂的保留时间和监测离子的确定：称取2.5g四类酒阴性基质于25ml容量瓶中，加入相应的标准物质溶液，用初始流动相定容，得到标准工作液；将标准工作液通过质谱仪进行母离子的扫描，确定各食品添加剂的监测离子和定量离子对，然后将标准工作液进行液相色谱检测，确定各食品添加剂的保留时间，各食品添加剂的参考保留时间(RT)为：苯甲酸(2.95min)、山梨酸(3.35min)、脱氢乙酸(2.95min)、糖精钠(3.54min)、三氯蔗糖(5.35min)、甜蜜素(4.23min)、安赛蜜(2.68min)、柠檬黄(4.24min)、日落黄(4.25min)、苋菜红(3.16min)、胭脂红(3.82min)、亮蓝(5.66min)。

(4)待测样品的测试：取待测样品进样，进样体积为30μL，作液相色谱-质谱检测，根据保留时间和12种食品添加剂的监测离子对待测样品进行定性分析。

实验例1方法的定性、定量、检出限和定量限

进行样品测定时，若样品色谱峰的保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后，样品谱图中各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差符合欧盟2002/657/EC中规定的范围(其Q1/Q3离子对(母离子/子离子)见表1)，则可判断样品中检出相应组分。

但对于苯甲酸和山梨酸，由于在ESI-检测模式下，只产生1个二级碎片离子，无法进行碎片离子的相对丰度计算，本方法采用保留时间结合1个Q1/Q3离子对进行定性。

采用在阴性基质中添加待测食品添加剂的方法，依据MRM色谱峰的信噪比(S/N)大于3倍确定检出限(LOD)，S/N大于10倍确定最低定量限(LOQ)，得到12种目标组分的LOD和LOQ见表2。

表2 12种食品添加剂的检出限及定量限

表2结果表明，各食品添加剂的LOD和LOQ分别为0.01-0.71mg/kg和0.05-2.37mg/kg。

实验例2准确度与精密度试验

分别准确称取不含待测化合物的白酒、葡萄酒、果酒、露酒样品2.5g于25mL容量瓶中，用微量移液器准确加入一定量的各添加剂标准溶液，用纯水定容至刻度，混匀，配成低、中、高3个浓度水平的质量控制(QC)样品，每一浓度进行6次平行测定(见表3)。

表3四类酒中12种食品添加剂的回收率及相对标准偏差(RSD)(n＝6)

表3结果表明，四类酒中低、中、高3个浓度水平的各食品添加剂均具有较好的准确度与精密度。12种目标化合物在白酒中的回收率为81.3-113.7％，相对标准偏差(RSDs)为1.1-11.2％；在葡萄酒中的回收率为80.0-112.5％，RSDs为1.2-12.3％；在果酒中的回收率为80.2-112.9％，RSDs为1.7-10.0％；在露酒中的回收率为80.3-104.5％，RSDs为1.4-10.8％。

实验例3检测方法的应用

按照实施例1提供的检测方法对市售的23份白酒和24份葡萄酒、12份果酒、12份露酒中的12种食品添加剂进行测定。

其中，葡萄酒中检出含有山梨酸的样品9份，含量在0.03-0.17g/kg之间。

果酒中检出含有山梨酸的样品8份，含量在0.01-0.19g/kg之间；检出含有三氯蔗糖的样品6份，含量在0.01-0.22g/kg之间；检出含有糖精钠的样品6份，含量在0.01-0.04g/kg之间；检出含有甜蜜素的样品5份，含量在0.18-0.29g/kg之间；检出含有苋菜红的样品3份，含量在0.01-0.03g/kg之间；检出含有苯甲酸的样品2份，含量在0.01-0.13g/kg之间。

露酒中检出含有山梨酸的样品4份，含量在0.07-0.17g/kg之间；检出含有三氯蔗糖的样品4份，含量在0.05-0.10g/kg之间；检出含有甜蜜素的样品3份，含量在0.14-0.61g/kg之间；检出含有胭脂红的样品1份，含量为0.23g/kg；检出含有苋菜红的样品1份，含量为0.05g/kg；检出含有亮蓝的样品1份，含量为0.01g/kg；检出含有苯甲酸的样品1份，含量为0.07g/kg。

从检测结果可以看出，葡萄酒中防腐剂的检出率为38％左右。果酒中人工合成甜味剂的检出率为58％，防腐剂的检出率为75％，人工合成着色剂的检出率为25％。露酒中人工合成甜味剂的检出率为33％，防腐剂的检出率为33％，人工合成着色剂的检出率为25％。

根据GB2760规定，所检样品的12种防腐剂、甜味剂、合成着色剂均在使用要求范围内，但需注意的是配制酒使用复合甜味剂的现象较多，且这些甜味剂还不相同，说明在市场上已存在将多种人工合成甜味剂添加到配制酒当中，这应引起食品安全监管部门足够的重视，以应对潜在的食品安全风险。

综上所述，采用本发明提供的该种四类酒中食品添加剂的检测方法；该方法应用特定工艺条件下的高效液相色谱-三重四级杆质谱技术，能够同时测定四类酒中12种食品添加剂，探索了同时使用分子离子、特征碎片离子和保留时间作为定性依据，能够适用于对多种食品添加剂进行检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。