一种电化学β-羟丁酸测试条及其制作方法

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，具体为一种电化学β-羟丁酸测试条及其制作方法。

背景技术

随着糖尿病患病率的与日俱增，作为最常见的急性并发症糖尿病酮症及糖尿病酮症酸中毒的诊治仍是关注的焦点，糖尿病酮症不仅会给患者引起一系列不适症状，而且当其发展至糖尿病酮症酸中毒时还会危及生命安全，及时准确地检测酮体水平是十分关键的，是预知酮症酸中毒的重要手段，检测血β-羟丁酸比检测乙酰乙酸更加准确，更有利于诊断及治疗；血β-羟丁酸的检测主要是通过光学法的β-羟丁酸检测试剂盒，适用于大型血液生化分析仪，但该方法存在的问题：需要使用特殊装置，测定所需血量较多、时间较长，价格昂贵，只适合在大型医院中进行，不能在小型诊所或是病人家庭中使用，难以满足便携式POCT产品的需求。

类似检测血糖的POCT产品也有很多报道，但是β-羟丁酸的正常生理浓度低于0.6mmol/L，超过该浓度即有酮症酸中毒的倾向，因此要求检测试纸相比于血糖要有更低的检测灵敏度，从而保证极低浓度检测结果的准确性；此外随着电化学传感器有效日期临近，干式试剂的试剂层中组分的物理和化学变化(比如酶活的逐步丧失，电子介体铁氰化钾被还原等)均会导致电化学传感器的准确度变差；β-羟丁酸尿酸检测急需要一种测试灵敏度高、不受其他化学品干扰、结果准确稳定性好的POCT产品。

鉴于此，本申请拟提出一种电化学β-羟丁酸测试条及其制作方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电化学β-羟丁酸测试条及其制作方法，以解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种电化学β-羟丁酸测试条，包括基板、导电层、绝缘层、丝网印刷电极、试剂层、双面胶层和亲水层，所述双面胶层的下表面与试剂层的上表面粘接，且所述双面胶层的上表面与亲水层的下表面粘接，所述丝网印刷电极包括HCT电极、对电极一、对电极二和工作电极，所述试剂层通过溶液固定工序配置于工作电极、对电极一和对电极二上表面，且所述试剂层包括高分子化合物、生物酶、双电子媒介体、缓冲溶液、表面活性剂和稳定剂，所述基板采用PET材质制成。

本发明进一步设置为：所述高分子化合物为羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素中的一种或多种，所述生物酶包括β-羟丁酸脱氢酶和辅酶，且所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

本发明进一步设置为：所述双电子媒介体为PMS/PES结合Ru(NH3)

6Cl3，且其中两种媒介体的质量配比为1:15。

本发明进一步设置为：所述缓冲溶液包括胺系缓冲剂和具有羧基的缓冲剂，所述胺系缓冲剂包括胺系缓冲液Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES和Tricine中的一种或多种。

本发明进一步设置为：所述具有羧基的缓冲剂包括乙酸-乙酸钠缓冲剂、苹果酸-乙酸钠缓冲剂、马来酸-乙酸钠缓冲剂和琥珀酸-乙酸钠缓冲剂中的一种或多种。

本发明进一步设置为：所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，所述稳定剂为海藻糖、蔗糖和甘油中的一种或多种。

一种电化学β-羟丁酸测试条的制作方法，包括以下步骤：

S1、采用丝网印刷技术，在基板上印刷银浆制成的银导线，即导电层；

S2、采用丝网印刷技术，按照顺序将碳浆制成的HCT电极、对电极一，对电极二和工作电极印刷在银导线上边，且边缘与银导线完全贴合；

S3、采用疏水性材料的绝缘油墨印制绝缘层；

S4、将缓冲溶液、高分子化合物、生物酶、PMS/PES结合Ru(NH3)

6Cl3、稳定剂和表面活性剂按比例混合，完成试剂的制备；

S5、利用上述试剂组成配置出液态的反应试剂，充分搅拌使其溶解分散，形成均匀的溶液；

S6、通过溶液固定工序方式将上述液态的反应试剂配置到试剂窗口上，烘干除去液态的反应试剂中的溶剂，从而得到干燥的厚度均一的试剂层，最后依次附上双面胶层和亲水层，得到β-羟丁酸电化学测试条。

本发明进一步设置为：所述工作电极、对电极一、对电极二和HCT电极形成两个电极通路，其中一个电极通路用于测试红细胞压积，另一个电极通路用于测试β-羟丁酸浓度。

本发明的有益效果：

1、本发明中，采用双电子媒介体PMS/PES结合Ru(NH3)6Cl3，酶试剂层通过合理的组分配伍，将双媒介体物质掺入酶试剂中，并通过试剂层固定工序承载在丝网印刷电极上，增加HCT电极可以对样品HCT进行校准，HCT校准电极不需要对血样样品进行前处理，钌类化合物具有更好的氧化还原稳定性，不会被空气氧化，试纸条具有更长的储存时间，钌类化合物相比铁氰化钾具有更低的氧化还原反应电位，因此在测定血样的过程中，能有效降低来自其他氧化还原物质的干扰，且加入PMS/PES后，电子传递效率增强，反应电流升高，可以实现在较宽HCT范围内实现对β-羟丁酸较宽检测线的测量，同时测试条精度也得到改善；

2、本发明中，试剂层包括高分子化合物、生物酶、双电子媒介体、缓冲溶液、表面活性剂和稳定剂，试剂层通过溶液固定工序配置于碳浆工作电极、对电极一和对电极二上，保证试剂条性能一致性，表面活性剂为非离子型表面活性剂，稳定剂优选海藻糖，海藻糖自身具有较强的稳定性，对热和酸碱都具有非常好的稳定性，相比于其他稳定剂除了使试剂层的稳定性增强，测试条测试精度也好于其他稳定剂；

3、本发明中，通过引入双电子媒介体，增加电子媒介体和被测物β-羟丁酸之间的电子传导效率，使电流传导更加快捷，提高了测试条的灵敏度，拓宽了线性测试范围；双媒介体联用可以在血液中β-羟丁酸含量很低的情况下，可以准确且快速的检测β-羟丁酸，同时利用β-羟丁酸脱氢酶的特异性及双媒介体，可以在较低的测试电压下实现对目标物的检测，避免了其他还原性物质的干扰，提高了反应的特异性，生产工艺简单，反应试剂原料易得，成本低，可以大批量生产。

附图说明

图1为本发明一种电化学β-羟丁酸测试条的正视图；

图2为本发明一种电化学β-羟丁酸测试条的绝缘层的示意图；

图3为本发明一种电化学β-羟丁酸测试条的丝网印刷电极的示意图；

图4为本发明一种电化学β-羟丁酸测试条的针对不同β-羟丁酸浓度的测试图。

图中：1、基板；2、导电层；3、绝缘层；4、丝网印刷电极；5、试剂层；6、双面胶层；7、亲水层；41、HCT电极；42、对电极一；43、对电极二；44、工作电极。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

请参阅图1-图3，本设计提出一种实施方式，一种电化学β-羟丁酸测试条，包括基板1、导电层2、绝缘层3、丝网印刷电极4、试剂层5、双面胶层6和亲水层7，双面胶层6的下表面与试剂层5的上表面粘接，且双面胶层6的上表面与亲水层7的下表面粘接，丝网印刷电极4包括HCT电极41、对电极一42、对电极二43和工作电极44，试剂层5通过溶液固定工序配置于工作电极44、对电极一42和对电极二43上表面，工作电极44、对电极一42、对电极二43和HCT电极41形成两个电极通路，其中一个电极通路用于测试红细胞压积，另一个电极通路用于测试β-羟丁酸浓度。

本实施例中，采用双电子媒介体PMS/PES结合Ru(NH3)6Cl3，酶试剂层5通过合理的组分配伍，将双媒介体物质掺入酶试剂中，并通过试剂层5固定工序承载在丝网印刷电极4上，增加HCT电极41可以对样品HCT进行校准，HCT校准电极不需要对血样样品进行前处理，与铁氰化钾相比，钌类化合物具有更好的氧化还原稳定性，不会被空气氧化，因此试纸条具有更长的储存时间，另外，由于钌类化合物相比铁氰化钾具有更低的氧化还原反应电位，因此在测定血样的过程中，能有效降低来自其他氧化还原物质的干扰，加入PMS/PES后，电子传递效率增强，反应电流升高，可以实现在较宽HCT范围内实现对β-羟丁酸较宽检测线的测量，同时测试条精度也得到改善。

实施例二

请参阅图2和图4，试剂层5包括高分子化合物、生物酶、双电子媒介体、缓冲溶液、表面活性剂和稳定剂，基板1采用PET材质制成，高分子化合物为羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素中的一种或多种，生物酶包括β-羟丁酸脱氢酶和辅酶，且辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，双电子媒介体为PMS/PES结合Ru(NH3)6Cl3，且其中两种媒介体的质量配比为1:15，缓冲溶液包括胺系缓冲剂和具有羧基的缓冲剂，胺系缓冲剂包括胺系缓冲液Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES和Tricine中的一种或多种，具有羧基的缓冲剂包括乙酸-乙酸钠缓冲剂、苹果酸-乙酸钠缓冲剂、马来酸-乙酸钠缓冲剂和琥珀酸-乙酸钠缓冲剂中的一种或多种，表面活性剂为非离子型表面活性剂，稳定剂为海藻糖、蔗糖和甘油中的一种或多种。

本实施例中，试剂层5通过溶液固定工序配置于碳浆工作电极44、对电极一42和对电极二43上，保证试剂条性能一致性，海藻糖自身具有较强的稳定性，对热和酸碱都具有非常好的稳定性，相比于其他稳定剂除了使试剂层5的稳定性增强，测试条测试精度也好于其他稳定剂。

实施例三

请参阅图1-图4，一种电化学β-羟丁酸测试条的制作方法，包括以下步骤：

步骤一、采用丝网印刷技术，在基板1上印刷银浆制成的银导线，即导电层2；

步骤二、采用丝网印刷技术，按照顺序将碳浆制成的HCT电极41、对电极一42，对电极二43和工作电极44印刷在银导线上边，且边缘与银导线完全贴合；

步骤三、采用疏水性材料的绝缘油墨印制绝缘层3；

步骤四、将缓冲溶液、高分子化合物、生物酶、PMS/PES结合Ru(NH3)6Cl3、稳定剂和表面活性剂按比例混合，完成试剂的制备；

步骤五、利用上述试剂组成配置出液态的反应试剂，充分搅拌使其溶解分散，形成均匀的溶液；

步骤六、通过溶液固定工序方式将上述液态的反应试剂配置到试剂窗口上，烘干除去液态的反应试剂中的溶剂，从而得到干燥的厚度均一的试剂层5，最后依次附上双面胶层6和亲水层7，得到β-羟丁酸电化学测试条。

本发明中，一种基于丝网印刷电极利用双电子媒介体PMS/PES结合Ru(NH3)6Cl3联用β-羟丁酸脱氢酶的用于检测β-羟丁酸的电化学传感器(测试条)，包括基板1、导电层2、绝缘层3、丝网印刷电极4、试剂层5、双面胶层6和亲水层7，PET材质的绝缘基板1位于最底部，然后为导电层2和丝网印刷电极4，丝网印刷电极4包括HCT电极41、对电极一42、对电极二43和碳浆印刷的工作电极44，且工作电极44、对电极一42、对电极二43和HCT电极41形成两个电极通路，第一个电极通路用于测试红细胞压积，另一个电极通路用于测试β-羟丁酸浓度；通过在PET材质的基板1上以丝网印刷的方式依次用碳油墨印刷工作电极44、对电极一42和对电极二43，用银油墨印刷银导线(导电层2)，并采用疏水性材料的绝缘油墨印制绝缘层3，试剂层5承载于工作电极44、对电极一42和对电极二43上，然后在试剂层5上粘贴双面胶层6，最后附上亲水层7；

如图4所示，本发明采用双电子媒介体PMS/PES结合Ru(NH3)6Cl3，酶试剂层5通过合理的组分配伍，将双媒介体物质掺入酶试剂中，并通过试剂层5固定工序承载在丝网印刷电极4上，增加HCT电极41可以对样品HCT进行校准，HCT校准电极不需要对血样样品进行前处理，与铁氰化钾相比，钌类化合物具有更好的氧化还原稳定性，不会被空气氧化，因此试纸条具有更长的储存时间，另外，由于钌类化合物相比铁氰化钾具有更低的氧化还原反应电位，因此在测定血样的过程中，能有效降低来自其他氧化还原物质的干扰，但钌类化合物作为电子媒介体，其电子传递效率有限，与β-羟丁酸脱氢酶(β-HBDH)联用后，反应电流较小，较低浓度的β-羟丁酸甚至检测不到信号，而加入PMS/PES后，电子传递效率增强，反应电流升高，可以实现在较宽HCT范围内实现对β-羟丁酸较宽检测线的测量，同时测试条精度也得到改善；

本发明通过在工作电极44、对电极一42和对电极二43上设置一层试剂层5，试剂层5包括高分子化合物、生物酶、双电子媒介体、缓冲溶液、表面活性剂和稳定剂，试剂层5通过溶液固定工序配置于碳浆工作电极44、对电极一42和对电极二43上，保证试剂条性能一致性；其中的高分子化合物为羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、甲基纤维素或者乙基纤维素中的一种或多种，优选为羧甲基纤维素钠，生物酶包括β-羟丁酸脱氢酶和辅酶，且辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，双电子媒介体为PMS/PES结合Ru(NH3)6Cl3，且两种媒介体的质量配比为1:15，缓冲剂包括胺系缓冲剂和具有羧基的缓冲剂，胺系缓冲剂包括胺系缓冲液Tris、ACES、CHES、CAPSO、TAPS、CAPS、Bis-Tris、TAPSO、TES和Tricine中的一种或多种，其中更优选为TAPSO，具有羧基的缓冲剂包括乙酸-乙酸钠缓冲剂、苹果酸-乙酸钠缓冲剂、马来酸-乙酸钠缓冲剂和琥珀酸-乙酸钠缓冲剂中的一种或多种，优选为苹果酸-乙酸钠缓冲剂，上述缓冲剂中，可使用一种类型，也可联用两种，表面活性剂为非离子型表面活性剂，优选为TritonX-100，稳定剂为海藻糖、蔗糖和甘油中的一种或多种，优选为海藻糖，海藻糖自身具有较强的稳定性，对热和酸碱都具有非常好的稳定性，相比于其他稳定剂除了使试剂层5的稳定性增强，测试条测试精度也好于其他稳定剂；

使用本发明的电化学β-羟丁酸测试条时，将测试条的一端与微型电化学检测仪器连接，血液样品经电化学β-羟丁酸测试条的进样腔一端自动吸入，并等样本中β-羟丁酸与试剂层5中组分发生反应完全后，再通过微型电化学检测仪器进行检测，此时，微型电化学检测仪器记录的电流只有β-羟丁酸反应的电流值，再通过软件换算即可得到相应的β-羟丁酸浓度值；

本发明通过引入双电子媒介体，增加电子媒介体和被测物β-羟丁酸之间的电子传导效率，使电流传导更加快捷，提高了测试条的灵敏度，拓宽了线性测试范围；双媒介体联用可以在血液中β-羟丁酸含量很低的情况下，可以准确且快速的检测β-羟丁酸，同时利用β-羟丁酸脱氢酶的特异性及双媒介体，可以在较低的测试电压下实现对目标物的检测，避免了其他还原性物质的干扰，提高了反应的特异性，生产工艺简单，反应试剂原料易得，成本低，可以大批量生产。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。