BCMA嵌合抗原受体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月13日提交的美国序列号62/684,628和2019年4月12日提交的美国序列号62/832,991的优先权，它们每一者的内容通过援引以其全文并入本文。

序列表

本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过援引以其全文并入的序列表。创建于2019年6月11日的所述ASCII副本名为N2067-7155WO_SL.txt且大小为228,604字节。

技术领域

本发明总体上涉及经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)在治疗与B细胞成熟抗原蛋白(BCMA)表达相关的疾病中的用途。

背景技术

B细胞成熟抗原(BCMA)是B细胞谱系的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员表达的细胞。BCMA表达在终末分化的B细胞上最高。BCMA参与调节浆细胞的存活以维持长期体液免疫。BCMA的表达最近已与许多癌症、自体免疫性障碍和传染病有关。BCMA表达增加的癌症包括一些血液癌，如多发性骨髓瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤和非霍奇金(non-Hodgkin)淋巴瘤、各种白血病和胶质母细胞瘤。

发明内容

在一个方面，本发明的特征在于编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含抗BCMA结合结构域(例如人抗BCMA结合结构域，例如本文所述的人抗BCMA结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

在另一个方面，本发明提供分离的CAR，其中CAR包含抗BCMA结合结构域(例如人抗BCMA结合结构域，例如本文所述的人抗BCMA结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，人抗BCMA结合结构域)包含本文所述的抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，和/或本文所述的抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含本文所述的重链可变区(例如，在表2、表6或表10中)和/或本文所述的轻链可变区(例如，在表2、表6或表10中)。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含scFv，该scFv包含表2、表6或表10的氨基酸序列的轻链和重链。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含本文所述的scFv(例如，在表2、表6或表10中)。在一些实施例中，CAR包含本文披露的CAR序列(例如，在表2、表6或表10中)。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含表2-13中列出的任何抗BCMA重链结合结构域氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含表2-13中列出的任何抗BCMA轻链结合结构域氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)的LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3是表3-5中(例如，在表3-5的单行中)列出的HC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3是表3-5中(例如，在表3-5的单行中)列出的LC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45和84的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:44、45和46的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:44、45和68的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:44、45和76的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；(ii)SEQ ID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；或(iii)SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQID NO:52、70或78的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH，其中核酸分子包含编码VH的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:53、71或79的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQID NO:61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VL，其中核酸分子包含编码VL的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:62的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH和VL，其中VH和VL分别包含：(i)SEQID NO:52和61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，(ii)SEQ ID NO:70和61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或(iii)SEQ ID NO:78和61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含单链可变片段(scFv)，该单链可变片段包含SEQ ID NO:64、72或80的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含单链可变片段(scFv)，其中核酸分子包含编码scFv的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:65、73或81的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，CAR包含SEQ ID NO:66、74或82的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:67、75或83的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3是表7-9中(例如，在表7-9的单行中)列出的HC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3是表7-9中(例如，在表7-9的单行中)列出的LC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:86、130和88的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:86、87和88的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:86、109和88的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:86、109和88的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:95、131和132的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:95、96和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；(ii)SEQID NO:95、114和115的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:95、114和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:86、87、88、95、96和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；(ii)SEQ ID NO:86、109、88、95、114和115的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；或(iii)SEQ ID NO:86、109、88、95、114和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQID NO:93或112的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH，其中核酸分子包含编码VH的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:260、94或113的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQID NO:102、118或124的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VL，其中核酸分子包含编码VL的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:261、103、119或125的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH和VL，其中VH和VL分别包含：(i)SEQID NO:93和102的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，(ii)SEQ ID NO:112和118的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或(iii)SEQ ID NO:112和124的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含单链可变片段(scFv)，该单链可变片段包含SEQ ID NO:105、120或126的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含单链可变片段(scFv)，其中核酸分子包含编码scFv的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:253、106、121或127的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，CAR包含SEQ ID NO:107、122或128的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:259、108、123或129的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:258的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3是表11-13中(例如，在表11-13的单行中)列出的HC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3是表11-13中(例如，在表11-13的单行中)列出的LC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:179、180和181的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:137、138和139的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:160、161和162的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:147、182和183的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:147、148和149的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(ii)SEQID NO:147、170和171的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:137、138、139、147、148和149的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；或(ii)SEQID NO:160、161、162、147、170和171的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQID NO:145或168的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH，其中核酸分子包含编码VH的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:146或169的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQID NO:154或173的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VL，其中核酸分子包含编码VL的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:155或174的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH和VL，其中VH和VL分别包含：(i)SEQID NO:145和154的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或(ii)SEQ ID NO:168和173的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含单链可变片段(scFv)，该单链可变片段包含SEQ ID NO:156或175的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含单链可变片段(scFv)，其中核酸分子包含编码scFv的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:157或176的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，CAR包含SEQ ID NO:158或177的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:159或178的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH和VL，其中VH和VL通过接头(例如本文所述的接头)连接，任选地其中接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域。在一些实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码跨膜结构域的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域通过铰链区连接至跨膜结构域。在一些实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:2、3或4的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码铰链区的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:13、14或15的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，跨膜结构域和铰链区包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜结构域和铰链区由SEQ ID NO:254的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列编码。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域，例如本文所述的初级信号传导结构域，任选地其中初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码初级信号传导结构域的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:20或21的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码初级信号传导结构域的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:256的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，例如本文所述的共刺激信号传导结构域，任选地其中共刺激信号传导结构域包含源自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB或与CD83特异性结合的配体的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码共刺激信号传导结构域的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:18的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码共刺激信号传导结构域的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:255的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含源自4-1BB的功能性信号传导结构域和源自CD3ζ的功能性信号传导结构域，任选地其中细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列)和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列)，任选地其中细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列。

在一些实施例中，CAR还包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的前导序列。

在一些实施例中，CAR包含以下性质中的一种或多种(例如，1种、2种或全部)：(i)当在细胞(例如，T细胞)中表达时，所述CAR在存在表达BCMA的细胞的情况下活化所述细胞中的NFAT信号传导，例如如通过实例1中所述的JNL筛选报告基因测定法所测量，例如如使用实例1中关于图1A或图1C所述的方法所评估；(ii)当在细胞(例如，T细胞)中表达时，所述CAR诱导表达BCMA的细胞的细胞毒性，例如如使用实例1中关于图3A所述的方法所评估；以及(iii)当在细胞(例如，T细胞)中表达时，CAR在存在表达BCMA的细胞的情况下诱导细胞中细胞因子(例如，IFN-γ)的表达，例如如使用实例1中关于图3C所述的方法所评估。

在另一个方面，本发明提供一种包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗BCMA结合结构域，该重链可变区包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，该轻链可变区包含轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3包含本文披露的CDR氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3是表3-5中(例如，在表3-5的单行中)列出的HC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3是表3-5中(例如，在表3-5的单行中)列出的LC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45和84的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:44、45和46的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:44、45和68的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:44、45和76的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；(ii)SEQ ID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；或(iii)SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQID NO:52、70或78的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH，其中核酸分子包含编码VH的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:53、71或79的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQID NO:61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VL，其中核酸分子包含编码VL的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:62的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH和VL，其中VH和VL分别包含：(i)SEQID NO:52和61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，(ii)SEQ ID NO:70和61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或(iii)SEQ ID NO:78和61的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3是表7-9中(例如，在表7-9的单行中)列出的HC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3是表7-9中(例如，在表7-9的单行中)列出的LC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:86、130和88的氨基酸序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:86、87和88的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:86、109和88的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:86、109和88的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:95、131和132的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:95、96和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；(ii)SEQID NO:95、114和115的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(iii)SEQ ID NO:95、114和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:86、87、88、95、96和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；(ii)SEQ ID NO:86、109、88、95、114和115的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；或(iii)SEQ ID NO:86、109、88、95、114和97的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQID NO:93或112的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH，其中核酸分子包含编码VH的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:260、94或113的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQID NO:102、118或124的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VL，其中核酸分子包含编码VL的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:261、103、119或125的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH和VL，其中VH和VL分别包含：(i)SEQID NO:93和102的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，(ii)SEQ ID NO:112和118的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或(iii)SEQ ID NO:112和124的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3是表11-13中(例如，在表11-13的单行中)列出的HC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3是表11-13中(例如，在表11-13的单行中)列出的LC CDR序列(或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列)。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:179、180和181的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:137、138和139的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(ii)SEQ ID NO:160、161和162的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:147、182和183的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:147、148和149的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列；或(ii)SEQID NO:147、170和171的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含：(i)SEQ ID NO:137、138、139、147、148和149的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列；或(ii)SEQID NO:160、161、162、147、170和171的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过七个、六个或五个修饰(例如置换，例如保守置换)的序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含SEQID NO:145或168的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH，其中核酸分子包含编码VH的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:146或169的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含SEQID NO:154或173的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VL，其中核酸分子包含编码VL的核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO:155或174的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的核酸序列。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含VH和VL，其中VH和VL分别包含：(i)SEQID NO:145和154的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或(ii)SEQ ID NO:168和173的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％或99％的序列同一性的序列，或具有至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供由本文所述的核酸分子编码的分离的多肽分子。在一个方面，本发明提供包含本文所述的核酸分子、或编码本文所述CAR的核酸分子的载体。在一些实施例中，载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施例中，载体包含EF-1启动子，该EF-1启动子包含SEQ ID NO:11的核酸序列。在一个方面，本发明提供包含本文所述的核酸分子、本文所述的CAR、本文所述的多肽分子或本文所述的载体的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一些实施例中，细胞还表达抑制剂，该抑制剂包含第一多肽，该第一多肽包含抑制分子的至少一部分，与包含来自细胞内信号传导结构域的正信号的第二多肽缔合，任选地其中抑制剂包含含有PD-1的至少一部分的第一多肽以及含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。

在一个方面，本发明提供一种制备细胞的方法，该方法包括用本文所述的载体转导细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一个方面，本发明提供一种制备RNA工程化细胞的方法，该方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其中RNA包含本文所述的核酸分子，或编码本文所述的CAR的核酸分子。

在一个方面，本发明提供一种在受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，该方法包括将有效量的本文所述的细胞施用于受试者。在一个方面，本发明提供一种治疗患有与BCMA表达相关的疾病的受试者的方法，该方法包括将有效量的本文所述的细胞施用于受试者。在一些实施例中，细胞是自体T细胞或同种异体T细胞。在一些实施例中，与BCMA表达相关的疾病是：(i)癌症或恶性肿瘤，或选自以下一者或多者的癌前病症：骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期，或(ii)与BCMA表达相关的非癌症相关适应症。在一些实施例中，疾病是血液癌或实体癌。在一些实施例中，疾病选自：急性白血病、B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞幼淋巴细胞性白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)巨球蛋白血症、前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、胰腺癌、肺癌、浆细胞增殖性障碍(例如，无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增生、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性或POEMS综合征(也称为克罗-富克斯(Crow-Fukase)综合征、高月病(Takatsuki disease)和PEP综合征))、或所述疾病的组合。在一些实施例中，疾病是多发性骨髓瘤。在一些实施例中，该方法还包括将第二治疗剂施用于受试者。在一些实施例中，第二治疗剂是PD-1抑制剂，任选地其中PD-1抑制剂选自由PDR001、纳武单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591和AMP-224组成的组。在一些实施例中，第二治疗剂是PD-L1抑制剂，任选地其中PD-L1抑制剂选自由FAZ053、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)和BMS-936559组成的组。在一些实施例中，第二治疗剂是LAG-3抑制剂，任选地其中LAG-3抑制剂选自由LAG525、BMS-986016、TSR-033、MK-4280和REGN3767组成的组。在一些实施例中，第二治疗剂是TIM-3抑制剂，任选地其中TIM-3抑制剂选自由MBG453、TSR-022和LY3321367组成的组。在一些实施例中，第二治疗剂是CTLA-4抑制剂，任选地其中CTLA-4抑制剂是易普利姆玛或曲美利木单抗。在一些实施例中，第二治疗剂是白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽的组合(例如，hetIL-15)。在一些实施例中，第二治疗剂是白介素-12(IL-12)多肽。在一些实施例中，第二治疗剂是mTOR抑制剂，任选地其中mTOR抑制剂是RAD001或雷帕霉素。

本文披露的抗BCMA结合结构域以及包含此类抗BCMA结合结构域的CAR相比之前的抗BCMA结合结构域和包含此类抗BCMA结合结构域的CAR具有改进的性质，例如增加的与BCMA的结合亲和力、增加的细胞(如T细胞或NK细胞)CAR表达水平、和/或增强的介导细胞毒性和/或细胞(如T细胞或NK细胞)产生细胞因子的能力。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是以下描述合适的方法和材料。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过援引以其全文并入。此外，材料、方法和实例仅是说明性的而不旨在限制。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本发明的其他特征、目标和优点将是清楚的。

附图说明

图1A至图1H.使用自动化系统的Jurkat NFAT荧光素酶(JNL)报告基因测定法用于测试BCMA CAR的功能。在JNL报告基因测定法中评估CAR克隆的抗原依赖性活性。将含有指定的CAR克隆的JNL细胞或未转导的JNL细胞(UTD)与单独的培养基(图1G和1H)或与靶细胞系(KMS11(作为BCMA阳性细胞系)(图1A和1C)和NALM6(作为BCMA阴性细胞系)(图1E和1F))一起以不同比例共培养，测量荧光素酶活性，将其作为发光强度。当在存在表达抗原的细胞的情况下发光强度超过UTD细胞水平的2倍时，克隆被认为具有活性。发光读出是对CAR刺激的直接测量。图1B和图1D是显示通过使用人重组(r)BCMA_Fc-AF647的流式细胞术来检测JNL细胞上BCMA CAR的表达水平的图。1×或2×平台表示接种40,000个H293细胞或80,000个H293细胞用于病毒产生。

图2.原代人T细胞上BCMA CAR的表达水平。用人rBCMA_Fc-AF647试剂对细胞进行染色，并通过流式细胞术来测定。CAR+细胞和MFI的百分比如细胞培养的第5天和第9天的图所示。数据汇总于表17中，这些数据包括针对各个CAR获得的病毒滴度。

图3A至图3C.针对表达萤火虫荧光素酶(KMS11-luc)的KMS11靶细胞系来评估表达指定的CAR的T细胞介导细胞溶解和细胞因子产生的能力。图3A：将CART细胞与KMS11-luc靶细胞一起以指定的E:T比率共培养。通过不含效应T细胞的靶细胞(对照)和含有效应T细胞的靶细胞(实验)之间的荧光素酶信号的差异来确定％细胞杀伤，以对照的百分比表示。UTD表示未转导的T细胞。图3B：针对BCMA阴性系NALM6观察背景杀伤。图3C：在24小时在从这些共培养体系(E:T比率为2.5)收集的上清液中，通过MSD测量IFNγ。所有数据均以平均值+/-标准偏差表示。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。

本发明的组合物和方法涵盖具有指定序列，或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列具有至少85％、90％或95％同一性或更高同一性的序列的多肽和核酸。在氨基酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一氨基酸序列含有足够或最小数量的氨基酸残基，这些氨基酸残基i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或ii)是第二氨基酸序列中比对的氨基酸残基的保守置换，以使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可以具有共同结构域和/或共同功能活性，例如含有与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的共同结构域的氨基酸序列。

在核苷酸序列的语境中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一核酸序列含有足够或最小数量的核苷酸，这些核苷酸与第二核酸序列中的比对核苷酸相同，以使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同结构多肽域或共同功能多肽活性，例如与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列。

术语“变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，变体是功能性变体。

术语“功能性变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，或由基本上相同的核苷酸序列编码，并且能够具有参考氨基酸序列的一种或多种活性的多肽。

如本文所用，术语“BCMA”是指B细胞成熟抗原。BCMA(也称为TNFRSF17，BCM或CD269)是肿瘤坏死受体(TNFR)家族的成员，并且主要在终末分化的B细胞(例如记忆B细胞)和浆细胞上表达。其配体称为TNF家族(BAFF)的B细胞激活物和增殖诱导配体(APRIL)。BCMA参与调节浆细胞的存活以维持长期体液免疫。BCMA的基因在16号染色体上编码，产生长度为994个核苷酸的初级mRNA转录物(NCBI登录号NM_001192.2)，其编码184个氨基酸的蛋白质(NP_001183.2)。已经描述了衍生自BCMA基因座的第二反义转录物，其可以在调节BCMA表达中起作用。(Laabi Y.等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],1994,22:1147-1154)。已经描述了具有未知显著性的另外的转录物变体(Smirnova AS等人Mol Immunol.[分子免疫学],2008,45(4):1179-1183)。已经鉴定出第二同种型，也称为TV4(Uniprot标识Q02223-2)。如本文所用，“BCMA”包括含有突变例如点突变的蛋白质，全长野生型BCMA的片段、插入、缺失和剪接变体。

术语“嵌合抗原受体”或者“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在如本文所述的RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。

在一个方面，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一个方面，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自共刺激分子的功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)|跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)|跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含衍生自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。在一个方面，CAR还包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。

包含靶向特定肿瘤标记X的抗原结合结构域(例如，scFv(单结构域抗体)或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标记)也称为XCAR。例如，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR被称为BCMA CAR。CAR可以在任何细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。

术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。

如本文所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，该蛋白质或多肽序列与抗原特异性结合。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。

术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的抗原结合结构域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH))、骆驼科VHH结构域和由如二价片段的抗体片段形成的多特异性分子，该二价片段包含在铰链区通过二硫桥连接的两个或更多个(例如两个)Fab片段，或所连接的抗体的两个或更多个(例如两个)分离的CDR或其他表位结合片段。抗体片段也可以掺入单结构域抗体、多抗体、微抗体、纳米抗体、细胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。还可以将抗体片段移植到基于多肽如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。

术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中该scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，该scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。

如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种来确定，包括以下中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学兴趣的蛋白质序列],”第5版.Public Health Service[公共卫生服务],NationalInstitutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda,MD(“卡巴特(Kabat)”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“乔西亚(Chothia)”编号方案)，或其组合。在组合的卡巴特和乔西亚编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为卡巴特CDR、乔西亚CDR或两者的一部分的氨基酸残基。

包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR组合物的部分可以以多种形式存在，例如其中抗原结合结构域表达为多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)，或例如人或人源化抗体)的一部分(Harlow等人,1999,于：Using Antibodies:ALaboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],NY[纽约]；Harlow等人,1989,于：Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],New York[纽约]；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。

如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”(在本文中也称为“抗靶标结合结构域”)是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。

术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。

术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。

术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。免疫应答可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫响应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所希望的免疫应答的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。

术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段(包括但不限于例如减小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数量、减少肿瘤转移数量、增加预期寿命、减少肿瘤细胞增殖、减少肿瘤细胞存活、或改善与癌性病症相关的各种生理症状)表现的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。

术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低、或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗癌作用”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防癌症发生的能力来显现。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种手段显现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、或肿瘤细胞存活率降低。术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。

术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。

术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。

如本文所用，术语“单采血(apheresis)”是指本领域公认的体外过程，通过该过程，供体或患者的血液从该供体或患者移出并穿过分离出一种或多种所选择的特定成分的装置，并返回其余部分至该供体或患者的循环(例如，通过再输送)。因此，在“单采样品”的上下文中是指使用单采获得的样品。

术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。通过本文所述的方法治疗的优选的癌症包括多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。

“源自”(当该术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。

短语“与BCMA表达相关的疾病”包括但不限于与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的疾病或与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的病症，包括例如增殖性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的非癌症相关适应症。为了避免疑义，与BCMA表达相关的疾病可以包括与目前不表达BCMA(例如，因为如由于用靶向BCMA的分子(例如，本文所述的BCMA抑制剂)进行治疗而导致BCMA表达下调)但曾经表达BCMA的细胞相关的病症。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是血液癌。在一个方面，血液癌是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是分化的血浆B细胞的恶性肿瘤。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如一种或多种急性白血病，其包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的其他癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)等等。在一些实施例中，癌症是多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或胶质母细胞瘤。在实施例中，与BCMA表达相关的疾病包括浆细胞增殖性障碍，例如无症状骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如恶性浆细胞病、单发性骨髓瘤、单发性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病、和PEP综合征)。与BCMA表达相关的其他疾病(例如野生型或突变型BCMA)表达包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、与BCMA的表达相关的癌前病症或增殖性疾病(例如野生型或突变型BCMA)，例如本文所述的癌症，例如前列腺癌(例如去势抗性或治疗抗性前列腺癌或转移前列腺癌)、胰腺癌、或肺癌。

与BCMA相关的非癌症相关病症(例如野生型或突变型BCMA)包括病毒感染，例如，HIV、真菌感染，例如新生隐球菌；自身免疫疾病；例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)、寻常型天疱疮和干燥综合征(Sjogren's syndrome)；炎症性肠病、溃疡性结肠炎；与粘膜免疫有关的移植相关的同种异体特异性免疫障碍；以及针对生物制剂(如因子VIII)而言不需要的免疫应答(其中体液免疫很重要)。在实施例中，与BCMA表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。

术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的置换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定法测试改变的CAR。

术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导初级应答，从而介导信号转导事件，如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的重构等。

术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其针对T细胞信号传导途径的至少一些方面提供以刺激方式调节TCR复合物的初级活化的一个或多个初级胞质信号传导序列。在一些实施例中，CAR内的含ITAM的结构域独立于内源性TCR复合物重现初级TCR的信号传导。在一个方面，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子的结合而引发，并且其导致T细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI和CD66d、DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，该免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。

如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。在实施例中，细胞内信号结构域转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替完整链，只要截短部分可转导效应子功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。

细胞内信号传导结构域产生信号，该信号促进含有CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。

在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含源自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。

初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。

术语“ζ”或者“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或者“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:9或10提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性地结合，从而介导T细胞的共刺激应答，如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫响应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD28-OX40、CD28-4-1BB和与CD83特异性结合的配体。

共刺激细胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。

细胞内信号传导结构域可以包含其来源的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。

术语“4-1BB”是指CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人4-1BB氨基酸序列。“4-1BB共刺激结构域”是指4-1BB的共刺激结构域或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，“4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO:7提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。

当该术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(例如促进免疫效应子应答)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓衍生的吞噬细胞。

当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指例如免疫效应细胞的增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。

术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。

术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。

除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。

术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文描述的化合物、配制品、材料或组合物的有效于实现特定的生物学结果的量。

术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。

术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。

术语“表达”是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。在一些实施例中，表达包括被引入细胞的mRNA的翻译。

术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。

术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如下提供的自灭活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(OxfordBioMedica)的

术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间(例如，两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间、或两个多肽分子之间)的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有如下项：至少一个(典型地两个)可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且FR区的所有或显著一部分是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学现状],2:593-596,1992。

“完全人”是指如下免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人起源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。

术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像，宿主细胞)中。

在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。

术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。

术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。在一些实施例中，“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”包括核苷酸/核苷衍生物或类似物。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子置换，例如保守置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子置换(例如，保守置换)可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体；并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在有很多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、或其组合。

术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。

术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。

术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。

术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指在癌细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施例中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施例中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，源自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,GeneTher[基因疗法]20018(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]20135(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]201219(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。

术语“支持肿瘤的抗原”或“支持癌症的抗原”可互换地指在细胞表面上表达的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)，该细胞本身不是癌性的、但例如通过促进其生长或存活、例如对免疫细胞的抗性而支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓源性的抑制细胞(MDSC)。支持肿瘤的抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要该抗原存在于支持癌细胞的细胞上。

如在scFv的语境中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的，以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一些实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，以及n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，以及n＝10(SEQ ID NO:42)。在一些实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一个实施例中，所述接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)的多个重复。描述于WO 2012/138475中的接头也包括在本发明的范围内，该专利通过援引并入本文。

如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。

如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。

如本文所用，“多聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA附接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施例中，聚A为50个与5000个之间(SEQ ID NO:30)，优选大于64个，更优选大于100个，最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调制mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。

如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'多聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将多聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。多聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在胞质中发生。在转录已经终止后，通过与RNA聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。

如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于在整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的情况下基因的表达的时间段。

如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性障碍的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性障碍的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，如本发明的CAR)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性障碍的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增殖性障碍的进展。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。

术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。

术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人)。

术语“基本上纯化的”细胞是指本质上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体是指同质的细胞群体。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。

如本文所用的术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。

如本文所用的术语“预防”意指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。

在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性障碍抗原”或“与过度增殖性障碍相关的抗原”是指特异性过度增殖性障碍常见的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性障碍抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、卵巢癌、胰腺癌等等)或者浆细胞增殖性障碍，例如无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主体细胞及其子代。

术语“特异性结合”是指抗体或配体，其识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质，但是其中抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。

如本文所用，“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽(在最简单的实施例中典型地为两个)，当在免疫效应细胞中时这些多肽为细胞提供针对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在一些实施例中，RCAR包含至少细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包含源自刺激分子和/或本文在CAR分子的语境中定义的共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR中的多肽组并不是相互连续的，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，RCAR包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR在如本文所述的细胞(例如免疫效应细胞)，例如表达RCAR的细胞(本文还称为“RCARX细胞”)中表达。在一个实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在一个实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。RCAR可以为表达RCAR的细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有可调节的细胞内信号产生或增殖，这可以优化表达RCAR的细胞的免疫效应特性。在实施例中，RCAR细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域，以提供对包含由该抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞的特异性。

当该术语在本文中使用时，“膜锚”或“膜系链结构域”是指足以将细胞外或细胞内结构域锚定到质膜的多肽或部分(例如肉豆蔻酰基)。

当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“开关结构域”是指实体(典型地是基于多肽的实体)，该实体在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合。该缔合导致连接到(例如融合到)第一开关结构域的第一实体和连接到(例如融合到)第二开关结构域的第二实体的功能偶联。第一开关结构域和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此相同，例如它们是具有相同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为同源二聚化开关。在实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同，例如它们是具有不同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为异源二聚化开关。在实施例中，该开关是细胞内的。在实施例中，该开关是细胞外的。在实施例中，开关结构域是基于多肽(例如基于FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子(例如雷帕霉素类似物(rapalogue))。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如结合myc肽的scFv)，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如结合一个或多个myc scFv的myc配体或myc配体的多聚体。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如myc受体)，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。

当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施例中，二聚化分子不在受试者中天然发生，或者不以导致显著二聚化的浓度发生。在实施例中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素(Rapamycin)或雷帕霉素类似物，例如RAD001。

当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素，或催化性mTOR抑制剂)联合使用时，术语“低免疫增强剂量”是指mTOR抑制剂部分但不是完全抑制mTOR活性的剂量，例如，如通过P70 S6激酶活性的抑制测量的。本文讨论了用于评价mTOR活性的方法，例如通过抑制P70 S6激酶。剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫应答。在一个实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致PD-1阳性T细胞数目的减少和/或PD-1阴性T细胞数目的增加，或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率的增加。在一个实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致初始T细胞的数目增加。在一个实施例中，低免疫增强剂量的mTOR抑制剂导致以下中的一个或多个：

以下标记物中的一个或多个例如在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达增加：CD62L

KLRG1在例如记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的表达减少；以及

记忆T细胞前体，例如具有以下特征中的任一个或组合的细胞的数目增加：增加的CD62L

其中，例如，与未治疗的受试者相比，例如至少瞬时地发生上述任何变化。

如本文所用的“难治性”是指对治疗无应答的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。

如本文所用的“复发的”或“复发”是指疾病(例如癌症)或疾病的体征和症状(如改善或响应期之后，例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的回返或再现。应答初始期可能涉及癌细胞水平降低至低于某一阈值，例如低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。再现可能涉及癌细胞水平升高超过某一阈值，例如高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。例如，如在B-ALL的上下文中，再现可能涉及例如在完全应答之后血液、骨髓(>5％)或任何髓外位点中的母细胞再现。在本上下文中，完全应答可能涉及<5％BM母细胞。更通常地，在一个实施例中，应答(例如，完全应答或部分应答)可能涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施例中，初始应答期持续至少1、2、3、4、5、或6天；至少1、2、3、或4周；至少1、2、3、4、6、8、10、或12个月；或至少1、2、3、4、或5年。

范围：贯穿本披露内容，能以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％、或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％、和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。

当该术语在本文中使用时，“基因编辑系统”是指指导和影响由所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一种或多种分子。基因编辑系统是本领域中已知的，并且在下文更全面地描述。

如本文所用，“组合”施用意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有病症后并且在该病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就施用而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，由于是组合施用，该治疗更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下施用第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗将症状减少更大的程度，或者观察到对第一治疗而言类似的情况。在一些实施例中，与不存在另一种治疗的条件下递送一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与该病症相关的其他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加、或大于累加。该递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。

本文的组合物和方法的各个方面在下文进一步详细描述。另外的定义在整个申请书中陈述。

描述

本文提供了用于使用表达BCMA嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，CART-BCMA)来治疗疾病(如癌症)的物质组合物和使用方法。

在一个方面，本发明提供经工程化以表达CAR的细胞(例如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)，其中CAR T细胞(“CART”)或CAR NK细胞表现出抗肿瘤特性。在一个方面，用CAR转化细胞，并在细胞表面上表达CAR。在一些实施例中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)。在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施例中，细胞可以稳定地表达CAR。在另一个实施例中，用编码CAR的核酸(例如，mRNA、cDNA、DNA)转染细胞(例如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)。在一些此类实施例中，细胞可以瞬时表达CAR。

在一个方面，本发明的CAR将特异性抗体的抗原结合结构域与细胞内信号传导分子组合。例如，在一些方面，细胞内信号传导分子包括但不限于CD3-ζ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。在一个方面，抗原结合结构域结合至BCMA。

此外，本发明提供BCMA CAR组合物及其在治疗(在其他疾病中)癌症或任何恶性肿瘤或涉及表达BCMA的细胞或组织的自身免疫疾病等的药物或方法中的用途。

在一个方面，本发明的CAR可用于根除表达BCMA的正常细胞，从而适用于细胞移植之前的细胞调理疗法。在一个方面，表达BCMA的正常细胞是表达BCMA的正常干细胞，并且细胞移植是干细胞移植。

在一个方面，本发明提供经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞或NK细胞)，其中CAR T细胞(“CART”)或CAR NK细胞表现出抗肿瘤特性。优选的抗原是BCMA。在一个方面，CAR的抗原结合结构域包含人抗BCMA抗体片段。在一个方面，CAR的抗原结合结构域包含含有scFv的人抗BCMA抗体片段。因此，本发明提供BCMA-CAR，该BCMA-CAR包含人抗BCMA结合结构域并且被工程化至细胞(例如，T细胞或NK细胞)中，以及它们用于过继治疗的方法。

在一个方面，BCMA-CAR包含选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任何组合的至少一个细胞内结构域。在一个方面，BCMA-CAR包含来自除CD137(4-1BB)或CD28之外的一种或多种共刺激分子的至少一个细胞内信号传导结构域。

嵌合抗原受体(CAR)

本发明提供CAR(例如，CAR多肽)，该CAR包含抗BCMA结合结构域(例如，如本文所述的人抗BCMA结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗BCMA结合结构域包含表2-13中列出的任何抗BCMA重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。CAR的抗BCMA结合结构域还可以包含表2-13中列出的任何抗BCMA轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。

本发明还提供了编码如本文所述的CAR(例如编码包含抗BCMA结合结构域(例如，如本文所述的人抗BCMA结合结构域)的CAR)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的核酸分子，其中所述抗BCMA结合结构域包含表2-13中列出的任何抗BCMA重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，CAR的编码的抗BCMA结合结构域还可以包含表2-13中列出的任何抗BCMA轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。

在一个方面，示例性BCMA CAR构建体包含任选的前导序列、细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和细胞内刺激结构域。示例性前导序列提供为SEQ ID NO:1。编码前导序列的示例性核酸序列如SEQ ID NO:12所提供。示例性铰链/间隔区序列如SEQ ID NO:2、3、4或5所提供。示例性跨膜结构域序列如SEQ ID NO:6所提供。4-1BB蛋白的细胞内信号传导结构域的示例性序列如SEQ ID NO:7所提供。CD27的细胞内信号传导结构域的示例性序列如SEQ ID NO:8所提供。示例性CD3ζ结构域序列如SEQ ID NO:9或10所提供。在某些实施例中，这些结构域邻接并在同一阅读框中以形成单个融合蛋白。在其他实施例中，结构域在分开的多肽中，例如，在如本文描述的RCAR分子中。

CAR构建体可包括具有以下序列中的一个或多个的Gly/Ser接头：GGGGS(SEQ IDNO:25)；涵盖1个-6个“Gly Gly Gly Gly Ser”重复单元，例如GGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:26)；GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:27)；GGGGSGGGGS GGGGS(SEQ ID NO:28)；GGGS(SEQ ID NO:29)；或涵盖1个-10个“Gly Gly Gly Ser”重复单元，例如GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS(SEQ ID NO:42)。

在多个实施例中，CAR构建体包含多聚A序列，例如包含50个-5000个或100个-5000个腺嘌呤的序列(分别为SEQ ID NO 30和33)(例如，SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:35)，或包含50个-5000个胸腺嘧啶的序列(SEQ ID NO:32)(例如，SEQID NO:31、SEQ ID NO:32)。替代性地，CAR构建体可以包含例如包含序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:43)的接头。

在某些实施例中，全长BCMA CAR分子包含表2-13中提供的R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、Hy03或Hy52的氨基酸序列，或者由R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、Hy03或Hy52的核苷酸序列编码，或者与其基本上(例如，95％-99％)相同的序列。在某些实施例中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包含表2、表6和表10中提供的R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、Hy03或Hy52的scFv氨基酸序列，或者与其基本上(例如，95％-99％)相同的序列。在某些实施例中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包含表2、表6和表10中提供的R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、Hy03或Hy52的重链可变区和/或轻链可变区，或者与其基本上(例如，95％-99％)相同的序列。在某些实施例中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包含表2-13中提供的R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、Hy03或Hy52的重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)，和/或表2-13中提供的R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-02、B61-10、Hy03或Hy52的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如，LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)，或者与其基本上(例如，95％-99％)相同的序列。

可以作为本文所述的CAR分子的一部分的各种组分的非限制性实例的序列在表1中列出，其中aa代表氨基酸，na代表编码相应肽的核酸。

表1.CAR的各种组分的序列

CAR抗原结合结构域

在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR的一部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。在一个方面，本发明的CAR包含特异性结合BCMA(例如，人BCMA)的结合结构域。

抗原结合结构域可以是结合抗原的任何蛋白质，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体以及它们的功能片段，包括但不限于单链抗体，如骆驼科动物来源纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)，以及结合本领域已知的用作抗原结合结构域(如重组纤连蛋白结构域等等)的替代支架的任何蛋白质。

表2-13中提供了示例性抗BCMA结合结构域氨基酸序列。在一个方面，抗原结合结构域包含人抗体或人抗体片段。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表2-13中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，和/或本文(例如，表2-13中)所述的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表2、表6和表10中)所述的人VL和/或本文(例如，表2、表6和表10中)所述的人VH。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是scFv，该scFv包含表2、表6和表10的氨基酸序列的VL和VH。在一个实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)包含：VL，该VL包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或与表2、6和10的氨基酸序列具有95％-99％的同一性的序列；和/或VH，该VH包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如置换，例如保守置换)但不超过30个、20个或10个修饰(例如置换，例如保守置换)的氨基酸序列，或与表2、6和10的氨基酸序列具有95％-99％的同一性的序列。

表2.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表3.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

表4.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR

表5.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的IMGT CDR

表6.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表7.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

表8.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR

表9.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的IMGT CDR

表18.基于PI61的示例性抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表10.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列

表11.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR

表12.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR

表13.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的IMGT CDR

在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。

在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：

(1)选自以下中的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO:54的LC CDR1、SEQ ID NO:55的LC CDR2和SEQ ID NO:56的LCCDR3；和/或

(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:84的HCCDR3；

(ii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:46的HCCDR3；

(iii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:68的HCCDR3；或

(iv)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:76的HCCDR3。

在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：

(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:131的LC CDR2和SEQ ID NO:132的LCCDR3；

(ii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:96的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LCCDR3；

(iii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:115的LCCDR3；或

(iv)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LCCDR3；和/或

(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:130的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3；

(ii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:87的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3；或

(iii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:109的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3。

在某些实施例中，本文所述的CAR分子或本文所述的抗BCMA结合结构域包括：

(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：

(i)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:182的LC CDR2和SEQ ID NO:183的LCCDR3；

(ii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:148的LC CDR2和SEQ ID NO:149的LCCDR3；或

(iii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:170的LC CDR2和SEQ ID NO:171的LCCDR3；和/或

(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：

(i)SEQ ID NO:179的HC CDR1、SEQ ID NO:180的HC CDR2和SEQ ID NO:181的HCCDR3；

(ii)SEQ ID NO:137的HC CDR1、SEQ ID NO:138的HC CDR2和SEQ ID NO:139的HCCDR3；或

(iii)SEQ ID NO:160的HC CDR1、SEQ ID NO:161的HC CDR2和SEQ ID NO:162的HCCDR3。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、84、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、84、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、46、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:47、48、68、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、76、57、58和59的氨基酸序列。

在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、85、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、51、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:49、50、69、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、77、60、58和56的氨基酸序列。

在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含scFv，该scFv包含VH(例如，本文所述的VH)和VL(例如，本文所述的VL)。在一些实施例中，VH通过接头(例如，本文所述的接头，例如表1中所述的接头)附接至VL。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含(Gly

在一个方面，抗BCMA结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个方面，抗BCMA结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合BCMA蛋白。

在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448、美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794、和PCT公开号WO 2006/020258以及WO 2007/024715，这些专利通过援引并入本文。

scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含甘氨酸和丝氨酸重复序列组，如(Gly

跨膜结构域

关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以设计为包含附接至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜来源的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如该细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如该细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与所用的CAR的其他结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞(例如，CART细胞)表面上的另一种CAR同源二聚化。在另一个方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或置换，以使与相同的表达CAR的细胞(例如，CART)中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。

跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下一个或多个跨膜区：例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施例中，跨膜结构域可以至少包括共刺激分子的一个或多个跨膜区，该共刺激分子为例如MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。

在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一些实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链)或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(例如由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的跨膜结构域(例如由其组成)。

在一个方面，铰链或间隔区包含IgG4铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:3的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由SEQ ID NO:14的核苷酸序列编码的铰链。

在一个方面，铰链或间隔区包含IgD铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码的铰链。

在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一个方面，接头包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:16的核苷酸序列编码。

在一个方面，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。

胞质结构域

本发明的CAR的胞质结构域或区包括细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责活化已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。

用于在本发明的CAR中使用的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)以及这些序列的任何衍生物或变体和任何具有相同功能性能力的重组序列。

已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可认为T细胞激活是由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质结构域，例如共刺激结构域)。

初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。

在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在一些实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的初级信号传导结构域。

在一些实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增加或减少的)活性的突变ITAM结构域。在一些实施例中，初级信号传导结构域包括含有修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。

在本发明中特别有用的含有初级细胞内信号传导结构域的分子的另外实例包括DAP10、DAP12、和CD32的那些。

CAR的细胞内信号传导结构域可以单独包含初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ信号传导结构域)，或者它可以与在本发明的CAR的上下文中有用的任何其他所希望的一种或多种细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域(例如，CD3ζ链部分)和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，是淋巴细胞对抗原的有效应答所必需的。此类分子的实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体等等。例如，已证明CD27共刺激可增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。本发明的CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)，可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一些实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。

在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文描述的接头分子)分开。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。

在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:7的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:9(突变型CD3ζ)或SEQ ID NO:10(野生型人CD3ζ)的信号传导结构域。

在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:19的核酸序列编码。

在一个方面，细胞内被设计为包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，CD28的信号传导结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一个方面，CD28的信号传导结构域由SEQ ID NO:37的核酸序列编码。

在一个方面，细胞内被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。在一个方面，ICOS的信号传导结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一个方面，ICOS的信号传导结构域由SEQ ID NO:39的核酸序列编码。

CAR构型

多特异性CAR

在一个实施例中，本发明的CAR是多特异性CAR。在一些实施例中，多特异性CAR是双特异性CAR。在一些实施例中，双特异性CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施例中，第一表位和第二表位在相同的抗原，例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施例中，第一表位和第二表位重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原(例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。

在某些实施例中，本发明的CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异源二聚体抗体分子的方案在本领域中是已知的；这些方案包括但不限于：“球状突起于孔中(knob in a hole)”途径，例如在US 5731168中所述；静电导向Fc配对，如例如在WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中所述；链交换工程化结构域(SEED)异源二聚体形成，如例如在WO 07/110205中所述；Fab臂交换，如例如在WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双官能试剂，通过抗体交联以产生双特异性结构，如例如在US 4433059中所述；通过对两条重链之间的二硫键进行还原和氧化的循环，通过重组来自不同抗体的半抗体(重-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇，如例如在US 4444878中所述；三功能抗体，例如通过巯基反应性基团交联的三个Fab'片段，如例如在US 5273743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C-末端尾优选通过二硫键或胺反应性化学交联作用交联的scFv对，如例如在US 5534254中所述；双功能抗体，例如具有不同结合特异性的Fab片段，这些Fab片段通过已经替代恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)二聚化，如例如在US 5582996中所述；双特异性和寡特异性单价和寡价受体，例如两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区，这些VH-CH1区通过在一个抗体的CH1区与另一个抗体的VH区(典型地具有相关联的轻链)之间的多肽间隔子连接，如例如在US 5591828中所述；双特异性DNA-抗体缀合物，例如抗体或Fab片段通过DNA的双链段交联，如例如在US 5635602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US 5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有Ig重链可变区结合区的第一结构域和Ig轻链可变区结合区的第二结构域的多肽二聚体，通常称为双体抗体(也涵盖更高级结构，产生双特异性、三特异性或四特异性分子)，如例如在US 5837242中所述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US 5837821所述；用短肽接头(例如5或10个氨基酸)连接的或在任一取向上完全没有接头连接的VH和VL结构域，这些VH和VL结构域可以形成二聚体以形成双特异性双体抗体；三聚体和四聚体，如例如在US 5844094中所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过肽键与C-末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；具有经肽接头连接的VH和VL结构域二者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双体抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5869620中所述。另外的示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法见于例如US 5910573、US 5932448、US 5959083、US 5989830、US 6005079、US 6239259、US 6294353、US 6333396、US 6476198、US 6511663、US 6670453、US 6743896、US 6809185、US 6833441、US 7129330、US 7183076、US 7521056、US 7527787、US 7534866、US 7612181、US 2002004587 A1、US 2002076406 A1、US2002103345 A1、US 2003207346 A1、US 2003211078 A1、US 2004219643 A1、US2004220388 A1、US 2004242847 A1、US 2005003403 A1、US 2005004352 A1、US2005069552 A1、US 2005079170 A1、US 2005100543 A1、US 2005136049 A1、US2005136051 A1、US 2005163782 A1、US 2005266425 A1、US 2006083747 A1、US2006120960 A1、US 2006204493 A1、US 2006263367 A1、US 2007004909 A1、US2007087381 A1、US 2007128150 A1、US 2007141049 A1、US 2007154901 A1、US2007274985 A1、US 2008050370 A1、US 2008069820 A1、US 2008152645 A1、US2008171855 A1、US 2008241884 A1、US 2008254512 A1、US 2008260738 A1、US2009130106 A1、US 2009148905 A1、US 2009155275 A1、US 2009162359 A1、US2009162360 A1、US 2009175851 A1、US 2009175867 A1、US 2009232811 A1、US2009234105 A1、US 2009263392 A1、US 2009274649 A1、EP 346087 A2、WO 0006605 A2、WO02072635 A2、WO 04081051 A1、WO 06020258 A2、WO 2007044887 A2、WO 2007095338 A2、WO 2007137760 A2、WO 2008119353 A1、WO 2009021754 A2、WO 2009068630 A1、WO9103493 A1、WO 9323537 A1、WO 9409131 A1、WO 9412625 A2、WO 9509917 A1、WO 9637621A2、WO 9964460 A1中。上述申请的内容通过援引以其全文并入本文。

在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL

在一个方面，双特异性抗体分子的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列(例如scFv，该scFv对BCMA具有结合特异性，例如包含如本文所述，例如如表2、表6和表10中所述的scFv，或包含来自本文所述的BCMA scFv的轻链CDR和/或重链CDR)和第二免疫球蛋白可变结构域序列(该第二免疫球蛋白可变结构域序列对不同抗原上的第二表位具有结合特异性)。在一些方面，第二免疫球蛋白可变结构域序列对在AML细胞上表达的抗原(例如除BCMA之外的抗原)具有结合特异性。例如，第二免疫球蛋白可变结构域序列对CD123具有结合特异性。作为另一个实例，第二免疫球蛋白可变结构域序列对CLL-1具有结合特异性。作为另一个实例，第二免疫球蛋白可变结构域序列对CD34具有结合特异性。作为另一个实例，第二免疫球蛋白可变结构域序列对FLT3具有结合特异性。例如，第二免疫球蛋白可变结构域序列对叶酸受体β具有结合特异性。在一些方面，第二免疫球蛋白可变结构域序列对B细胞上表达的抗原(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)具有结合特异性。

嵌合TCR

在一个方面，本发明的抗BCMA抗体和抗体片段(例如，表2、表6和表10中披露的那些)可以接枝到T细胞受体(“TCR”)链(例如，TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生特异性结合至BCMA的嵌合TCR。不受理论的束缚，据信嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，如本文所披露的BCMA scFv可以接枝到TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域(例如，细胞外恒定结构域的至少一部分)、跨膜结构域和胞质结构域。作为另一个实例，BCMA抗体片段(例如，本文所述的VL结构域)可以接枝到TCRα链的恒定结构域，并且BCMA抗体片段(例如，本文所述的VH结构域)可以接枝到TCRβ链的恒定结构域(或者，VL结构域可以接枝到TCRβ链的恒定结构域，VH结构域可以接枝到TCRα链)。作为另一个实例，抗BCMA抗体或抗体片段的CDR，例如表2-13中所述的抗BCMA抗体或抗体片段的CDR可以接枝到TCRα和/或β链，以产生特异性结合BCMA的嵌合TCR。例如，本文披露的LCDR可以接枝到TCRα链的可变结构域中，并且本文披露的HCDR可以接枝到TCRβ链的可变结构域，或反之亦然。此类嵌合TCR可以通过本领域已知的方法产生(例如，Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]2000；7:1369-1377；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]2004；11:487-496；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]2012年4月；19(4):365-74)。

其他实施例

在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞还可以包含第二CAR，例如包含不同抗原结合结构域的第二CAR，该抗原结合结构域例如针对相同的靶标(BCMA)或不同的靶标(例如，CD19、CD20，或CS-1，或其他多发性骨髓瘤靶标，例如κ轻链、CD138、路易斯(Lewis)Y抗原或CD38(Garfall等人,Discovery Medicine[发现医学],2014,17(91):37-46))。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27、ICOS或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制在表达两种靶的细胞中。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一BCMA CAR(该第一BCMA CAR包括BCMA结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域)和第二CAR(该第二CAR靶向除BCMA之外的抗原(例如在白血病或淋巴瘤细胞上表达的抗原，例如CD19、CD20、CS-1、κ轻链、CD139、路易斯Y抗原或CD38)并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一BCMA CAR(该第一BCMACAR包括BCMA结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域)和第二CAR(该第二CAR靶向除BCMA之外的抗原(例如在白血病或淋巴瘤细胞上表达的抗原，例如CD19、CD20、CS-1、κ轻链、CD139、路易斯Y抗原或CD38)并且包括针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域)。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含本文所述的BCMA CAR和靶向CD19的CAR(CD19 CAR)。

在一些实施例中，表达CAR的细胞包含本文所述的BCMA CAR和抑制性CAR。在一些实施例中，抑制性CAR包含结合存在于正常细胞而非癌细胞上的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ的细胞内结构域。

在一些实施例中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同的CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不相互作用。例如，表达第一CAR和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域(例如，作为片段，例如scFv)，该抗原结合结构域不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、衍生自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域、和除抗体衍生的那些之外的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术的、或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。

在一个方面，SDAB分子可以衍生自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如像衍生自在鲨鱼血清中发现的称为新颖抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白质科学]14:2901-2909中描述了产生衍生自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法。

根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链。在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature[自然]363:446-448中披露了此类单结构域分子。出于清楚的原因，衍生自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼。除骆驼科外的其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHH在本发明的范围内。

SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。

还发现，具有多个嵌合膜嵌入受体(这些嵌合膜嵌入受体包含抗原结合结构域，受体的抗原结合结构域之间具有相互作用)的细胞可能是不希望的，例如，因为它抑制一个或多个抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。因此，本文披露了具有第一非天然存在的嵌合膜嵌入受体和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，该嵌合膜嵌入受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还披露了编码第一和第二非天然存在的嵌合膜包埋受体的核酸，该嵌合膜包埋受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在一个实施例中，所述第一非天然存在的嵌合膜嵌入受体、所述第二非天然存在的嵌合膜包埋受体之一的抗原结合结构域包括scFv，而另一个包括单个VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。

在一些实施例中，要求保护的本发明包括第一CAR和第二CAR，其中所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域是scFv，而另一者不是scFv。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。

在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包括scFv，并且另一个包括单个VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域，或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包括scFv，而另一者包括纳米抗体。在一些实施例中，所述第一CAR和所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含scFv，而另一者包含骆驼科动物VHH结构域。

在一些实施例中，当存在于细胞表面时，所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不会因所述第二CAR的存在而降低。在一些实施例中，在所述第二CAR存在下，所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是不存在所述第二CAR的情况下所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，所述第一CAR、所述第二CAR的抗原结合结构域彼此的缔合小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况下的缔合。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR的抗原结合结构域彼此的缔合比两者都是scFv抗原结合结构域的情况下的缔合少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

在另一个方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞活性的药剂。例如，在一些实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂，例如本文所述的药剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如，PD1)可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ。在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一些实施例中，药剂包括例如抑制性分子的第一多肽和第二多肽，该抑制性分子如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ或这些中的任一者的片段(例如，这些中的任一者的细胞外结构域的至少一部分)，该第二多肽是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包括共刺激结构域(例如，41BB、CD27、ICOS或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域))。在一些实施例中，该药剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的细胞外结构域的至少一部分)和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞包含开关共刺激受体，例如，如WO 2013/019615(该专利通过援引以其全文并入本文)中所述。PD1是受体的CD28家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在激活的B细胞、T细胞和髓系细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75)。已经显示PD1的两种配体PD-L1和PD-L2在与PD1结合后下调T细胞激活(Freeman等人2000 J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人2003 J Mol Med[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。

在一些实施例中，该药剂包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))的细胞外结构域(ECD)，可以与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(如41BB和CD3ζ)融合(在本文中也称为PD1 CAR)。在一些实施例中，PD1 CAR当与本文所述的BCMA CAR组合使用时，改善了表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的持久性。在一些实施例中，CAR是PD1 CAR，其包含PD1的细胞外结构域，如SEQ ID NO:24中加下划线所指示的。在一些实施例中，PD1 CAR包含SEQID NO:24的氨基酸序列。

在一些实施例中，PD1 CAR包含下文提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。

在一些实施例中，该药剂包含编码PD1 CAR(例如，本文所述的PD1 CAR)的核酸序列。在一些实施例中，PD1 CAR的核酸序列如SEQ ID NO:23所提供，PD1 ECD以下划线标出。

在另一个方面，本发明提供表达CAR的细胞群体，例如CART细胞或表达CAR的NK细胞。在一些实施例中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一些实施例中，表达CAR的细胞群体(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)可以包括表达具有本文所述的抗BCMA结合结构域的CAR的第一细胞，和表达具有不同的抗BCMA结合结构域(例如，不同于第一细胞表达的CAR中的抗BCMA结合结构域的本文所述的抗BCMA结合结构域)的CAR的第二细胞。作为另一个实例，表达CAR的细胞群体可以包括表达包含例如如本文所述的抗BCMA结合结构域的CAR的第一细胞，和表达包含针对除BCMA之外的靶标(例如，CD19、CD20、CS-1、κ轻链、CD139、路易斯Y抗原或CD38)的抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在一些实施例中，表达CAR的细胞群体包括表达包含例如如本文所述的抗BCMA结合结构域的CAR的第一细胞，和表达包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR(CD19 CAR)的第二细胞。在一些实施例中，表达CAR的细胞群体包括，例如表达包含初级细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包含次级信号传导结构域的CAR的第二细胞。

在另一个方面，本发明提供这样的细胞群体：其中该群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的抗BCMA域的CAR，并且第二细胞表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性的药剂。例如，在一些实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施例中，抑制性分子例如可降低表达CAR的细胞产生免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ。在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一些实施例中，药剂包括例如抑制性分子的第一多肽和第二多肽，该抑制性分子如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ或这些中的任一者的片段(例如，这些中的任一者的细胞外结构域的至少一部分)，该第二多肽是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包括共刺激结构域(例如，41BB、CD27、ICOS或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域))。在一些实施例中，该药剂包含PD1或其片段(例如PD1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如本文描述的CD28信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。

在一个方面，本发明提供这样的方法：该方法包括施用表达CAR的细胞群体(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)，例如表达不同CAR的细胞与另一种药剂(例如，激酶抑制剂，如本文所述的激酶抑制剂)组合的混合物。在另一个方面，本发明提供包括与另一种药剂(例如，激酶抑制剂，如本文所述的激酶抑制剂)组合施用细胞群的方法，其中群体中的至少一种细胞表达具有如本文所述的抗癌相关抗原结合结构域的CAR，并且第二细胞表达另一种药剂(例如，增强表达CAR的细胞活性的药剂)。

自然杀伤细胞受体(NKR)CAR

在一个实施例中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任一以下自然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公布号WO2014/145252中，该专利的内容特此通过援引并入。

调节嵌合抗原受体的策略

可以通过多种方式调节CAR活性。在一些实施例中，希望CAR活性可控制的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和功效。例如，使用例如与二聚化结构域融合的半胱天冬酶诱导细胞凋亡(参见例如Di等人,N Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011年11月3日；365(18):1673-1683)可用作本发明CAR疗法中的安全性开关。在另一个实例中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型半胱天冬酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚物药物(例如利米度塞(rimiducid)(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致激活细胞的半胱天冬酶-9和细胞凋亡。诱导型半胱天冬酶-9分子含有二聚化化学诱导物(CID)结合结构域，其在CID的存在下介导二聚化。这导致表达CAR的细胞的诱导性和选择性耗减。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与一种或多种CAR编码载体分开的核酸分子编码。在一些情况下，诱导型半胱天冬酶-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。诱导型半胱天冬酶-9可以提供安全性开关，以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如，Song等人Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]2008；15(10):667-75；临床试验标识号NCT02107963；和Di Stasi等人N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]2011；365:1673-83。

用于调节本发明的CAR疗法的可替代策略包括利用使CAR活性失活或关闭的小分子或抗体，例如通过使表达CAR的细胞缺失，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达被能够诱导细胞死亡的分子(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)识别的抗原。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。此类受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如整联蛋白αvβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD1 1、CD1 1 a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/基础免疫球蛋白、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如保留一个或多个细胞外表位但缺少在胞质结构域内的一个或多个区的形式)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，该截短的表皮生长因子受体缺乏信号传导能力但保留了被能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗(cetuximab，

在一些实施例中，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施例中通常为两个，其中本文所述的标准CAR的组分，例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域，被分配在分开的多肽或成员上。在一些实施例中，该组多肽包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如，可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。本文和国际公开号WO 2015/090229中提供了这种可调节CAR的另外描述和示例性构造，该专利据此通过援引以其全文并入。

在一个实施例中，RCAR包含两个多肽或成员：1)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含细胞内信号传导结构域(例如，本文所述的初级细胞内信号传导结构域)和第一开关结构域；2)抗原结合成员，该抗原结合成员包含例如如本文所述靶向本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域和第二开关结构域。任选地，RCAR包含本文所述的跨膜结构域。在一个实施例中，跨膜结构域可以布置在细胞内信号传导成员上、抗原结合成员上、或两者上。除非另有说明，否则当本文描述RCAR的成员或元件时，顺序可以如所提供的那样，但也包括其他顺序。换句话说，在一个实施例中，顺序如文中所述，但在其他实施例中，顺序可以不同。例如，跨膜区一侧上的元件的顺序可以与实例不同，例如，开关结构域相对于细胞内信号传导结构域的放置可以是不同的，例如，相反的。

在一个实施例中，第一开关结构域和第二开关结构域可以形成细胞内或细胞外二聚化开关。在一个实施例中，二聚化开关可以是同源二聚化开关，例如，其中第一开关结构域和第二开关结构域是相同的，或异源二聚化开关，例如，其中第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同。

在实施例中，RCAR可以包含“多开关”。多开关可以包括异源二聚化开关结构域或同源二聚化开关结构域。多开关在第一成员(例如，抗原结合成员)和第二成员(例如，细胞内信号传导成员)上独立地包括多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)开关结构域。在一个实施例中，第一成员可以包含多个第一开关结构域(例如，基于FKBP的开关结构域)，并且第二成员可以包含多个第二开关结构域(例如，基于FRB的开关结构域)。在一个实施例中，第一成员可以包含第一开关结构域和第二开关结构域(例如，基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域)，并且第二成员可以包含第一开关结构域和第二开关结构域(例如，基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域)。

在一个实施例中，细胞内信号传导成员包含一个或多个细胞内信号传导结构域(例如，初级细胞内信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。

在一个实施例中，抗原结合成员可以包含一个或多个细胞内信号传导结构域，例如一个或多个共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，抗原结合成员包含本文所述的多个(例如，2或3个)共刺激信号传导结构域，例如，选自4-1BB、CD28、CD27、ICOS、和OX40，并且在实施例中，没有初级细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，抗原结合成员从细胞外到细胞内方向包含以下共刺激信号传导结构域：4-1BB-CD27；4-1BB-CD27；CD27-4-1BB；4-1BB-CD28；CD28-4-1BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-4-1BB；或4-1BB-CD28。在此类实施例中，细胞内结合成员包含CD3ζ结构域。在一个此类实施例中，RCAR包含(1)抗原结合成员，该抗原结合成员包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和两个共刺激结构域和第一开关结构域；和(2)细胞内信号传导结构域，该细胞内信号传导结构域包含跨膜结构域或膜系链结构域和至少一个初级细胞内信号传导结构域、和第二开关结构域。

一个实施例提供了RCAR，其中抗原结合成员不与CAR细胞表面系接。这使得具有细胞内信号传导成员的细胞可以方便地与一个或多个抗原结合结构域配对，而不用编码抗原结合成员的序列来转化细胞。在此类实施例中，RCAR包含：1)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含：第一开关结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域(例如，初级细胞内信号传导结构域)、和第一开关结构域；和2)抗原结合成员，该抗原结合成员包含：抗原结合结构域、和第二开关结构域，其中抗原结合成员不包含跨膜结构域或膜系链结构域，并且任选地，不包含细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR可以进一步包含3)第二抗原结合成员，该第二抗原结合成员包含：第二抗原结合结构域，例如结合不同抗原的而不是由抗原结合结构域结合的第二抗原结合结构域；和第二开关结构域。

本文还提供了RCAR，其中抗原结合成员包含双特异性激活和靶向能力。在此实施例中，抗原结合成员可以包含多个(例如2、3、4或5个)抗原结合结构域，例如scFv，其中每个抗原结合结构域结合靶抗原，例如不同的抗原或相同的抗原，例如，相同抗原上的相同或不同表位。在一个实施例中，多个抗原结合结构域串联，并且任选地，在每个抗原结合结构域之间布置接头或铰链区。本文描述了合适的接头和铰链区。

一个实施例提供了具有允许开关增殖的构型的RCAR。在此实施例中，RCAR包含：1)细胞内信号传导成员，该细胞内信号传导成员包含：任选地，跨膜结构域或膜系链结构域；一个或多个共刺激信号传导结构域，例如，选自4-1BB、CD28、CD27、ICOS、和OX40，以及开关结构域；和2)抗原结合成员，该抗原结合成员包含：抗原结合结构域、跨膜结构域、和初级细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ结构域)，其中抗原结合成员不包含开关结构域，或者不包含与细胞内信号传导结构域上的开关结构域二聚化的开关结构域。在一个实施例中，抗原结合成员不包含共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导成员包含来自同源二聚化开关的开关结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导成员包含异源二聚化开关的第一开关结构域，并且RCAR包含第二细胞内信号传导成员，该第二细胞内信号传导成员包含异源二聚化开关的第二开关结构域。在此类实施例中，第二细胞内信号传导成员包含与细胞内信号传导成员相同的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，二聚化开关是细胞内的。在一个实施例中，二聚化开关是细胞外的。

在本文所述的任何RCAR构型中，第一开关结构域和第二开关结构域包含如本文所述的基于FKBP-FRB的开关。

本文还提供包含本文所述RCAR的细胞。任何经工程化以表达RCAR的细胞都可以用作RCARX细胞。在一个实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在一个实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。

本文还提供包含RCAR编码序列的核酸和载体。编码RCAR的各种元件的序列可以布置在相同的核酸分子上，该核酸分子例如相同的质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体。在一个实施例中，(i)编码抗原结合成员的序列和(ii)编码细胞内信号传导成员的序列可以存在于相同的核酸例如载体上。可以通过例如使用单独的启动子或通过使用双顺反子转录产物(其可以通过裂解单个翻译产物或通过翻译两个分开的蛋白质产物来产生两个蛋白质产物)来实现相应蛋白质的产生。在一个实施例中，编码可裂解肽的序列(例如，P2A或F2A序列)布置在(i)与(ii)之间。在一个实施例中，编码IRES(例如，EMCV或EV71 IRES)的序列布置在(i)与(ii)之间。在这些实施例中，(i)和(ii)转录为单个RNA。在一个实施例中，第一启动子与(i)可操作地连接，并且第二启动子与(ii)可操作地连接，使得(i)和(ii)转录为单独的mRNA。

替代性地，编码RCAR的各种元件的序列可以布置在不同的核酸分子上，该核酸分子例如不同的质粒或载体，例如病毒载体，例如慢病毒载体。例如，(i)编码抗原结合成员的序列可以存在于第一核酸(例如，第一载体)上，并且(ii)编码细胞内信号传导成员的序列可以存在于第二核酸(例如，第二载体)上。

二聚化开关

二聚化开关可以是非共价的或共价的。在非共价二聚化开关中，二聚化分子促进开关结构域之间的非共价相互作用。在共价二聚化开关中，二聚化分子促进开关结构域之间的共价相互作用。

在一个实施例中，RCAR包含基于FKBP/FRAP或基于FKBP/FRB的二聚化开关。FKBP12(FKBP或FK506结合蛋白)是丰富的胞质蛋白，该胞质蛋白充当天然产物免疫抑制药物(雷帕霉素)的初始细胞内靶标。雷帕霉素结合至FKBP和大型PI3K同源物FRAP(RAFT，mTOR)。FRB是FRAP的93个氨基酸部分，该氨基酸部分足以结合FKBP-雷帕霉素复合物(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.和Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associatedprotein and characterization of a critical serine residue[鉴定289-kDa FKBP12-雷帕霉素相关的蛋白内的11-kDa FKBP12-雷帕霉素结合结构域并表征关键的丝氨酸残基].Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]92:4947-51)。

在实施例中，基于FKBP/FRAP(例如FKBP/FRB)的开关可以使用二聚化分子，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物。

FKBP的示例性氨基酸序列如下：

D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G RT F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G KQ E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I IP P H A T L V F D V E L L K L E T S Y(SEQ ID NO:275)

在实施例中，FKBP开关结构域可以包含FKBP的片段，该FKBP的片段具有在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的情况下与FRB或其片段或类似物结合的能力。在一些实施例中，FKBP开关结构域包含以下的氨基酸序列：

V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K FD S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L TI S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S(SEQ IDNO:276)

FRB的氨基酸序列如下：

ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLMEAQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(SEQ ID NO:277)

如本文所用，术语“基于FKBP/FRAP(例如，FKBP/FRB)的开关”是指二聚化开关，该二聚化开关包含：第一开关结构域，该第一开关结构域包含FKBP片段或其类似物，该FKBP片段或其类似物具有在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如，RAD001)的情况下与FRB或其片段或类似物结合的能力，并且与SEQ ID NO:275或276的FKBP序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或相差不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基；和第二开关结构域，该第二开关结构域包含FRB片段或其类似物，该FRB片段或其类似物具有在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的情况下与FRB或其片段或类似物结合的能力，并且与SEQ ID NO:277的FRB序列具有至少70％、75％、80％、85、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或相差不超过30个、25个、20个、15个、10个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基。在一个实施例中，本文所述的RCAR包含一个包含SEQ ID NO:275(或SEQ ID NO:276)中披露的氨基酸残基的开关结构域，以及一个包含SEQ ID NO:277中披露的氨基酸残基的开关结构域。

在实施例中，FKBP/FRB二聚化开关包含经修饰的FRB开关结构域，该经修饰的FRB开关结构域在基于FRB的开关结构域(例如，经修饰的FRB开关结构域、基于FKBP的开关结构域)与二聚化分子(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如RAD001))之间表现出改变的(例如增强的)复合物形成。在一个实施例中，经修饰的FRB开关结构域包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)突变，这些突变选自一个或多个氨基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105和F2108的突变，其中野生型氨基酸突变为任何其他天然存在的氨基酸。在一个实施例中，突变体FRB包含E2032处的突变，其中E2032突变为苯丙氨酸(E2032F)、甲硫氨酸(E2032M)、精氨酸(E2032R)、缬氨酸(E2032V)、酪氨酸(E2032Y)、异亮氨酸(E2032I)，例如SEQ ID NO:278、或亮氨酸(E2032L)，例如SEQ IDNO:279。在一个实施例中，突变体FRB包含T2098处的突变，其中T2098突变为苯丙氨酸(T2098F)或亮氨酸(T2098L)，例如SEQ ID NO:280。在一个实施例中，突变体FRB包含E2032和T2098处的突变，其中E2032突变为任何氨基酸，并且其中T2098突变为任何氨基酸，例如SEQ ID NO:281。在一个实施例中，突变体FRB包含E2032I和T2098L突变，例如SEQ ID NO:282。在一个实施例中，突变体FRB包含E2032L和T2098L突变，例如SEQ ID NO:283。

表14.示例性突变体FRB对二聚化分子具有增加的亲和力。

其他合适的二聚化开关包括基于GyrB-GyrB的二聚化开关、基于赤霉素的二聚化开关、标签/粘合剂二聚化开关、和卤素标签/快速标签二聚化开关。按照本文提供的指导，此类开关和相关的二聚化分子对于普通技术人员将是显而易见的。

二聚化分子

通过二聚化分子来促进开关结构域之间的缔合。在二聚化分子存在下，开关结构域之间的相互作用或结合允许在与第一开关结构域缔合(例如，融合)的多肽和与第二开关结构域缔合(例如，融合)的多肽之间进行信号转导。在非限制性水平的二聚化分子存在下，例如，如在本文所述的系统中，信号转导增加了1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍。

雷帕霉素和雷帕霉素类似物(rapamycin analog)(有时称为雷帕霉素类似物(rapalogue)，例如RAD001)可用作本文所述的基于FKBP/FRB的二聚化开关中的二聚化分子。在一个实施例中，二聚化分子可以选自雷帕霉素(西罗莫司)、RAD001(依维莫司)、佐他莫司、替西罗莫司，AP-23573(地磷莫司)、拜耳莫司(biolimus)和AP21967。适用于与基于FKBP/FRB的二聚化开关一起使用的其他雷帕霉素类似物在标题为“组合疗法”的部分中或在标题为“与低(免疫增强)剂量的mTOR抑制剂组合”的小节中进一步描述。

分离的CAR

在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法在公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中更详细地描述，这些公开通过援引并入本文。简而言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当该细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当该细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，该表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全活化。在实施例中，第一抗原结合结构域识别BCMA，例如包含本文所述的抗原结合结构域，并且第二抗原结合结构域识别在急性髓性白血病细胞上表达的抗原，例如CD123、CLL-1、CD34、FLT3或叶酸受体β。在实施例中，第一抗原结合结构域识别BCMA，例如包含本文所述的抗原结合结构域，并且第二抗原结合结构域识别在B细胞上表达的抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。

稳定性和突变

可以参考常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理学性质(例如，热稳定性)来评估抗BCMA结合结构域(例如，scFv分子(例如，可溶性scFv))的稳定性。

随后将抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的改善的热稳定性赋予整个CART-BCMA构建体，从而改善CART-BCMA构建体的治疗性质。与常规抗体相比，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的热稳定性可以提高至少约2℃或3℃。在一些实施例中，与常规抗体相比，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的热稳定性提高1℃。在另一个实施例中，与常规抗体相比，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的热稳定性提高2℃。在另一个实施例中，与常规抗体相比，scFv具有4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃提高的热稳定性。可以例如在本文披露的scFv分子以及scFv VH和VL来源的scFv分子或抗体的Fab片段之间进行比较。可以使用本领域已知的方法测量热稳定性。例如，在一些实施例中，可以测量Tm。用于测量Tm的方法和测定蛋白质稳定性的其他方法在下文更详细地描述。

scFv中的突变(通过可溶性scFv的人源化或直接诱变来产生)改变了scFv的稳定性并且提高了scFv和CART33构建体的总体稳定性。可以使用如Tm、温度变性和温度聚集的测量将人scFv的稳定性与鼠scFv进行比较。

突变scFv的结合能力可以使用实例中所述的测定法来确定。

在一些实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)包含产生自人源化过程的至少一个突变，以使得突变的scFv赋予CART-BCMA构建体改善的稳定性。在另一个实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)包含来自人源化过程的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个突变，以使得突变的scFv赋予CART-BCMA构建体改善的稳定性。

评价蛋白质稳定性的方法

可以使用例如下述方法评估抗原结合结构域的稳定性。此类方法允许测定多个热解折叠过渡，其中最不稳定的结构域首先解折叠或限制协同解折叠的多结构域单元(例如，表现出单个解折叠过渡的多结构域蛋白质)的总体稳定性阈值。可以通过许多其他方式鉴定最不稳定的结构域。可以进行诱变以探测哪个结构域限制了整体稳定性。另外，多结构域蛋白的蛋白酶抗性可以在其中已知最不稳定的结构域固有地解折叠的条件下通过DSC或其他光谱方法进行(Fontana等人,(1997)Fold.Des.[折叠设计],2:R17-26；Dimasi等人,(2009)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]393:672-692)。一旦鉴定出最不稳定的结构域，可以将编码该结构域(或其部分)的序列用作方法中的测试序列。

a)热稳定性

可以使用本领域已知的许多非限制性生物物理或生物化学技术分析组合物的热稳定性。在某些实施例中，通过分析光谱法评价热稳定性。

示例性分析光谱法是差示扫描量热法(DSC)。DSC采用量热计，该量热计对伴随大多数蛋白质或蛋白质结构域的解折叠的热吸收敏感(参见例如，Sanchez-Ruiz等人,Biochemistry[生物化学],27:1648-52,1988)。为了确定蛋白质的热稳定性，将蛋白质样品插入到量热计中并且升高温度直至Fab或scFv解折叠。蛋白质解折叠的温度指示总体蛋白质稳定性。

另一种示例性分析光谱法是圆二色(CD)光谱法。CD光谱法测量组合物的光学活性随温度增加的变化。圆二色(CD)光谱法测量由于结构不对称性而产生的左旋偏振光与右旋偏振光的吸收差异。无序或解折叠的结构导致CD光谱与有序或折叠结构的CD光谱非常不同。CD光谱反映了蛋白质对增加温度的变性作用的敏感性，并且因此指示蛋白质的热稳定性(参见van Mierlo和Steemsma,J.Biotechnol.[生物技术杂志],79(3):281-98,2000)。

用于测量热稳定性的另一种示例性分析光谱法是荧光发射光谱法(参见vanMierlo和Steemsma，同上)。用于测量热稳定性的又另一种示例性分析光谱法是核磁共振(NMR)光谱法(参见例如，van Mierlo和Steemsma，同上)。

组合物的热稳定性可以以生物化学方式测量。用于评估热稳定性的示例性生物化学方法是热激发测定。在“热激发测定”中，使组合物经受一系列升高的温度持续一段设定的时间。例如，在一些实施例中，使测试scFv分子或包含scFv分子的分子经受一系列递增温度，例如持续1-1.5小时。然后通过相关的生化测定来测定蛋白质的活性。例如，如果蛋白质是结合蛋白(例如scFv或含有scFv的多肽)，则结合蛋白的结合活性可以通过功能性或定量ELISA来确定。

这种测定可以以高通量形式进行，并且在实例中披露了使用大肠杆菌和高通量筛选的那些测定。可以使用本领域已知的方法来产生抗BCMA结合结构域(例如，scFv变体)的文库。可以诱导抗BCMA结合结构域(例如，scFv)表达，并且可以使抗BCMA结合结构域(例如，scFv)经受热激发。可以测定激发的测试样品的结合，并且可以按比例放大和进一步表征那些稳定的抗BCMA结合结构域(例如，scFv)。

通过使用任何上述技术(例如分析光谱技术)测量组合物的解链温度(Tm)来评价热稳定性。解链温度是热转变曲线中点处的温度，其中组合物的50％分子处于折叠状态中(参见，例如Dimasi等人(2009)J.Mol Biol.[分子生物学杂志]393:672-692)。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的Tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一些实施例中，IgG的Tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一些实施例中，多价抗体的Tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。

还通过使用分析量热技术(例如DSC)测量组合物的比热或热容(Cp)来评价热稳定性。组合物的比热是1mol水升高1℃温度所需的能量(例如以kcal/mol计)。大的Cp是变性或无活性蛋白质组合物的标志。通过确定组合物在热转变之前和之后的比热来测量组合物的热容量变化(ΔCp)。还可以通过测量或确定热力学稳定性的其他参数(包括解折叠的吉布斯自由能(ΔG)、解折叠的焓(ΔH)或解折叠的熵(ΔS))来评估热稳定性。使用上述生物化学测定中的一种或多种(例如热激发测定)来确定50％组合物保持其活性(例如结合活性)的温度(即T

另外，与未突变的抗BCMA结合结构域(例如，scFv)相比，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的突变改变了抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的热稳定性。当人或人源化抗BCMA结合结构域(例如，scFv)掺入BCMA构建体时，抗BCMA结合结构域(例如，人源化scFv)赋予整个抗BCMA CART构建体热稳定性。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)包含赋予抗BCMA结合结构域(例如，scFv)热稳定性的单个突变。在另一个实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)包含赋予抗BCMA结合结构域(例如，scFv)热稳定性的多个突变。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域(例如，scFv)中的多个突变对抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的热稳定性具有累加效应。

b)聚集性％

组合物的稳定性可通过测量其聚集倾向来确定。聚集性可以通过许多非限制性生物化学或生物物理技术来测量。例如，组合物的聚集性可以使用色谱法，例如大小排阻色谱法(SEC)评价。SEC根据大小分离分子。使柱填充有半固体聚合物凝胶珠，这些珠将允许离子和小分子进入其内部但不允许大分子进入。当将蛋白质组合物施加到柱的顶部时，紧密折叠的蛋白质(即非聚集的蛋白质)通过比大蛋白质聚集体可用的更大体积溶剂分布。因此，大聚集体更快地移动通过柱，并且以这种方式可以将混合物分离或分级分离成其组分。当从凝胶中洗脱时，每个级分可以单独定量(例如通过光散射)。因此，组合物的聚集性％可以通过比较级分的浓度与施加到凝胶上的蛋白质的总浓度来确定。稳定的组合物从柱中洗脱为基本上单一的级分，并且在洗脱曲线或色谱图中基本上显示为单个峰。

c)结合亲和力

可以通过确定其靶结合亲和力来评估组合物的稳定性。用于确定结合亲和力的多种方法在本领域中是已知的。用于确定结合亲和力的示例性方法采用表面等离子体共振。表面等离子体共振是一种光学现象，该光学现象允许例如使用BIAcore系统通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用(瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦的玛西亚生物传感器公司(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden andPiscataway,N.J.))。有关进一步说明，参见Jonsson,U.等人,(1993)Ann.Biol.Clin.[临床生物学年刊]51:19-26；Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques[生物技术]11:620-627；Johnsson,B.等人,(1995)J.Mol.Recognit.[分子识别杂志]8:125-131；以及Johnnson,B.等人,(1991)Anal.Biochem.[生物化学年刊]198:268-277。

在一个方面，CAR的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且该抗原结合结构域保留了本文所述的抗BCMA抗体片段的所需功能特性。在一个具体方面，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在另一个方面，抗体片段包括scFv。

在各个方面，CAR的抗原结合结构域是通过以下方式被工程化：对在一个或两个可变区(例如，VH和/或VL)内，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸进行修饰。在一个具体方面，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在另一个方面，抗体片段包含scFv。

本领域普通技术人员将理解，可以进一步修饰本发明的抗体或抗体片段，使得它们在氨基酸序列(例如，来自野生型)方面改变，但所希望的活性不变。例如，可以对蛋白质进行另外的核苷酸置换，例如导致氨基酸置换的保守置换，例如在“非必需”氨基酸残基处的保守置换。例如，可以用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换分子中的非必需氨基酸残基。在另一个实施例中，一串氨基酸可被一串结构相似的、在侧链家族成员的顺序和/或组成方面不同的氨基酸替代，例如可以产生保守置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代。

本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下的同一性百分比是指两个或更多个相同的序列。当在比较窗口上(或使用以下序列比较算法之一或通过手动校准和目视检查测量的指定区域)进行比较和比对以获得最大对应性时，如果两个序列具有相同的指定百分比的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域，或者当未指定时，在整个序列中，60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。

对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行：例如，通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的同源比对算法；通过搜索Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法；通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星州麦迪逊市科学路575号(575Science Dr.,Madison,WI)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过手动校准和目视检查(参见例如，Brent等人,(2003)Current Protocolsin Molecular Biology[当代分子生物学实验指南])。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得。

也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17)的算法、使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已并入GCG软件包(在www.gcg.com可获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6、或4的空位权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。

在一个方面，本发明考虑了产生功能等价分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以修饰CAR中包含的抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的VH或VL，以保留抗BCMA结合结构域(例如，scFv)的起始VH或VL框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明考虑了整个CAR构建体的修饰，例如，在CAR构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以为了产生功能等价分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。

编码CAR的核酸构建体

本发明还提供了编码一种或多种本文所述CAR构建体的核酸分子。在一个方面，核酸分子以信使RNA转录物提供。在一个方面，核酸分子以DNA构建体提供。

因此，在一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含抗BCMA结合结构域(例如，人抗BCMA结合结构域)、跨膜结构域和包含刺激结构域(例如，共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如ζ链)的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域是本文所述的抗BCMA结合结构域，或与其具有95％-99％同一性的序列。在一些实施例中，跨膜结构域是选自下组的蛋白质的跨膜结构域，该组由以下组成：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域通过铰链区(例如，本文所述的铰链)连接至跨膜结构域。在一些实施例中，分离的核酸分子还包含编码初级信号传导结构域的序列。在一些实施例中、初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12或CD66d的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一些实施例中，共刺激结构域是选自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体的蛋白质的功能性信号传导结构域。

在另一个方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，该CAR构建体包含SEQ ID NO:1的前导序列。

在另一个方面，本发明涉及一种由核酸分子编码的分离的多肽分子。

编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如像通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含基因的载体中获得基因，或者通过使用标准技术从含有基因的细胞和组织中直接分离。替代性地，感兴趣的基因可以合成产生，而不是克隆。

本发明还提供了其中插入本发明的DNA的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖性细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)、和感兴趣的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology andApplication[γ逆转录病毒载体：生物学/技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713)。

在另一个实施例中，包含编码本发明所希望CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，可以使用转座子(如sleeping beauty)、CRISPR、CAS9、和锌指核酸酶来完成编码CAR的核酸的表达。见下文June等人2009Nature Reviews Immunology[自然免疫学综述]9.10:704-716，该文献通过援引并入本文。

简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达典型地是通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接、并将构建体并入到表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所希望核酸序列表达的启动子。

使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域中是已知的。参见例如美国专利No.5,399,346、5,580,859、5,589,466，这些专利通过援引以其全文并入本文。在另一个实施例中，本发明提供了一种基因治疗载体。

可以将核酸克隆至许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港出版社],纽约中，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有复制功能的起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。

另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30-110bp的区中，但是已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，使得当元件彼此相对发生颠倒或移动时启动子功能可以得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，显现单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。

能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已经显示出有效地驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。在一个方面，EF1a启动子包含提供为SEQ ID NO:11的序列。

启动子的另一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够当需要该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达时启动这种表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能是希望的。以下提供了示例性PGK启动子的核苷酸序列。

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:190)

PGK100：

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:198)

PGK200：

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:191)

PGK300：

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:192)

PGK400：

ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:193)

载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记)。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入到细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以便于从旨在通过病毒载体经转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择标记物可以在单独的DNA片段上携带并用于共转染程序。选择标记物和报告基因二者都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。

报告基因用于鉴定可能经转染的细胞和用于评价调节序列的功能。通常，报告基因是如下基因，该基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，该多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入到受体细胞中后的适当时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS快报479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。

在一些实施例中，载体可以进一步包含编码第二CAR的核酸。在一些实施例中，第二CAR包括针对以下靶标的抗原结合结构域：在急性髓性白血病细胞上表达的靶标，例如像CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β或FLT3；或在B细胞上表达的靶标，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。在一些实施例中，该载体包含编码特异性结合第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR的核酸，以及编码特异性结合第二不同抗原并且包括具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR的核酸。在一些实施例中，载体包含编码第一BCMA CAR的核酸，该第一BCMA CAR包含BCMA结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和编码第二CAR的核酸，该第二CAR靶向除BCMA之外的抗原(例如，在AML细胞上表达的抗原，例如，CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β、或FLT3；或在B细胞上表达的抗原，例如，CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)，并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，载体包含编码第一BCMA CAR的核酸和编码第二CAR的核酸，该第一BCMACAR包括BCMA结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，该第二CAR特异性结合除BCMA之外的抗原(例如，在AML细胞上表达的抗原，例如CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β或FLT3；或在B细胞上表达的抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)，并且包括抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。

在一些实施例中，载体包含编码本文所述的BCMA CAR的核酸和编码抑制性CAR的核酸。在一些实施例中，抑制性CAR包含结合存在于正常细胞而非癌细胞(例如，另外表达BCMA的正常细胞)上的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ的细胞内结构域。

在实施例中，载体可以包含编码CAR(例如，本文所述的BCMA CAR)和第二CAR(例如，抑制性CAR或特异性结合除BCMA之外的抗原(例如在AML细胞上表达的抗原，例如CD123、CLL-1、CD34、FLT3或叶酸受体β；或抗原表达B细胞，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)的CAR)的两种或更多种核酸序列。在此类实施例中，编码CAR的两种或更多种核酸序列由相同框中的单个核酸分子编码并且作为单个多肽链。在这方面，两种或更多种CAR可以例如通过一个或多个肽切割位点分开。(例如，细胞内蛋白酶的自动切割位点或底物)。肽切割位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的：

T2A：(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:194)

P2A：(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:195)

E2A：(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:196)

F2A：(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:197)

将基因引入到细胞中并将其在细胞中表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的背景下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆实用指南],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验出版社],纽约)。将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。

用于将感兴趣的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊)。可获得现有技术的靶向递送核酸(如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸)的其他方法。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体是脂质体。考虑使用脂质制剂以将核酸引入到宿主细胞(体外、离体或体内)中。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸二者相关的连接分子附接至脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，这些脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类。

适用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MO)获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K实验室(K&K Laboratories)(普莱恩维尤(Plainview)，纽约)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从阿凡提极地脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)(伯明翰(Birmingham)，阿拉巴马州)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质运载体。脂质体可以表征为具有囊泡结构，这些囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。它们是在磷脂悬浮在过量的水性溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology[糖生物学]5:505-10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。

无论用于将外源性核酸引入对宿主细胞中的方法还是以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定以鉴定落入本发明范围内的药剂。

本发明进一步提供了包含编码CAR的核酸分子的载体。在一个方面，可以将CAR载体直接转导到细胞，例如T细胞或NK细胞中。在一个方面，载体是克隆或表达载体，例如，包括但不限于以下的载体：一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环、微型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达CAR构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。在一个方面，哺乳动物NK细胞是人NK细胞。

RNA转染

本文披露了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括一种编码CAR的RNA构建体，该RNA构建体可以直接转染到细胞中。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，然后加入多聚A，以产生通常长度为50-2000个碱基含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和多聚A尾的构建体(SEQ ID NO:35)。这样产生的RNA可以有效地转染不同类型的细胞。在一个方面，模板包括CAR的序列。

在一个方面，抗BCMA CAR由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码抗BCMA CAR的mRNA引入免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)以产生表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)。

在一些实施例中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染的形式引入到细胞。使用聚合酶链反应(PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。可以将来自任何来源的感兴趣的DNA直接通过PCR转化为模板，以使用适当的引物和RNA聚合酶体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所希望模板是本发明的CAR。例如，RNA CAR的模板可以包含含有抗肿瘤抗体的单链可变结构域的细胞外区；铰链区、跨膜结构域(例如，CD8a的跨膜结构域)；以及胞质区，该胞质区包括细胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。

在一些实施例中，待用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一些实施例中，核酸可以包括5'和/或3'非翻译区(UTR)中的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一些实施例中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施例中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人核酸序列。替代性地，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因部分的序列，这些基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。

使用PCR以产生用于体外转录mRNA的模板，该mRNA用于转染。用于进行PCR的方法在本领域中是熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与有待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以将引物设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以将引物设计为扩增通常在细胞中转录的核酸的一部分(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。还可以设计引物以扩增编码特定感兴趣的结构域的核酸的一部分。在一些实施例中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是含有核苷酸区域的引物，这些核苷酸与DNA模板上的位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，该核苷酸区域与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的3'位置。

可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文披露的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。

也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选地具有5'和3'UTR。在一些实施例中，5'UTR的长度在1个与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，这些方法包括但不限于设计与UTR的不同区退火的PCR引物。使用该途径，本领域普通技术人员可以改变所需的5'和3'UTR长度，以在经转录RNA的转染后实现最佳翻译效率。

5'和3'UTR可以是感兴趣的核酸的天然存在的内源性5'和3'UTR。替代性地，可以通过将对感兴趣的核酸不是内源的UTR序列并入到正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加这些UTR序列。使用对感兴趣的核酸是内源的UTR序列可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3'UTR，以基于本领域熟知的UTR的特性来增加经转录的RNA的稳定性。

在一些实施例中，5'UTR可以含有内源性核酸的科扎克(Kozak)序列。替代性地，当如上所述通过PCR添加对感兴趣的核酸不是内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列重新设计共有科扎克序列。科扎克序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA实现高效翻译所需要的。对许多mRNA的科扎克序列的要求在本领域中是已知的。在其他实施例中，5'UTR可以是RNA病毒的5'UTR，该RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施例中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止mRNA的外切核酸酶降解。

为了在无需基因克隆的情况下实现从DNA模板合成RNA，转录启动子应附接到待转录序列上游的DNA模板上。当将发挥RNA聚合酶启动子功能的序列添加至正向引物的5'端时，该RNA聚合酶启动子将并入到PCR产物中位于待转录的开放阅读框上游。在一个优选的实施例中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。

在优选的实施例中，mRNA具有5'端帽和3'多聚(A)尾，它们决定核糖体结合、翻译起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生长的多联产物，该多联产物不适于在真核细胞中表达。转录在3'UTR端线性化的质粒DNA产生正常大小的mRNA，该mRNA即使在转录后进行了多腺苷酸化，在真核转染中也是无效的。

在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.[核酸研究],13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],270:1485-65(2003)。

将多聚A/T伸展段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的多聚A/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费力且耗时，而且通常是不可靠的。这就是为什么非常期望允许在不进行克隆的情况下构建具有多聚A/T 3'伸展段的DNA模板的方法。

转录DNA模板的聚A/T区段可以在PCR期间通过使用含有聚胸腺嘧啶尾(例如100T尾)(SEQ ID NO:31)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:32))的反向引物产生，或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)产生。多聚(A)尾也为RNA提供稳定性并降低其降解。通常，多聚(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一些实施例中，多聚(A)尾在100个和5000个腺苷之间(SEQ ID NO:33)。

在使用多聚(A)聚合酶(如大肠杆菌多聚A聚合酶(E-PAP))进行体外转录后，可以进一步延伸RNA的多聚(A)尾。在一些实施例中，将多聚(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300到400个核苷酸(SEQ ID NO:34)，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，不同化学基团与3'端的附接可以增加mRNA稳定性。这种附接可以含有经修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用多聚(A)聚合酶将ATP类似物并入到多聚(A)尾中。ATP类似物还可以增加RNA的稳定性。

5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施例中，通过本文披露的方法产生的RNA包括5'帽。使用本领域已知的和本文所述的技术获得5'帽(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.[生物化学科学趋势],29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学与生物物理学研究通讯],330:958-966(2005))。

通过本文披露的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，该序列启动与帽无关的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的起始。可以包括适用于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞渗透性和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。

可以使用许多不同方法中的任一种将RNA引入到靶细胞中，这些不同方法例如可商购的方法，包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆的艾玛科萨生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))，(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿的哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛的伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))，Multiporator(德国汉堡的艾本德公司(Eppendort,Hamburg Germany))；阳离子脂质体介导的转染(使用脂质转染)；聚合物包封；肽介导的转染；或生物射弹颗粒递送系统如“基因枪”(参见，例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.[人类基因疗法],12(8):861-70(2001))。

非病毒递送方法

在一些方面，可以使用非病毒方法将编码本文所述CAR的核酸递送至细胞或组织或受试者中。

在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座元件)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中一位置的一条DNA，例如，能够自我复制并将其拷贝插入基因组的一条DNA，或者是可以从较长的核酸中剪接出并插入基因组中的另一个位置的一条DNA。例如，转座子包含由侧接基因的用于转座的反向重复序列构成的DNA序列。

使用转座子的核酸递送的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见例如，Aronovich等人Hum.Mol.Genet.[人类分子遗传学]20.R1(2011):R14-20；Singh等人Cancer Res.[癌症研究]15(2008):2961-2971；Huang等人Mol.Ther.[分子疗法]16(2008):580-589；Grabundzija等人Mol.Ther.[分子疗法]18(2010):1200-1209；Kebriaei等人Blood.[血液学].122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy[分子疗法],16.9(2008):1515-16；Bell等人Nat.Protoc.[自然实验手册]2.12(2007):3153-65；和Ding等人Cell[细胞].122.3(2005):473-83，所有这些文献均通过援引并入本文。

SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶的来源。转座酶可以将转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转移到靶标DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒中切出转座子(包括一个或多个转基因)，并将它插入到宿主细胞的基因组中。参见例如Aronovich等人，见上文。

示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见例如，Grabundzija等人Nucleic AcidsRes.[核酸研究]41.3(2013):1829-47；和Singh等人Cancer Res.[癌症研究]68.8(2008):2961-2971，所有这些文献均通过援引并入本文。示例性的转座酶包括Tc1/海员型转座酶(mariner-type transposase)，例如SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃的转座酶)。参见例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人，所有这些文献均通过援引并入本文。

SBTS的使用允许转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的高效整合和表达。本文提供了产生细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法，该细胞例如使用转座子系统(如，SBTS)稳定地表达本文所述的CAR。

根据本文所述的方法，在一些实施例中，将含有SBTS组分的一种或多种核酸(例如质粒)递送至细胞(例如，T或NK细胞)。例如，通过核酸(例如，质粒DNA)递送的标准方法递送一种或多种核酸，这些标准方法例如本文所述的方法，例如电穿孔、转染或脂质转染。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施例中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)以及编码转座酶的核酸序列的转座子。在其他实施例中，提供了具有两种核酸的系统，例如双质粒系统，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子，而第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共同递送至宿主细胞中。

在一些实施例中，通过使用基因插入(使用SBTS)和基因编辑(使用核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统、或工程化大范围核酸酶重新工程化的归巢内切核酸酶))的组合产生表达本文所述CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞。

在一些实施例中，使用非病毒递送方法允许细胞例如T细胞或NK细胞的重编程，并且将这些细胞直接输注到受试者体内。非病毒载体的优点包括但不限于容易且相对低成本地产生满足患者群体所需的足够量、储存期间的稳定性和缺乏免疫原性。

细胞的来源

在扩增和遗传修饰之前，细胞(例如，免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞))的来源从受试者获得。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因物种。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、和肿瘤。

在本发明的某些方面，可以使用本领域可获得的任意数量的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)系。在本发明的某些方面，可以从来自受试者收集的血液单位(使用本领域技术人员已知的任意数量的技术(如Ficoll

在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。替代性地，可以除去单采血液成分术样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。

应当认识到，本申请的方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Ex vivoexpansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。

在一个方面，通过裂解红细胞和耗减单核细胞(例如，通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流离心淘洗)从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和CD45RO+T细胞。例如，在一个方面，通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合珠(如

可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标记的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。在某些方面，可能希望富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、和FoxP3+的调节T细胞。替代性地，在某些方面，T调节细胞被抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法耗减。

本文描述的方法可以包括，例如使用例如(例如本文描述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，该亚群是T调节细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节耗减的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。

在一些实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2从该群除去T调节细胞(例如CD25+T细胞)。在一些实施例中，将抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合，或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一些实施例中，将抗CD25抗体或其片段与如本文描述的底物缀合。

在一些实施例中，使用来自Miltenyi

在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6×10

在一些实施例中，使用具有耗减管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从该群除去T调节细胞(例如CD25+细胞)。在一些实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。

不希望受特定理论的束缚，在单采血液成分术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如T

在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前减少例如，耗减)T

在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少T

在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。

在一些实施例中，有待除去的细胞群体既不是调控T细胞或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞)。在一些实施例中，设想将此类细胞与调控T细胞和/或肿瘤细胞并行除去，或者在所述耗减之后，或以另一种顺序除去。

本文描述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。

本文描述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体除去细胞，从而提供T调节耗减的(例如CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体，该细胞群体适于表达CAR(例如本文描述的CAR)。在一些实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与T调节例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。

还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如本文描述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节耗减的(例如CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)群。示例性检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ。在实施例中，检查点抑制剂是PD1或PD-L1。在一些实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与T调节例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节细胞(例如CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。

在一些实施例中，可以选择表达以下中的一者或多者的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如其他细胞因子)。筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号WO 2013/126712中描述的方法来确定。

为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用10、15、20、25、30、35、40、45、或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95、或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。

在相关方面，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面的混合物(例如颗粒(如珠))，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个方面，所用细胞的浓度为5×10e6/ml。在其他方面，使用的浓度可以是约1×10

在其他方面，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中去除粒细胞及在一定程度上去除单核细胞提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。

在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所描述进行解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法活化之前在室温静置1小时。

在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞(如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞)，以便稍后用于细胞疗法(例如，T细胞疗法)，用于将受益于细胞疗法(例如，T细胞疗法)的任何数量的疾病或病症，如本文所述的那些。在一个方面，血液样品或单采血液成分术取自基本健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采血液成分术取自基本健康的受试者，该受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将感兴趣的细胞分离并冷冻供以后使用。在某些方面，可以扩增、冷冻免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并在随后的时间里使用。在某些方面，在诊断如本文描述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另一个方面，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分术分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。

在本发明的另一个方面，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改善的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在该恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病状，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口。例证性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。

在一些实施例中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞获自已接受低免疫增强剂量的mTOR抑制剂的受试者。在一个实施例中，在足够的时间后(或在足够剂量的低免疫增强剂量的mTOR抑制剂后)收获被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群，使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的水平，或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率已经至少是短暂的增加了。

在其他实施例中，已经被或将被工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞)的群可以通过接触一定量的mTOR抑制剂离体进行处理，该mTOR抑制剂增加PD1阴性免疫效应子细胞(例如T细胞)的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率。

在一些实施例中，T细胞群体是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防DGK表达。替代性地，可以通过用本文描述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。

在一些实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。替代性地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。

在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros，或者具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文描述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。

在一个实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。

同种异体CAR

在本文描述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，该细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。

缺乏功能性TCR的T细胞可以例如被工程化以使其在其表面上不表达任何功能性TCR、工程化使得其不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基(例如，工程化使得其不表达(或表现出降低的表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)、或工程化以使其在其表面上产生非常少的功能性TCR。替代性地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式表达严重受损的TCR。术语“严重受损的TCR”意指该TCR将不在宿主中引发不利的免疫反应。

本文描述的T细胞可以例如被工程化，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，可以工程化本文描述的T细胞，使得其细胞表面HLA(例如HLA 1类和/或HLA II类)表达被下调。在一些方面，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现HLA的下调。在一些实施例中，T细胞可能缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLA II类。

缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何适合的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。

在一些实施例中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如通过本文所述的任何方法工程化的细胞。例如，该细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，该抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用例如如本文描述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。

抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA

在一些实施例中，在细胞(例如，T细胞)中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFRβ)来抑制TCR表达和/或HLA表达。

siRNA和shRNA在T细胞中的表达可以使用任何常规表达系统(例如像慢病毒表达系统)来实现。

下调TCR的组分的表达的示例性shRNA描述于例如美国公开号:2012/0321667中。下调HLA I类和/或HLA II类基因表达的示例性siRNA和shRNA描述于例如美国公开号：US2007/0036773中。

抑制TCR或HLA的CRISPR

如本文所用，“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组规律间隔成簇短回文重复序列，或包含这组重复序列的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指源自CRISPR和Cas的系统，该系统可以用于沉默或突变TCR和/或HLA基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFRβ)。

在大约40％的测序的真细菌基因组和90％的测序的古细菌中发现了天然存在的CRISPR/Cas系统。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]8:172。此系统是赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式的原核免疫系统。Barrangou等人(2007)Science[科学]315:1709-1712；Marragini等人(2008)Science[科学]322:1843-1845。

已经修饰CRISPR/Cas系统用于真核生物(如小鼠或灵长类动物)的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature[自然]482:331-8。这是通过向真核细胞中引入含有特异设计的CRISPR和一种或多种适当的Cas的质粒来实现的。

CRISPR序列(有时称为CRISPR基因座)包含可替代的重复序列和间隔子。在天然存在的CRISPR中，间隔子通常包含对于细菌而言外来的序列，如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLA CRISPR/Cas系统中，间隔子衍生自TCR或HLA基因序列。

来自CRISPR基因座的RNA是组成型表达的并由Cas蛋白加工成小RNA。这些包含由重复序列侧接的间隔子。RNA指导其他Cas蛋白在RNA或DNA水平沉默外源性遗传元件。Horvath等人(2010)Science[科学]327:167-170；Makarova等人(2006)Biology Direct[生物学快讯]1:7。因此，类似于siRNA，间隔子充当RNA分子的模板。Pennisi(2013)Science[科学]341:833-836。

由于这些天然存在于许多不同类型的细菌中，因此CRISPR的确切排列，和Cas基因的结构、功能和数量及其产物在物种之间略有不同。Haft等人(2005)PLoS Comput.Biol.[公共科学图书馆医学杂志第一版]1:e60；Kunin等人(2007)Genome Biol.[基因组生物学]8:R61；Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]60:174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:653-663；和Stern等人(2010)Trends.Genet.[遗传学趋势]28:335-340。例如，Cse(Cas亚型，大肠杆菌)蛋白质(例如，CasA)形成功能性复合物Cascade，其将CRISPR RNA转录物处理成保留Cascade的间隔子重复单元。Brouns等人(2008)Science[科学]321:960-964。在其他原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体失活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1或Cas2。强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和其他原核生物中的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白形成具有小CRISPR RNA的功能性复合物，其识别和切割互补的靶RNA。更简单的CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，其是具有两个活性切割位点的核酸酶，各自对应用于双螺旋的每条链。将Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA组合可用于基因编辑系统。Pennisi(2013)Science[科学]341:833-836。

因此，CRISPR/Cas系统可用于编辑TCR和/或HLA基因(添加或删除碱基对)，或引入提前终止，该提前终止从而降低TCR和/或HLA的表达。替代性地，可以像RNA干扰一样使用CRISPR/Cas系统，以可逆的方式关闭TCR和/或HLA基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白引导至TCR和/或HLA启动子，空间上阻断RNA聚合酶。

可以使用本领域已知的技术来产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统，例如美国专利公开号20140068797和Cong(2013)Science[科学]339:819-823中所述的技术。还可以产生本领域已知的其他人工CRISPR/Cas系统，其抑制TCR和/或HLA，例如描述于以下：Tsai(2014)Nature Biotechnol.[自然生物技术],32:6 569-576,美国专利号：8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945、和8,697,359。

抑制TCR和/或HLA的TALEN

“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化因子样效应核酸酶，即可以用于编辑HLA和/或TCR基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFRβ)的人工核酸酶。

通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割域进行融合来人工产生TALEN。可以工程化转录活化因子样作用(TALE)以结合任何所希望的DNA序列，包括HLA或TCR基因的部分。通过将工程化的TALE与DNA切割域组合，可以产生对任何所希望的DNA序列(包括HLA或TCR序列)特异的限制酶。然后可以将这些引入细胞中，其中它们可以用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:135-6；和Boch等人(2009)Science[科学]326:1509-12；Moscou等人(2009)Science[科学]326:3501。

TALE是由黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列，但第12和第13氨基酸除外。这两个位置高度变化，显示出与特定核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以被工程化以结合所希望的DNA序列。

为了产生TALEN，将TALE蛋白质与核酸酶(N)融合，该核酸酶是野生型或突变的FokI内切核酸酶。针对其在TALEN中的用途已经对FokI作出若干突变；这些例如，改进切割特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.[核酸研究]39:e82；Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:731-734；Wood等人(2011)Science[科学]333:307；Doyon等人(2010)Nature Methods[自然方法]8:74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.[自然生物技术]25:786-793；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]200:96。

FokI结构域作为二聚体起作用，这需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当方向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI切割域之间的氨基酸残基的数量和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8。

可以使用HLA或TCR TALEN在细胞内产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源末端连接不正确地修复断裂，则可以在断裂位点引入突变。例如，不正确的修复可以引入移码突变。替代性地，可以将外来DNA与TALEN一起引入到细胞中；取决于外来DNA的序列和染色体序列，此过程可以用于校正HLA或TCR基因中的缺陷或将此类缺陷引入wt HLA或TCR基因中，从而降低HLA或TCR的表达。

可以使用本领域已知的任何方法构建对HLA或TCR中的序列特异的TALEN，这些方法包括使用模块组分的各种方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE[公共科学图书馆综合]6:e19509。

抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶

“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，即可以用于编辑HLA和/或TCR基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFRβ)的人工核酸酶。

像TALEN一样，ZFN包含与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶域(或它的衍生物)。就ZFN而言，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。Carroll等人(2011)Genetics Society ofAmerica[美国遗传学学会]188:773-782；和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:1156-1160。

锌指是被一种或多种锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可包含例如Cys2His2，并且可识别大约3-bp序列。可以将已知特异性的各种锌指组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统、以及哺乳动物细胞。

像TALEN一样，ZFN必须二聚化以切割DNA。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须与DNA的相反链结合，其中它们的核酸酶适当地间隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:10570-5。

也像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果不正确地修复则可以产生移码突变，这导致细胞中HLA和/或TCR的表达和量的减少。ZFN还可以与同源重组一起使用以在HLA或TCR基因中产生突变。

可以使用本领域已知的任何方法构建对HLA和/或TCR中的序列特异性的ZFN。参见例如，Provasi(2011)Nature Med.[自然医学]18:807-815；Torikai(2013)Blood[血液]122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.[分子疗法]16:1200-7；Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230。

端粒酶表达

尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施例中，免疫效应细胞(例如T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本披露内容提供了产生表达CAR的细胞的方法，该方法包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与该核酸接触。

在一个方面，本披露内容的特点在于制备免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)群的方法。在一个实施例中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)群，使免疫效应细胞群与编码CAR的核酸接触；以及在允许CAR和端粒酶表达的条件下，使免疫效应细胞群与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。

在一个实施例中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施例中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。

在一个实施例中，hTERT具有GenBank蛋白ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[推定的人端粒酶催化亚基基因hEST2在肿瘤细胞中且在永生化期间上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)如下：

在一个实施例中，hTERT具有与SEQ ID NO:284的序列至少80％、85％、90％、95％、96^、97％、98％、或99％相同的序列。在一个实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:284的序列。在一个实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含缺失(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。在一个实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含转基因氨基酸序列(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。

T细胞的活化和扩增

T细胞通常可以使用例如美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041、和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法来活化和扩增。

通常，本发明的T细胞可以通过与表面接触而扩增，该表面与刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体附接。具体地，可以如本文所描述刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以使用抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司(Diaclone,

在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。替代性地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一个方面，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级活化信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些方面，两种药剂都可以在溶液中。在一个方面，这些试剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于活化和扩增本发明中的T细胞。

在一个方面，将两种药剂固定在珠上，或者在同一珠上，即“顺式”，或者在分离的珠上，即“反式”。通过举例，提供初级活化信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一个方面，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定方面，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定方面，使用与珠结合的抗体的1:100CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:75CD3:CD28比率。在另一个方面，使用与珠结合的抗体的1:50CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:30CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用与珠结合的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在又一个方面，使用与珠结合的抗体的3:1CD3:CD28比率。

颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些方面范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率和在另外的方面包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个优选的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一个方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一个特定方面，优选的颗粒:细胞的比率为1:5。在另外的方面，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一个方面，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外颗粒在之后每天或每隔一天加入到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一个方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，各种其他比率可适用于本发明。具体地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一个方面，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。

在本发明的另外的方面，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将珠和细胞分离，并且然后培养细胞。在可替代方面，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在另一个方面，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。

通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28附着的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，10

在一些实施例中，例如通过本文描述的方法扩增用编码CAR(例如本文描述的CAR)的核酸转导的细胞。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如7、6或5天)的一段时间。在一些实施例中，将细胞(例如，本文所述的BCMA CAR细胞)在培养物中扩增5天，所得的细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、或其组合。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的BCMA CAR细胞)显示出抗原刺激后在细胞倍增方面增加至少一倍、两倍、三倍或四倍。在一些实施例中，使细胞(例如，本文所述的表达BCMA CAR的细胞)在培养物中扩增5天，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得的细胞表现出更高的促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如，本文所述的BCMA CAR的细胞)显示出促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml计增加至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍。

在本发明的一个方面，可以将混合物培养若干个小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在一个方面，可以将混合物培养21天。在本发明的一个方面，将珠和T细胞一起培养约八天。在一个方面，将珠和T细胞一起培养2-3天。还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，Minimal Essential Media或RPMI Media 1640或X-vivo 15，(龙沙公司(Lonza)))，该培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、优化剂，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如空气加5％CO

在一些实施例中，使细胞在包括一种或多种白介素的适当介质(例如本文描述的介质)中扩增，该白介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如通过本文描述的方法(如流式细胞术)测量。在一些实施例中，细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)的存在下扩增。

在实施例中，本文描述的方法(例如表达CAR的细胞制造方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体IL-2从细胞群体除去T调节细胞(例如CD25+T细胞)。本文描述了从细胞群体除去T调节细胞(例如CD25+T细胞)的方法。在实施例中，这些方法(例如制造方法)进一步包括使细胞群体(例如其中T调节细胞(如CD25+T细胞)已耗减的细胞群体；或先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体的细胞群体)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群体(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。

在一些实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。

在一些实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文描述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一些实施例中，该接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+T细胞)的存活和增殖。

已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群体(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性子集，则将该子集扩增到更大程度可能是有益的。

此外，在细胞扩增过程中，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。

一旦构建BCMA CAR，即可以使用各种测定法来评估分子的活性，如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞，在不存在再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。评估BCMA CAR效果的测定法在下面进一步详细描述

原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。非常简单地，表达CAR的T细胞(CD4

可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR

还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR

动物模型也可用于测量CART活性。例如，可以使用利用人BCMA特异性CAR

先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如在Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中。简而言之，通过将洗涤的T细胞与表达BCMA的K562细胞混合来在微量滴定板中进行CAR介导的增殖的评估，或在使用前用γ辐射照射其他表达BCMA的骨髓瘤细胞。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至具有KT32-BBL细胞的培养基以用作用于刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8

可通过标准51Cr释放测定来评估细胞毒性。参见例如，Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在37℃下将51Cr(作为NaCrO4，马萨诸塞州波士顿的新英格兰核公司(New England Nuclear,Boston,MA))加入靶细胞(例如，表达BCMA的K562细胞系和原代多发性骨髓瘤细胞)2小时，频繁搅拌，在完全RPMI中洗涤两次，并接种至微量滴定板中。将效应T细胞与完全RPMI的孔中的靶细胞以不同比率的效应细胞:靶细胞(E:T)混合。还制备了仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X 100洗涤剂溶液(总释放，TR)的另外的孔。在37℃孵育4小时后，收获来自每个孔的上清液。然后使用γ颗粒计数器(帕卡德仪器公司(Packard Instrument Co.)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)测量释放的51Cr。每种条件进行至少一式三份，并且使用下式计算裂解百分比：％裂解＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER代表每种实验条件释放的平均51Cr。

成像技术可用于评估荷肿瘤的动物模型中CAR的特定运输和增殖。例如，Barrett等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]22:1575-1586(2011)中已经描述了此类测定。简而言之，给NOD/SCID/γc

替代性地，或者与本文披露的方法组合的，披露了用于以下的一种或多种的方法和组合物：表达CAR的细胞的检测和/或定量(例如，体外或体内(例如，临床监测))；免疫细胞扩增和/或活化；和/或涉及使用CAR配体的CAR特异性选择。在一个示例性实施例中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或与细胞外结合结构域的恒定区结合的抗体。在其他实施例中，CAR配体是CAR抗原分子(例如，如本文所述的CAR抗原分子)。

在一个方面，披露了用于检测和/或定量表达CAR的细胞的方法。例如，CAR配体可用于体外或体内检测和/或定量表达CAR的细胞(例如，临床监测患者中的表达CAR的细胞，或给患者给药)。该方法包括：

提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包含标签、珠、放射性或荧光标记的CAR配体)；

获得表达CAR的细胞(例如，获得含有表达CAR的细胞的样品，如制造样品或临床样品)；

在发生结合的条件下使表达CAR的细胞与CAR配体接触，从而检测存在的表达CAR的细胞的水平(例如，量)。可以使用标准技术如FACS、ELISA等检测表达CAR的细胞与CAR配体的结合。

在另一个方面，披露了扩增和/或活化细胞(例如，免疫效应细胞)的方法。该方法包括：

提供表达CAR的细胞(例如，表达第一CAR的细胞或瞬时表达CAR的细胞)；

在发生免疫细胞扩增和/或增殖的条件下，使所述表达CAR的细胞与CAR配体(例如，如本文所述的CAR配体)接触，从而产生活化的和/或扩增的细胞群。

在某些实施例中，CAR配体存在于(例如，固定或附接至)底物(例如非天然存在的底物)上。在一些实施例中，底物是非细胞底物。非细胞底物可以是选自例如板(例如微量滴定板)、膜(例如硝酸纤维素膜)、基质、芯片或珠的固体支持物。在实施例中，CAR配体存在于底物中(例如，在底物表面上)。CAR配体可以与底物共价或非共价(例如，交联)固定、附接、或缔合。在一些实施例中，CAR配体与珠附接(例如，共价附接)。在前述实施例中，免疫细胞群可以在体外或离体扩增。该方法可以进一步包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞的群，例如，使用本文所述的任何方法。

在其他实施例中，扩增和/或活化细胞的方法还包括添加第二刺激分子，例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可以固定在底物(例如一个或多个珠)上，从而提供增加的细胞扩增和/或活化。

在另一个方面，提供了用于选择或富集表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；以及根据CAR配体的结合选择细胞。

在其他实施例中，提供了用于消耗、减少和/或杀伤表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与如本文所述的CAR配体接触；并且基于CAR配体的结合靶向细胞，从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀伤表达CAR的细胞。在一些实施例中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融药物)偶联。在另一个实施例中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。

可用于本文披露的方法的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody to DetectCD19-Specific T cells in Clinical Trials[嵌合抗原受体(CAR)特异性单克隆抗体检测临床试验中CD19特异性T细胞]”,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838中，该文献的内容通过援引并入。在一些实施例中，抗独特型抗体分子识别抗CD19抗体分子，例如抗CD19 scFv。例如，抗独特型抗体分子可以竞争与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1的结合(描述于Jena等人,PLOS[公共科学图书馆综合]2013年3月8:3e57838)；可以与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1具有相同的CDR(例如，使用卡巴特定义、乔西亚定义、或卡巴特和乔西亚定义的组合，VH CDR1，VH CDR2，CH CDR3，VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3中的一个或多个)；可以与CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1具有一个或多个(例如，2个)可变区，或可包含CD19特异性CAR mAb克隆号136.20.1。在一些实施例中，根据Jena等人所述的方法制备抗独特型抗体。在另一个实施例中，独特型抗体分子是WO 2014/190273中所述的抗独特型抗体分子。在一些实施例中，抗独特型抗体分子与WO 2014/190273的抗体分子(如，136.20.1)具有相同的CDR(例如，VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的一个或多个，例如全部)；可以具有WO 2014/190273的抗体分子的一个或多个(例如，2个)可变区，或者可以包含WO 2014/190273的抗体分子(如136.20.1)。在其他实施例中，抗CAR抗体结合例如如WO 2014/190273中描述的CAR分子的细胞外结合结构域的恒定区。在一些实施例中，抗CAR抗体结合CAR分子的细胞外结合结构域的恒定区，例如重链恒定区(例如，CH2-CH3铰链区)或轻链恒定区。例如，在一些实施例中，抗CAR抗体竞争与WO 2014/190273中描述的2D3单克隆抗体的结合，该抗CAR抗体与如WO 2014/190273中描述的2D3具有相同的CDR(例如，VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的一个或多个，例如全部)，或具有2D3的一个或多个(例如，2个)可变区，或包含2D3。

在一些方面和实施例中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群进行了优化，例如，如2014年7月31日提交的美国序列号62/031,699中所述，该专利的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，与对照T细胞(例如，表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8

在一些实施例中，CD4

在一个方面，本文描述了治疗受试者(例如患有癌症的受试者)的方法。该方法包括向所述受试者施用有效量的：

1)包含CAR的CD4

该CAR包含：

抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域，例如靶向BCMA的抗原结合结构域，例如表2、表6或表10的抗原结合结构域；

跨膜结构域；以及

细胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如ICOS域；以及

2)包含CAR的CD8

抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域，例如靶向BCMA的抗原结合结构域，例如表2、表6或表10的抗原结合结构域；

跨膜结构域；以及

细胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，例如4-1BB域、CD28域、或除ICOS域之外的另一种共刺激结构域；

其中CAR

任选地，该方法进一步包括施用：

3)包含CAR的第二CD8+T细胞(第二CAR

抗原结合结构域，例如本文所述的抗原结合结构域，例如特异性结合BCMA的抗原结合结构域，例如表2、表6或表10的抗原结合结构域；

跨膜结构域；以及

细胞内信号传导结构域，其中第二CAR

其他测定法(包括本文实例部分中描述的那些测定法以及本领域已知的那些测定法)也可用于评估本发明的BCMA CAR构建体。

治疗应用

BCMA相关疾病和/或障碍

在一个方面，本发明提供治疗与BCMA表达相关的疾病的方法。在一个方面，本发明提供治疗疾病的方法，其中部分肿瘤对BCMA呈阴性，部分肿瘤对BCMA呈阳性。例如，本发明的CAR可用于治疗已经历与BCMA表达升高相关的疾病的治疗的受试者，其中已经历BCMA水平升高的治疗的受试者表现出与BCMA水平升高相关的疾病。在实施例中，本发明的CAR可用于治疗已经历与BCMA表达相关的疾病的治疗的受试者，其中已经历与BCMA表达相关的治疗的受试者表现出与BCMA表达相关的疾病。

在一些实施例中，本发明提供治疗疾病的方法，其中BCMA在正常细胞和癌细胞上表达，但在正常细胞上以较低水平表达。在一些实施例中，该方法还包括选择以这样的亲和力结合的本发明的CAR：该亲和力允许BCMA CAR结合并杀伤表达BCMA的癌细胞，但小于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的表达BCMA的正常细胞被杀伤，例如如通过本文所述的测定法所确定。例如，可以使用杀伤测定法，如基于Cr51CTL的流式细胞术。在一些实施例中，BCMA CAR具有抗原结合结构域，该抗原结合结构域对于靶抗原具有10

在一个方面，本发明涉及包含BCMA CAR的载体，该BCMA CAR可操作地连接至启动子，用于在哺乳动物免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)中表达。在一个方面，本发明提供表达BCMA CAR的重组免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，用于治疗表达BCMA的肿瘤，其中表达BCMA CAR的重组免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)被称为表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)。在一个方面，本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)能够使肿瘤细胞接触其表面上表达的本发明的至少一种BCMA CAR，以使得表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)靶向肿瘤细胞并抑制肿瘤的生长。

在一个方面，本发明涉及抑制表达BCMA的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括使肿瘤细胞接触本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)，以使得表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)响应于抗原而活化并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长受到抑制。

在一个方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。该方法包括将本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)施用于受试者，从而治疗受试者中的癌症。可以通过本发明的表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)治疗的癌症的实例是与BCMA表达相关的癌症。

本发明包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)输注给有此需要的受体。输注的细胞能够杀伤受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)能够在体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。在各个方面，在将细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于患者之后，施用于患者或其后代的细胞(例如，T细胞或NK细胞)在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

本发明还包括一种类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)经修饰(例如，通过体外转录的RNA)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)输注给有此需要的受体。输注的细胞能够杀伤受体中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在将免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于患者之后，施用于患者的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)存在少于一个月，例如三周、两周、一周。

不希望受任何特定理论的束缚，CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答，或者可以是由于直接与间接免疫应答。在一个方面，CAR转导的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)表现出响应于表达BCMA的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和有效的细胞溶解活性，抵抗可溶性BCMA抑制，介导旁杀伤和介导已建立的人类肿瘤的消退。例如，在表达BCMA的肿瘤的异质区域内的无抗原肿瘤细胞可能易受BCMA重定向免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的间接破坏，该BCMA重定向免疫效应细胞先前已经与邻近的抗原阳性癌细胞发生反应。

在一个方面，本发明的完全人CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以是用于哺乳动物离体免疫和/或体内治疗的一类疫苗。在一个方面，哺乳动物是人。

关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物中之前，在体外进行以下中的至少一者：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。

离体程序是本领域熟知的，并在下文更全面地讨论。简而言之，从哺乳动物(例如，人)分离细胞，并用表达本文披露的CAR的载体进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用于哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR修饰的细胞可以相对于受体是自体的。替代性地，相对于受体，细胞可以是同种异体的、同基因的或异种异体的。

造血干细胞和祖细胞的离体扩增程序描述于美国专利号5,199,942(通过援引并入本文)中，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于离体扩增细胞的任何具体方法。简而言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物收集来自外周血收获物或骨髓外植体的CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增此类细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可以用于培养和扩增细胞。

除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供了用于体内免疫以引发针对患者中的抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常，如本文描述活化和扩增的细胞可以用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。具体而言，本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)用于治疗与BCMA表达相关的疾病、障碍和病症。在某些方面，本发明的细胞用于治疗处于患上与BCMA表达相关的疾病、障碍和病症风险的患者。因此，本发明提供了治疗或预防与BCMA表达相关的疾病、障碍和病症的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于有此需要的受试者。

在一个方面，本发明的表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)可用于治疗增殖性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或者癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期。在一个方面，癌症是血癌。血液癌病状是癌症的类型，如白血病和影响血液、骨髓和淋巴系统的恶性淋巴组织增生症。在一个方面，血液癌是白血病或血癌。与BCMA相关的疾病或障碍的实例是多发性骨髓瘤(也称为MM)(参见Claudio等人,Blood.[血液]2002,100(6):2175-86；和Novak等人,Blood.[血液]2004,103(2):689-94)。多发性骨髓瘤，也称为浆细胞骨髓瘤或卡勒氏(Kahler)病，是以骨髓中异常或恶性血浆B细胞积聚为特征的癌症。通常，癌细胞侵入邻近的骨骼，破坏骨骼结构并导致骨痛和骨折。大多数骨髓瘤病例的特征还在于副蛋白(也称为M蛋白或骨髓瘤蛋白)的产生，该副蛋白是恶性浆细胞的克隆增殖过量而产生的异常免疫球蛋白。根据国际骨髓瘤工作组(International MyelomaWorking Group,IMWG)的诊断标准，血清副蛋白水平超过30g/L即诊断为多发性骨髓瘤(参见Kyle等人,(2009),Leukemia.[白血病]23:3-9)。多发性骨髓瘤的其他症状或体征包括肾功能减退或肾功能衰竭、骨病变、贫血、高钙血症和神经症状。

国际骨髓瘤工作组已经确定了区分多发性骨髓瘤与其他浆细胞增殖性障碍的标准(参见Kyle等人,(2009),Leukemia.[白血病]23:3-9)。必须满足以下所有三个标准：

-克隆骨髓浆细胞≥10％

-存在血清和/或尿单克隆蛋白(除真正的非分泌性多发性骨髓瘤患者之外)

-可归因于潜在浆细胞增殖性障碍的终末器官损害的证据，具体为：

о高钙血症：血清钙≥11.5mg/100ml

о肾功能不足：血清肌酸酐>1.73mmol/l

о贫血：正常色素性正常红细胞贫血，血红蛋白值>2g/100ml，低于正常下限，或血红蛋白值<10g/100ml

о骨病变：溶骨性病变、严重骨质减少或病理性骨折。

可以通过本文所述的组合物和方法治疗的其他浆细胞增殖性障碍包括但不限于无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。

将两种分期系统用于进行多发性骨髓瘤的分期：国际分期系统(ISS)(参见Greipp等人,(2005),J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]23(15):3412-3420)和迪里-萨蒙(Durie-Salmon)分期系统(DSS)(参见Durie等人,(1975),Cancer[癌症]36(3):842-854)。这两种分期系统汇总于下表中：

表15.用于多发性骨髓瘤分期的分期系统

*迪里-萨蒙分期系统还包括指定肾功能状态的亚分类。在分期编号后加上“A”或“B”的名称，其中“A”表示肾功能相对正常(血清肌酸酐值<2.0mg/dL)，B表示肾功能异常(血清肌酸酐值>2.0mg/dL)。

多发性骨髓瘤的第三个分期系统称为修订的国际分期系统(R-ISS)(参见PalumboA,Avet-Loiseau H,Oliva S等人,Journal of clinical oncology:official journal ofthe American Society of Clinical Oncology[年美国临床肿瘤学会官方杂志]2015；33:2863-9，通过引用以其整体并入本文)。R-ISS I期包括ISS I期(血清β2-微球蛋白水平<3.5mg/L，血清白蛋白水平≥3.5g/dL)，无高风险CA[del(17p)和/或t(4；14)和/或t(14；16)]和正常LDH水平(小于正常范围的上限)。R-ISS III期包括ISS III期(血清β2-微球蛋白水平>5.5mg/L)和高风险CA或高LDH水平。R-ISS II期包括所有其他可能的组合。

如Kumar S，Paiva B，Anderson KC等人,International Myeloma Working Groupconsensus criteria for response and minimal residual disease assessment inmultiple myeloma[国际骨髓瘤工作组多发性骨髓瘤的反应和最小残留疾病评估的共识标准].The Lancet Oncology[柳叶刀肿瘤学]；17(8):e328-e346所披露，可以根据IMWG 2016标准来确定患者的反应，该文献通过援引以其全文并入本文。表16提供了IMWG 2016反应评估标准。

表16.IMWG反应评估标准(包括最小残留病(MRD)标准)

多发性骨髓瘤和相关疾病的标准治疗包括化疗、干细胞移植(自体或同种异体)、放疗和其他药物疗法。经常使用的抗骨髓瘤药物包括烷基化剂(例如，苯达莫司汀、环磷酰胺和美法仑(melphalan))、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))、皮质类固醇(例如，地塞米松和泼尼松)和免疫调节剂(例如，沙利度胺(thalidomide)和来那度胺或

与BCMA相关的疾病或病症的另一个实例是霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(参见Chiu等人,Blood.[血液]2007,109(2):729-39；He等人,J Immunol.[免疫学杂志]2004,172(5):3268-79)。

霍奇金淋巴瘤(HL)也称为霍奇金病，是起源于白细胞或淋巴细胞的淋巴系统癌症。构成淋巴瘤的异常细胞称为里德-斯德伯格(Reed-Sternberg)细胞。在霍奇金淋巴瘤中，癌症从一个淋巴结组扩散到另一个淋巴结组。根据里德-斯德伯格细胞形态和里德-斯德伯格细胞周围的细胞组成(通过淋巴结活检确定)，霍奇金氏淋巴瘤可细分为四种病理亚型：结节性硬化HL、混合细胞亚型、淋巴细胞富集或淋巴细胞优势、淋巴细胞耗减。一些霍奇金淋巴瘤也可以是结节性淋巴细胞优势型霍奇金淋巴瘤，或者可以是未指明的。霍奇金淋巴瘤的症状和体征包括颈部、腋窝或腹股沟的淋巴结无痛性肿胀、发烧、盗汗、体重减轻、疲劳、瘙痒或腹痛。

非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括多种血癌，血癌包括除霍奇金淋巴瘤之外的任何类型的淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤的亚型主要通过细胞形态学、染色体畸变和表面标志物来分类。NHL亚型(或NHL相关癌症)包括B细胞淋巴瘤，如但不限于伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病(B-PLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，血管内大B细胞淋巴瘤和原发性纵隔B细胞淋巴瘤)、滤泡性淋巴瘤(例如，滤泡中心淋巴瘤、滤泡小裂细胞)、毛细胞白血病、高级B细胞淋巴瘤(伯基特样)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(例如，结外边缘区B细胞淋巴瘤或粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区B细胞淋巴瘤)、浆细胞瘤/骨髓瘤、前体B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤(PB-LBL/L)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；和T细胞淋巴瘤，如但不限于间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(例如，冒烟型、慢性、急性和淋巴瘤性)、血管中心性淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(例如，蕈样肉芽肿、塞扎里(Sezary)综合征等)、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤(鼻型)、肠病型肠T细胞淋巴瘤、大颗粒淋巴细胞白血病、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病(T-LBL/L)、T细胞慢性淋巴细胞白血病/幼淋巴细胞性白血病(T-CLL/PLL)、和未指明的外周T细胞淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤的症状和体征包括颈部、腋窝或腹股沟的淋巴结无痛性肿胀、发烧、盗汗、体重减轻、疲劳、瘙痒、腹痛、咳嗽或胸痛。

霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的分期是相同的，是指体内癌细胞的扩散程度。在I期中，淋巴瘤细胞位于一个淋巴结组中。在II期中，淋巴瘤细胞存在于至少两个淋巴结组中，但两组均位于膈肌的同一侧，或组织或器官的一部分以及膈肌的同一侧的器官附近的淋巴结。在III期中，淋巴瘤细胞位于隔膜两侧的淋巴结中，或这些淋巴结组附近或脾脏中的组织或器官的一部分。在IV期中，淋巴瘤细胞存在于至少一个器官或组织的几个部分，或淋巴瘤细胞位于器官中和隔膜的另一侧的淋巴结中。除罗马数字分期名称之外，分期也可以用字母A、B、E和S来描述，其中A是指无症状的患者，B是指有症状的患者，E是指其中淋巴瘤存在于淋巴系统外的组织中的患者，S是指其中淋巴瘤存在于脾脏中的患者。

霍奇金淋巴瘤通常用放疗、化疗或造血干细胞移植来治疗。非霍奇金淋巴瘤最常见的治疗方法是R-CHOP，它由四种不同的化疗药物(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙)和利妥昔单抗

BCMA表达也与瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)(也称为淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL))相关联。(参见Elsawa等人,Blood.[血液]2006,107(7):2882-8)。瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症以前被认为与多发性骨髓瘤相关联，但最近被归类为非霍奇金淋巴瘤的亚型。WM的特征在于不受控制的B细胞淋巴细胞增殖，导致贫血并产生过量的副蛋白或免疫球蛋白M(IgM)，该副蛋白使血液变稠并导致高粘滞综合征。WM的其他症状或体征包括发烧、盗汗、疲劳、贫血、体重减轻、淋巴结病变或脾肿大、视力模糊、头晕、鼻出血、牙龈出血、不常见的瘀伤、肾功能损伤或衰竭、淀粉样变性或周围神经病变。

WM的标准治疗包括化疗，特别是利妥昔单抗

与BCMA相关的疾病或病症的另一个实例是脑癌。具体而言，BCMA的表达与星形细胞瘤或胶质母细胞瘤有关(参见Deshayes等人,Oncogene.[癌基因]2004,23(17):3005-12,Pelekanou等人.,PLoS One.[公共科学图书馆：综合]2013,8(12):e83250)。星形细胞瘤是由星形胶质细胞产生的肿瘤，星形胶质细胞是脑中的一种神经胶质细胞类型。胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤或GBM)是星形细胞瘤的最恶性形式，并且被认为是脑癌的最晚期(IV期)。胶质母细胞瘤有两种变体：巨细胞胶质母细胞瘤和神经胶质肉瘤。其他星形细胞瘤包括幼年毛细胞星形细胞瘤(JPA)、纤维性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤(PXA)、胚胎发育不良性神经上皮瘤(DNET)和退行性星形细胞瘤(AA)。

与胶质母细胞瘤或星形细胞瘤相关的症状或体征包括脑部压力增加、头痛、癫痫发作、记忆丧失、行为改变、身体一侧运动或感觉丧失、语言功能障碍、认知缺损、视力缺损、恶心、呕吐以及手臂或腿部虚弱。

手术移除肿瘤(或切除)是尽可能多地除去神经胶质瘤而不损伤或对正常周围脑损伤最小的标准治疗。通常在手术后使用放疗和/或化疗来抑制和减缓来自任何其余癌细胞或卫星病灶的复发疾病。放射治疗包括全脑放疗(常规体外束辐射)、靶向三维适形放射治疗和靶向放射性核素。通常用于治疗胶质母细胞瘤的化疗剂包括替莫唑胺(temozolomide)、吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)和顺铂。血管生成抑制剂(如贝伐单抗(Bevacizumab)

支持性治疗经常也用于缓解神经症状和改善神经功能，并且与本文所述的任何癌症疗法组合施用。主要支持性药剂包括抗惊厥药和皮质类固醇。因此，本发明的组合物和方法可以与任何标准或支持性治疗组合使用，以治疗胶质母细胞瘤或星形细胞瘤。

与BCMA表达相关的非癌症相关疾病和病症也可以通过本文披露的组合物和方法治疗。与BCMA表达相关的非癌症相关疾病和病症的实例包括但不限于：病毒感染；例如，HIV、真菌感染，例如新型隐球菌(C.neoformans)；肠易激综合征；溃疡性结肠炎和与粘膜免疫有关的疾病。

本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分(如IL-2或其他细胞因子或细胞群)组合施用。

本发明提供用于治疗癌症的组合物和方法。在一个方面，癌症是血液癌，包括但不限于作为白血病或淋巴瘤的血癌。在一个方面，本发明的表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)可用于治疗癌症和恶性肿瘤，如但不限于例如急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其他血液癌或血液病症，包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)等等。此外，与BCMA表达相关的疾病包括但不限于例如表达BCMA的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增殖性疾病。

在实施例中，本文描述的组合物可用于治疗疾病，包括但不限于浆细胞增殖性障碍(例如，无症状性骨髓瘤(冒烟型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤))、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(MGUS)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤(例如，浆细胞恶性增殖、孤立性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤和多发性浆细胞瘤)、全身性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、和POEMS综合征(也称为克罗-富克斯综合征、高月病和PEP综合征)。

在实施例中，本文描述的组合物可用于治疗疾病，包括但不限于癌症，例如本文所述的癌症，例如前列腺癌(例如，去势抵抗性或治疗抵抗性前列腺癌或转移性前列腺癌)、胰腺癌、肺癌。

本发明还提供用于抑制增殖或减少表达BCMA的细胞群的方法，该方法包括使包含表达BCMA的细胞的细胞群接触本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)。在一个具体方面，本发明提供用于抑制增殖或减少表达BCMA的癌细胞群的方法，该方法包括使表达BCMA的癌细胞群接触本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)。在一个方面，本发明提供用于抑制增殖或减少表达BCMA的癌细胞群的方法，该方法包括使表达BCMA的癌细胞群接触本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)使髓性白血病或与表达BCMA的细胞相关的另一种癌症的受试者或动物模型中的细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。

本发明还提供用于预防、治疗和/或控制与表达BCMA的细胞相关的疾病(例如，血液癌或表达BCMA的非典型癌症)的方法，该方法包括将本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)施用于有此需要的受试者。在一个方面，受试者是人。与表达BCMA的细胞相关的病症的非限制性实例包括病毒或真菌感染，以及与粘膜免疫相关的病症。

本发明还提供用于预防、治疗和/或控制与表达BCMA的细胞相关的疾病的方法，该方法包括将本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)施用于有此需要的受试者。在一个方面，受试者是人。

本发明提供用于预防与表达BCMA的细胞相关的癌症复发的方法，该方法包括将本发明的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMACAR的NK细胞)施用于有此需要的受试者。在一个方面，该方法包括将有效量的本文所述的结合表达BCMA的细胞的表达抗BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART细胞或表达BCMA CAR的NK细胞)与有效量的另一种疗法的组合施用于有此需要的受试者。

组合疗法

本文所述的表达CAR的细胞可以与其他已知的药剂和疗法组合使用。

可以将本文所述的表达CAR的细胞和至少一种另外的治疗剂同时(以相同或分开的组合物)、或依序施用。对于依次施用，可以首先施用本文所述的表达CAR的细胞并且可以其次施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。

可以将CAR疗法和/或其他治疗剂、程序或方式在活性障碍期间，或在缓解期或活性较低的疾病期间施用。可以将CAR疗法在其他治疗之前、与治疗并行、治疗后或在障碍缓解期施用。

当组合施用时，可以将CAR疗法和另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)或全部以比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量施用。在某些实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如，第二药剂或第三药剂)、或全部的施用量或剂量比单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。在其他实施例中，CAR疗法、另外的药剂(例如第二药剂或第三药剂)、或全部的导致期望效果(例如治疗癌症)的量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)的每种药剂实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％)。

在其他方面，本文所述的表达CAR的细胞可以与以下组合用于治疗方案：手术、化疗、放疗、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体、或其他免疫吸附剂(如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子以及照射、肽疫苗，诸如Izumoto等人,2008J Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971中所述的那些。

在某些情况下，将本发明化合物与其他治疗剂组合，如其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或抗呕剂)、镇痛药、细胞保护剂及其组合。

在一些实施例中，本文所述的表达第一CAR的细胞(例如，本文所述的表达BCMACAR的细胞)可以与表达第二CAR的细胞组合使用。在一些实施例中，表达第二CAR的细胞表达包含不同的抗BCMA结合结构域(例如，不同于由表达第一CAR的细胞表达的CAR中的抗BCMA结合结构域的本文所述的抗BCMA结合结构域)的CAR。在一些实施例中，表达第二CAR的细胞表达包含靶向除BCMA之外的抗原(例如，CD19、CD20、CS-1、κ轻链、CD139、路易斯Y抗原或CD38)的抗原结合结构域的CAR。在一些实施例中，本文所述的表达第一CAR的细胞(例如，本文所述的表达BCMA CAR的细胞)与包含CD19 CAR的表达第二CAR的细胞组合使用。在一些实施例中，本文所述的表达BCMA CAR的细胞与表达CD19 CAR的细胞组合使用，以治疗本文所述的BCMA相关癌症，例如多发性骨髓瘤。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是CD19阴性的，例如具有绝大多数(例如，至少98％、99％、99.5％、99.9％或99.95％)CD19阴性表型的赘生性浆细胞，例如如流式细胞术、RT-PCR或流式细胞术和RT-PCR二者所检测。CD19 CAR甚至对CD19阴性多发性骨髓瘤也有效。虽然不希望受理论的束缚，但是CD19 CAR可以通过靶向CD19的表达水平小于本文所述的测定法的检测阈值的细胞，或通过靶向支持赘生性细胞的非赘生性细胞来作用于小而重要的CD19阳性赘生性细胞群。在实施例中，CD19 CAR可以除去B细胞，例如B调节性B细胞。

例如，在一些实施例中，本文所述的表达第一CAR的细胞(例如，表达BCMA CAR的细胞)和本文所述的表达第二CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)以相同的组合物制备并同时施用。在另一个实施例中，本文所述的表达第一CAR的细胞(例如，表达BCMA CAR的细胞)和本文所述的表达第二CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)以单独的组合物制备，并且单独的组合物同时或依次施用。当表达BCMA CAR的细胞和表达第二CAR的细胞以单独的组合物制备时，可以首先施用表达BCMA CAR的细胞，然后可以施用表达第二CAR的细胞，或者可以颠倒施用顺序。

在一些实施例中，CD19 CAR是2014年3月15日提交的WO 2014/153270(该专利通过援引以其全文并入本文)中所述的CD19 CAR(例如，人源化CD19 CAR)或与其具有至少95％(例如，95％-99％)同一性的序列。在一些实施例中，CD19 CAR构建体是PCT公开WO 2012/079000(该专利通过援引以其全文并入本文)中提供的CAR19构建体，或与其具有至少95％(例如，95％-99％)同一性的序列。在一些实施例中，抗CD19结合结构域是WO 2012/079000中所述的scFv，或与其具有至少95％(例如，95％-99％)同一性的序列。

在实施例中，将表达第一CAR的细胞施用于受试者，并且将表达第二CAR的细胞施用于受试者。在实施例中，表达第一CAR的细胞包含含有CD27共刺激结构域和CD3ζ(突变型或野生型)初级信号传导结构域的CAR(例如，BCMA或CD19 CAR)。在实施例中，表达第二CAR的细胞包含含有4-1BB共刺激结构域和CD3ζ(突变型或野生型)初级信号传导结构域的CAR(例如，BCMA CAR)。不希望受理论的束缚，在实施例中，表达第一CAR的细胞的毒性可以比表达第二CAR的细胞小并且用于使肿瘤减积。

在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以与化疗剂组合使用。示例性化疗剂包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑珠单抗、吉妥单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调制剂如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。

考虑用于组合疗法的一般化疗药剂包括阿那曲唑

与本发明化合物组合的特别感兴趣的抗癌剂包括：蒽环霉素；烷基化剂；抗代谢物；抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶或p70S6激酶FK506)或抑制p70S6激酶的药物；mTOR抑制剂；免疫调节剂；蒽环霉素；长春花生物碱；蛋白酶体抑制剂；GITR激动剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；CDK4激酶抑制剂；BTK抑制剂；MKN激酶抑制剂；DGK激酶抑制剂；或溶瘤病毒。

示例性的烷化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：乌拉莫司汀(Aminouracil

示例性mTOR抑制剂包含例如坦罗莫司；地磷莫司(ridaforolimus)(正式地称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.0

示例性免疫调节剂包括例如阿托珠单抗(可购自

示例性蒽环霉素包括例如，多柔比星(

示例性长春花生物碱包括例如，酒石酸长春瑞滨

示例性蛋白体抑制剂包含硼替佐米

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与氟达拉滨、环磷酰胺和/或利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗(FCR)组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有CLL。例如，受试者在染色体17的短臂中具有缺失(例如白血病细胞中的del(17p))。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施例中，受试者包含白血病细胞，其包含免疫球蛋白重链可变区(IgV

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与苯达莫司汀和利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有CLL。例如，受试者在染色体17的短臂中具有缺失(例如白血病细胞中的del(17p))。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施例中，受试者包含含有免疫球蛋白重链可变区(IgV

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和/或皮质类固醇(例如，泼尼松)组合施用于受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在实施例中，受试者患有非大块的有限阶段DLBCL(例如，包含尺寸/直径小于7cm的肿瘤)。在实施例中，将受试者用与R-CHOP组合的辐射进行治疗。例如，向受试者施用R-CHOP(例如，1-6个循环，例如，1、2、3、4、5或6个R-CHOP循环)，然后进行辐射。在一些情况下，向受试者施用R-CHOP(例如，1-6个循环，例如，1、2、3、4、5或6个R-CHOP循环)，然后进行辐射。

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和/或利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和利妥昔单抗(EPOCH-R)组合施用于受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与剂量调整的EPOCH-R(DA-EPOCH-R)组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有B细胞淋巴瘤，例如Myc重排的侵袭性B细胞淋巴瘤。

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗和/或来那度胺组合施用于受试者。来那度胺((RS)-3-(4-氨基-1-氧代1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮)是免疫调节剂。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗和来那度胺组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有滤泡性淋巴瘤(FL)或套细胞淋巴瘤(MCL)。在实施例中，受试者患有FL并且之前未用癌症疗法治疗。在实施例中，将来那度胺以约10-20mg(例如，10-15或15-20mg)的剂量施用，例如每天施用。在实施例中，例如静脉内地将利妥昔单抗以约350-550mg/m

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与本妥昔单抗(brentuximab)组合施用于受试者。Brentuximab是抗CD30抗体和单甲基奥瑞斯他汀E的抗体-药物缀合物。在实施例中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)，例如复发或难治性HL。在实施例中，受试者包含CD30+HL。在实施例中，受试者已经历了自体干细胞移植(ASCT)。在实施例中，受试者未经历ASCT。在实施例中，例如每3周，例如静脉内地将本妥昔单抗以约1-3mg/kg(例如约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3mg/kg)的剂量施用。

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与本妥昔单抗和达卡巴嗪组合或与本妥昔单抗和苯达莫司汀组合施用于受试者。达卡巴嗪是化学名称为5-(3,3-二甲基-1-三苄基)咪唑-4-甲酰胺的烷化剂。苯达莫司汀是化学名称为4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷化剂。在实施例中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)。在实施例中，受试者先前未用癌症疗法治疗。在实施例中，受试者的年龄是至少60岁，例如60、65、70、75、80、85、或更大。在实施例中，例如静脉内地将达卡巴嗪以约300-450mg/m

在一些实施例中，与CD20抑制剂，例如抗CD20抗体(例如抗CD20单或双特异性抗体)或其片段组合向受试者施用本文所述的表达CAR的细胞。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、TRU-015(Trubion制药公司)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、和Pro131921(基因泰克公司(Genentech))。参见例如，Lim等人Haematologica.[血液学]95.1(2010):135-43)。

在一些实施例中，抗CD20抗体包括利妥昔单抗。利妥昔单抗是嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，它结合CD20并引起表达CD20的细胞的细胞溶解，例如，如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗组合施用受试者。在实施例中，受试者患有CLL或SLL。

在一些实施例中，将利妥昔单抗静脉内施用，例如以静脉内输注形式。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如，约500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、或1900-2000mg)利妥昔单抗。在一些实施例中，将利妥昔单抗以下述剂量施用：150mg/m

在一些实施例中，抗CD20抗体包括奥法木单抗。奥法木单抗是抗CD20 IgG1κ人单克隆抗体，分子量为大约149kDa。例如，将奥法木单抗使用转基因小鼠和杂交瘤技术产生，并且从重组鼠细胞系(NS0)表达和纯化。参见例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验标识号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352和NCT01397591。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与奥法木单抗组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有CLL或SLL。

在一些实施例中，将奥法木单抗作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约150-3000mg(例如，约150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800、或2800-3000mg)的奥法木单抗。在实施例中，将奥法木单抗以约300mg的起始剂量随后是2000mg的剂量施用例如持续约11个剂量，例如持续24周。在一些实施例中，将奥法木单抗以至少4天(例如，4、7、14、21、28、35天或更长)的给药间隔施用。例如，将奥法木单抗以至少1周(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30周或更长)的给药间隔施用。在一些实施例中，将奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用持续一段时间，例如，至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60周或更长，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长，或1、2、3、4、5年或更长。例如，将奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔施用，每个治疗周期总共至少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20个或更多剂量)。

在一些情况下，抗CD20抗体包括奥瑞珠单抗。奥瑞珠单抗是人源化抗CD20单克隆抗体，例如描述于以下中：临床试验标识号NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570、和Kappos等人Lancet.[柳叶刀]19.378(2011):1779-87)。

在一些情况下，抗CD20抗体包括维妥珠单抗。维妥珠单抗是针对CD20的人源化单克隆抗体。参见例如，临床试验标识号NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581、和Goldenberg等人Leuk Lymphoma.[白细胞淋巴瘤]51(5)(2010):747-55。

在一些情况下，抗CD20抗体包括GA101。GA101(也称为奥滨尤妥珠单抗或RO5072759)是人源化和糖工程化的抗CD20单克隆抗体。参见例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.[药物调研新见]10.6(2009):588-96；临床试验标识号：NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422和NCT01414205；和www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。

在一些情况下，抗CD20抗体包括AME-133v。AME-133v(也称为LY2469298或奥卡妥珠单抗)是针对CD20的人源化IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比具有对FcγRIIIa受体的增加的亲和力和增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。参见例如，Robak等人BioDrugs[生物药物]25.1(2011):13-25；和Forero-Torres等人Clin Cancer Res.[临床癌症研究]18.5(2012):1395-403。

在一些情况下，抗CD20抗体包括PRO131921。PRO131921是人源化抗CD20单克隆抗体，该单克隆抗体经工程化以与利妥昔单抗相比具有对FcγRIIIa更好的结合和增强的ADCC。参见例如，Robak等人BioDrugs[生物药物]25.1(2011):13-25；和Casulo等人ClinImmunol.[临床免疫]154.1(2014):37-46；和临床试验标识号NCT00452127。

在一些情况下，抗CD20抗体包括TRU-015。TRU-015是衍生自针对CD20抗体的结构域的抗CD20融合蛋白。TRU-015比单克隆抗体小，但保留Fc介导的效应子功能。参见例如，Robak等人BioDrugs[生物药物]25.1(2011):13-25。TRU-015含有与人IgG1铰链、CH2和CH3域连接的、但缺少CH1和CL结构域的抗CD20单链可变片段(scFv)。

在一些实施例中，本文所述的抗CD20抗体与本文所述的治疗剂(例如化学治疗剂(例如环磷酰胺、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐剂)、止痛剂、或细胞保护剂)缀合或以其他方式结合。

在实施例中，与B细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如维奈妥拉(venetoclax)，也称为ABT-199或GDC-0199)和/或利妥昔单抗组合向受试者施用本文所述的表达CAR的细胞。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与维奈妥拉和利妥昔单抗组合施用于受试者。维奈妥拉是抑制抗凋亡蛋白BCL-2的小分子。维奈妥拉(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)的结构如下所示。

在实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有复发CLL，例如受试者此前已施用癌症疗法。在实施例中，例如每天将维奈妥拉以约15-600mg(例如15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、400-500、或500-600mg)的剂量施用。在实施例中，以约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475或475-500mg/m

不受理论的束缚，据信在一些癌症中，B细胞(例如，B调节细胞)可以抑制T细胞。此外，据信奥西铂(oxiplatin)和B细胞耗减剂的组合可以减小肿瘤大小和/或消除受试者中的肿瘤。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，BCMA CAR)与B细胞耗减剂(例如，表达CD19 CAR的细胞、表达CD20 CAR的细胞、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗或贝利木单抗(belimumab))和奥西铂组合施用。在实施例中，癌细胞可以是CD19阴性的或CD19阳性的；或BCMA阴性的或BCMA阳性的。在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，BCMACAR)与B细胞耗减剂和奥西铂组合施用，以治疗癌症，例如本文所述的癌症，例如实体癌，例如前列腺癌、胰腺癌或肺癌。

在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，BCMA CAR)可以耗减受试者中的B细胞(例如，具有浆细胞样表型的B细胞，例如表达BCMA、CD19和/或CD20的B细胞)。在实施例中，B细胞可以是CD19阴性的或CD19阳性的；或BCMA阴性的或BCMA阳性的。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，BCMA CAR)与奥西铂组合施用。在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞与奥西铂组合施用，用于治疗癌症，例如实体癌，例如前列腺癌、胰腺癌或肺癌。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞与溶瘤病毒组合施用。在实施例中，溶瘤病毒能够选择性地复制并引发癌细胞的死亡或减缓其生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞没有影响或影响很小。溶瘤病毒包括但不限于溶瘤腺病毒、溶瘤性单纯疱疹病毒、溶瘤性逆转录病毒、溶瘤性细小病毒、溶瘤性痘苗病毒、溶瘤性辛奈病毒(oncolytic Sinbisviru)、溶瘤性流感病毒、或溶瘤性RNA病毒(例如，溶瘤性呼肠孤病毒、溶瘤性新城疫病毒(NDV)、溶瘤性麻疹病毒、或溶瘤性水疱性口炎病毒(VSV))。

在一些实施例中，溶瘤病毒是US 2010/0178684 A1中描述的病毒，例如重组溶瘤病毒，该专利通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，重组溶瘤病毒包含编码免疫反应或炎性应答抑制剂的核酸序列(例如，异源核酸序列)，例如如US 2010/0178684 A1中所述，该专利通过援引以其全文并入本文。在实施例中，重组溶瘤病毒，例如溶瘤性NDV，包含促凋亡蛋白(例如，凋亡蛋白)、细胞因子(例如，GM-CSF、干扰素-γ、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α)、免疫球蛋白(例如，针对ED-B纤连蛋白的抗体)、肿瘤相关抗原、双特异性衔接蛋白(例如，针对NDV HN蛋白的双特异性抗体或抗体片段和T细胞共刺激受体(如，CD3或CD28)；或人IL-2与针对NDV HN蛋白的单链抗体之间的融合蛋白)。参见例如，Zamarin等人Future Microbiol.[未来微生物学]7.3(2012):347-67，该文献通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，溶瘤病毒是描述于US 8591881 B2、US 2012/0122185 A1、或US 2014/0271677 A1(每个专利均通过援引以其全文并入本文)中的嵌合溶瘤NDV。

在一些实施例中，溶瘤病毒包含条件复制型腺病毒(CRAd)，其被设计成仅在癌细胞中复制。参见例如，Alemany等人Nature Biotechnol.[自然生物技术]18(2000):723-27。在一些实施例中，溶瘤腺病毒包含描述于Alemany等人的第725页的表1中的一种溶瘤腺病毒，该文献通过援引以其全文并入本文。

示例性溶瘤病毒包括但不限于：

B组溶瘤腺病毒(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics公司)(参见例如，临床试验标识：NCT02053220)；

ONCOS-102(以前称为CGTG-102)，其是包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(昂克斯治疗公司(Oncos Therapeutics))的腺病毒(参见例如，临床试验标识符：NCT01598129)；

VCN-01，其是编码人PH20透明质酸酶的遗传修饰的溶瘤人腺病毒(VCNBiosciences,S.L.公司)(参见例如，临床试验标识符：NCT02045602和NCT02045589)；

条件复制型腺病毒ICOVIR-5，其是经修饰以在癌细胞中用失调的视网膜母细胞瘤/E2F途径选择性复制的源自野生型人腺病毒血清型5(Had5)的病毒，(Institut Catalàd'Oncologia公司)(参见例如，临床试验标识：NCT01864759)；

Celyvir，其包含用ICOVIR5感染的骨髓来源的自体间充质干细胞(MSC)，该ICOVIR5是溶瘤腺病毒(西班牙马德里的小耶稣大学儿童医院(Hospital InfantilUniversitario

CG0070，其是条件性复制的溶瘤血清型5腺病毒(Ad5)，其中人E2F-1启动子驱动必需E1a病毒基因的表达，从而限制病毒复制和对Rb途径缺陷型肿瘤细胞的细胞毒性(ColdGenesys公司)(参见例如，临床试验标识：NCT02143804)；或

DNX-2401(以前命名为δ-24-RGD)，其是腺病毒，该腺病毒经工程化以在视网膜母细胞瘤(Rb)途径缺陷型细胞中选择性地复制并感染更高效地表达某些RGD结合整联蛋白的细胞(纳瓦拉大学医院(Clinica Universidad de Navarra),纳瓦拉大学(Universidad deNavarra)/德那翠丝有限公司(DNAtrix,Inc.))(参见例如，临床试验标识符：NCT01956734)。

在一些实施例中，通过注射(例如，皮下、动脉内、静脉内、肌内、鞘内、或腹膜内注射)施用本文描述的溶瘤病毒。在实施例中，将本文所述的溶瘤病毒通过肿瘤内、透皮、经粘膜、口服、鼻内、或经由肺部施用。

在一个实施例中，与降低Treg细胞群的分子组合向受试者施用表达本文所述CAR的细胞。减少(例如耗减)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如CD25耗减、环磷酰胺施用、调制GITR功能。不希望受理论的束缚，据信在单采血液成分术之前或施用本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如，Treg)的数量，并降低受试者的复发风险。在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子组合施用于受试者，如耗减调节T细胞(Treg)的GITR激动剂和/或GITR抗体。在实施例中，将表达本文所述CAR的细胞与环磷酰胺组合施用于受试者。在一些实施例中，在表达CAR的细胞施用之前，施用GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或消耗Treg的GITR抗体)。例如，在一些实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，将环磷酰胺施用于受试者。在实施例中，在施用(例如，输注或再输注)表达CAR的细胞之前或在细胞的采集之前，将环磷酰胺和抗GITR抗体施用于受试者。在一些实施例中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液癌，如多发性骨髓瘤、ALL或CLL)。在一个实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有多发性骨髓瘤。在实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌。示例性GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，例如像描述于以下中的GITR融合蛋白，美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505B1、欧洲专利号：8,586,023、PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754，或描述于以下中的抗GITR抗体，例如在美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO2013/039954、PCT公开号：WO 2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO 2001/03720、PCT公开号：WO 99/20758、PCT公开号：WO 2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号：7,618,632、和PCT公开号：WO 2011/051726。

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与mTOR抑制剂，例如本文所述的mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素类似物(如依维莫司))组合施用于受试者。在一些实施例中，mTOR抑制剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一些实施例中，mTOR抑制剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如，本文所述的GITR激动剂)组合施用于受试者。在一些实施例中，在表达CAR的细胞之前施用GITR激动剂。例如，在一些实施例中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，本文所述的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合施用于受试者。在一些实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文描述的SHP-1抑制剂，例如像葡萄糖酸锑钠。在一些实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。

在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以与激酶抑制剂组合施用。在一些实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，例如像6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮，盐酸盐(也称为帕柏西利(palbociclib)或PD0332991)。在一些实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如本文描述的BTK抑制剂，例如像依鲁替尼。在一些实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如本文描述的mTOR抑制剂，例如像雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。该mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文描述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一些实施例中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如本文描述的MNK抑制剂，例如像4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。该MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一些实施例中，激酶抑制剂是本文所述的双PI3K/mTOR抑制剂，例如像PF-04695102。在一些实施例中，激酶抑制剂是DGK抑制剂，例如本文所述的DGK抑制剂，例如像DGKinh1(D5919)或DGKinh2(D5794)。

在一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：阿洛新A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-苯并吡喃酮；克唑替尼(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮，盐酸(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；吲地横胺(indisulam)(E7070)；洛斯可维汀(roscovitine)(CYC202)；帕博西尼(PD0332991)；地那西利(dinaciclib)(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。

在一些实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如帕柏西利(PD0332991)，并且将帕柏西利以每天约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)的剂量施用一段时间，例如施用28天周期的14-21天、或施用21天周期的7-12天。在一些实施例中，施用帕博西尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4或6抑制剂(例如本文所述的CDK4抑制剂或CDK6抑制剂)组合施用于受试者。在实施例中，与CDK4/6抑制剂(例如靶向CDK4和CDK6两者的抑制剂)，例如本文所述的CDK4/6抑制剂组合向受试者施用本文所述的表达CAR的细胞。在一个实施例中，受试者患有MCL。MCL是一种侵袭性癌症，其对目前可用的疗法响应差，即基本上无法治愈。在许多MCL的病例中，细胞周期蛋白D1(CDK4/6的调节剂)在MCL细胞中表达(例如由于涉及免疫球蛋白和细胞周期蛋白D1基因的染色体易位)。因此，不受理论的束缚，认为MCL细胞对CDK4/6抑制高度敏感，具有高特异性(即对正常免疫细胞的影响最小)。单独的CDK4/6抑制剂在治疗MCL方面具有一些功效，但仅实现了具有高复发率的部分缓解。示例性CDK4/6抑制剂是LEE011(也称为利波西利(ribociclib))，其结构如下所示。

不受理论的束缚，据信例如与单独的CDK4/6抑制剂相比，施用本文所述的表达CAR的细胞与CDK4/6抑制剂(例如LEE011或本文所述的其他CDK4/6抑制剂)可以实现更高的响应性，例如具有更高的缓解率和/或更低的复发率。

在一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在优选的实施例中，BTK抑制剂不降低或抑制白介素-2-诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。

在一些实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(PCI-32765)。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)组合施用于受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与依鲁替尼(也称为PCI-32765)组合向受试者施用。依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)的结构如下所示。

在实施例中，受试者患有CLL、套细胞淋巴瘤(MCL)、或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。例如，受试者在染色体17的短臂中具有缺失(例如白血病细胞中的del(17p))。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施例中，受试者患有复发CLL或SLL，例如受试者此前已施用癌症疗法(例如此前已施用一次、两次、三次、或四次先前癌症疗法)。在实施例中，受试者患有难治性CLL或SLL。在其他实施例中，受试者患有滤泡性淋巴瘤，例如复发或难治性滤泡性淋巴瘤。在一些实施例中，将依鲁替尼以约300-600mg/天(例如约300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、或550-600mg/天，例如约420mg/天或约560mg/天)的剂量例如口服施用。在实施例中，依鲁替尼以每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量施用一段时间，例如每天施用达21天周期，或每天施用达28天周期。在一些实施例中，施用依鲁替尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。在一些实施例中，将依鲁替尼与利妥昔单抗组合施用。参见例如，Burger等人(2013)Ibrutinib In Combination With Rituximab(iR)Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In PatientsWith High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia(CLL):New,Updated Results Of aPhase II Trial In 40 Patients[与利妥昔单抗(iR)组合的依鲁替尼耐受良好并且在高风险慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者中诱导高比率的持久缓解：40名患者的II期试验的新的更新结果],摘要675第55届ASH年会和博览会(55

在本文的方法、用途、和组合物的一些实施例中，BTK抑制剂是描述于国际申请WO/2015/079417中的BTK抑制剂，该专利通过援引以其全文并入本文。例如，在一些实施例中，BTK抑制剂是具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐；

其中，

R1是氢、任选被羟基取代的C1-C6烷基；

R2是氢或卤素；

R3是氢或卤素；

R4是氢；

R5是氢或卤素；

或者R4和R5与彼此附接并且代表键、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-；-CH2-CH＝CH-；或-CH2-CH2-CH2-；

R6和R7彼此独立地代表H，任选被羟基取代的C1-C6烷基，任选被卤素或羟基取代的C3-C6环烷基、或卤素；

R8、R9、R、R’、R10和R11彼此独立地代表H、或任选被C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；或者R8、R9、R、R'、R10和R11中的任何两个与其所键合的碳原子一起可形成3-6元饱和碳环；

R12是氢或任选被卤素或C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；

或者R12和R8、R9、R、R'、R10或R11中的任一个与其所键合的原子一起形成4、5、6或7元氮杂环，该环可以任选被卤素、氰基、羟基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代；

n是0或1；以及

R13是任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或N,N-二-C1-C6烷基氨基取代的C2-C6烯基；任选被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的C2-C6炔基；或任选地被C1-C6烷基取代的C2-C6烯基氧。

在一些实施例中，具有式I的BTK抑制剂选自：N-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-3-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-烯酰)氮杂环丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰氮杂环丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)氮杂环丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-4-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(4-甲氧基-N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(4-环丙基-2-氟苯甲酰胺基)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(2-丙烯酰胺基乙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-乙基丙烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-(2-氟乙基)丙烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰胺基环丙基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-(2-丙烯酰胺基丙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(丁-2-烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(3-(N-甲基丙烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-1-氧代-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；2-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-3-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2R,3S)-1-丙烯酰-3-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；或N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺。

除非另有规定，否则上文在描述具有式I的BTK抑制剂时使用的化学术语根据其在国际申请WO/2015/079417中列出的含义使用，该专利通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：坦罗莫司；地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.0

在一些实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，并且将雷帕霉素以每天约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，每天6mg)的剂量施用一段时间，例如每天施用持续21天周期、或每天施用持续28天周期。在一些实施例中，施用雷帕霉素的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。在一些实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司，并且将依维莫司以每天约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)的剂量施用持续一段时间，例如每天施用持续28天周期。在一些实施例中，施用依维莫司的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。

在一些实施例中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如，本文所述的PI3K抑制剂，例如艾拉利司(idelalisib)或度维利司(duvelisib))和/或利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与艾拉利司和利妥昔单抗组合施用于受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与度维利司和利妥昔单抗组合施用于受试者。艾拉利司(也称为GS-1101或CAL-101；吉利德公司(Gilead))是阻断PI3K的δ同种型的小分子。艾拉利司(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)的结构如下所示。

度维利司(也称为IPI-145；无限制药公司(Infinity Pharmaceuticals)和艾伯维公司(Abbvie))是阻断PI3K-δ、γ的小分子。度维利司(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1(2H)-异喹啉酮)的结构如下所示。

在实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有复发CLL，例如受试者此前已施用癌症疗法(例如此前已施用抗CD20抗体或此前已施用依鲁替尼)。例如，受试者在染色体17的短臂中具有缺失(例如白血病细胞中的del(17p))。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施例中，受试者包含含有免疫球蛋白重链可变区(IgV

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂组合施用于受试者。示例性ALK激酶包括但不限于克唑替尼(辉瑞公司(Pfizer))、色瑞替尼(ceritinib)(诺华公司(Novartis))、艾乐替尼(alectinib)(中外制药公司(Chugai))、布加替尼(brigatinib)(也称为AP26113；Ariad)、恩曲替尼(entrectinib)(Ignyta)、PF-06463922(辉瑞)、TSR-011(Tesaro)(参见例如临床试验标识号NCT02048488)、CEP-37440(Teva)和X-396(Xcovery)。在一些实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌，例如肺癌。

克唑替尼的化学名称是3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。色瑞替尼的化学名称是5-氯-N

在一些实施例中，激酶抑制剂是双磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；艾皮托里昔布(apitolisib)(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。

也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶的药物(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶的药物(雷帕霉素)。(Liu等人,Cell[细胞]66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.[免疫学]73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.[免疫学新观点]5:763-773,1993)。在另一个方面，本发明的细胞组合物可以与以下联合施用(例如，之前、同时或之后)至患者：骨髓移植，使用化学治疗剂(如氟达拉滨)、外部光束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺、和/或抗体(如OKT3或CAMPATH)进行的T细胞消融疗法。在一个方面，将本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法(如，与CD20反应的药剂，例如利妥昔单抗)后施用。例如，在一些实施例中，受试者可以经受用高剂量化学疗法、然后进行外周血干细胞移植的标准疗法。在某些实施例中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另外的实施例中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与双膦酸盐(例如，帕米膦酸盐

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与皮质类固醇，例如地塞米松(例如，

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与免疫调节剂，例如阿托珠单抗(购自罗氏公司

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与血管内皮生长因子(VEGF)受体，例如贝伐单抗

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与CD20抗体或其缀合物，例如利妥昔单抗(

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与抗惊厥药，例如抗惊厥药(抗癫痫药或抗癫痫发作药)：醛，例如三聚乙醛；芳香烯丙醇，例如二氧苯庚醇

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂组合施用于受试者。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解为犬尿氨酸的酶。许多癌症过表达IDO，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌、和肺癌。pDC、巨噬细胞、和树突细胞(DC)可以表达IDO。不受理论的束缚，认为L-色氨酸的减少(例如，由IDO催化)通过诱导T细胞无反应性和细胞凋亡而导致免疫抑制环境。因此，不受理论的束缚，认为IDO抑制剂可以例如通过降低表达CAR的免疫细胞的抑制或死亡来增强本文所述表达CAR的细胞的功效。在实施例中，受试者患有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌、或肺癌。IDO的示例性抑制剂包含但不限于1-甲基-色氨酸、吲哚莫德(NewLink Genetics)(参见例如临床试验标识号NCT01191216；NCT01792050)和INCB024360(Incyte集团(Incyte Corp.))(参见例如临床试验标识号NCT01604889；NCT01685255)。

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)的调节剂组合施用于受试者。MDSC在许多实体瘤的外周和肿瘤部位积累。这些细胞抑制T细胞响应，从而阻碍表达CAR的细胞疗法的功效。不受理论的束缚，据认为施用MDSC调制剂增强了本文所述表达CAR的细胞的功效。在一个实施例中，受试者患有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如成胶质细胞瘤。MDSC的示例性调制剂包括但不限于MCS110和BLZ945。MCS110是针对巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。参见例如，临床试验标识号NCT00757757。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见例如，Pyonteck等人Nat.Med.[自然医学]19(2013):1264-72。BLZ945的结构在以下示出。

在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与CD19 CART细胞(例如，CTL019，例如如WO 2012/079000中所述，该专利通过援引并入本文)组合施用于受试者。在实施例中，受试者患有急性髓性白血病(AML)，例如CD19阳性AML或CD19阴性AML。在实施例中，受试者患有CD19+淋巴瘤，例如CD19+非霍奇金淋巴瘤(NHL)、CD19+FL、或CD19+DLBCL。在实施例中，受试者患有复发或难治性CD19+淋巴瘤。在实施例中，在施用(例如，输注)CD19 CART细胞之前、同时或之后向受试者施用淋巴细胞清除化学疗法。在一个实例中，在施用CD19 CART细胞之前，向受试者施用淋巴细胞清除化学疗法。例如，淋巴耗减化疗在CD19 CART细胞输注之前1-4天(例如，1、2、3或4天)结束。在实施例中，施用多剂量的CD19 CART细胞，例如，如本文所述。例如，单剂量包含约5x 10

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与表达CD19 CAR的细胞(例如，CTL019，例如如WO 2012/079000中所述，该专利通过援引并入本文)组合施用于受试者，用于治疗与BCMA的表达相关的疾病，例如本文所述的癌症。不受理论的束缚，据信将表达CD19CAR的细胞与表达CAR的细胞组合施用通过靶向早期谱系癌细胞(例如癌症干细胞)、调节免疫应答、消耗调节性B细胞和/或改善肿瘤微环境而改善本文所述的表达CAR的细胞的功效。例如，表达CD19 CAR的细胞靶向表达早期谱系标志物的癌细胞，例如癌症干细胞和表达CD19的细胞，而本文所述的表达CAR的细胞靶向表达晚期谱系标志物(例如，BCMA)的癌细胞。此预调理方法可以改善本文所述的表达CAR的细胞的功效。在此类实施例中，将表达CD19 CAR的细胞在施用(例如，输注)本文所述的表达CAR的细胞之前、同时或之后施用。

在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞还表达靶向CD19的CAR，例如CD19 CAR。在一个实施例中，将表达本文所述CAR的细胞和CD19 CAR施用于受试者以治疗本文所述的癌症，例如AML。在一个实施例中，CAR分子的一者或两者的构型包括初级细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在另一个实施例中，CAR分子的一者或两者的构型包含初级细胞内信号传导结构域和两个或更多个(例如2、3、4或5个或更多个)共刺激信号传导结构域。在此类实施例中，本文所述的CAR分子和CD19 CAR可具有相同或不同的初级细胞内信号传导结构域、相同或不同的共刺激信号传导结构域、或相同数量或不同数量的共刺激信号传导结构域。替代性地，本文所述的CAR和CD19 CAR被配置为分离型CAR，其中CAR分子之一包含抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，4-1BB)，而另一CAR分子包含抗原结合结构域和初级细胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)。

在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽、或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如hetIL-15(Admune疗法有限公司(Admune Therapeutics,LLC)))两者的组合进行组合施用至受试者。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的异二聚体非共价复合物。hetIL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413、和U.S.2011/0081311中，这些文献通过引用并入本文。在实施例中，皮下施用het-IL-15。在实施例中，受试者患有癌症，例如实体癌，例如黑素瘤或结肠癌。在实施例中，受试者患有转移癌。

在一些实施例中，可以向受试者施用降低或改善与施用表达CAR的细胞相关的副作用的药剂。与施用表达CAR的细胞相关的副作用包括但不限于CRS和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)(也称为巨噬细胞激活综合征(MAS))。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。CRS可以包括临床体质上体征和症状，如发烧、疲劳、厌食、肌痛、眩晕、恶心、呕吐和头痛。CRS可以包括临床皮肤体征和症状，如皮疹。CRS可以包括临床胃肠道体征和症状，如恶心、呕吐和腹泻。CRS可以包括临床呼吸道体征和症状，如呼吸急促和低氧血症。CRS可以包括临床心血管体征和症状，如心动过速、脉压加宽、低血压、心输出量增加(早期)和潜在的心输出量减少(晚期)。CRS可以包括临床凝血体征和症状，如升高的d-二聚体、伴有或不伴有出血的低纤维蛋白原血症。CRS可以包括临床肾体征和症状，如氮血症。CRS可以包括临床肝体征和症状，如转氨酶升高(transaminitis)和高胆红素血症。CRS可以包括临床神经的体征和症状，如头痛、精神状态改变、精神错乱、发狂、唤词困难或明显失语、幻觉、震颤、辨距不良、步态改变、和癫痫发作。

因此，本文所述的方法可包括向受试者施用本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步施用一种或多种药剂以控制由表达CAR的细胞治疗引起的可溶性因子水平升高。在一些实施例中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。在一个实施例中，受试者中升高的因子是IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和不规则趋化因子(fraktalkine)中的一种或多种。因此，施用以治疗此副作用的药剂可以是中和这些可溶性因子中的一种或多种的药剂。在一些实施例中，中和这些可溶形式中的一种或多种的药剂是抗体或抗体片段。此类药剂的实例包括但不限于类固醇(例如,皮质类固醇)、TNFα抑制剂、和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实例是抗TNFα抗体分子如英夫利昔单抗、阿达木单抗、塞妥珠单抗、和戈利木单抗。TNFα抑制剂的另一个实例是融合蛋白，如依那西普(entanercept)。TNFα的小分子抑制剂包含但不限于黄嘌呤衍生物(例如，己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的实例是抗IL-6抗体分子，如托珠单抗(toc)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301和FM101。在一些实施例中，抗IL-6抗体分子是托珠单抗。基于IL-1R的抑制剂的实例是阿那白滞素(anakinra)。

在一些实施例中，向受试者施用皮质类固醇，例如像甲基泼尼松龙、氢化可的松等。

在一些实施例中，向受试者施用血管加压药，例如像去甲肾上腺素、多巴胺、去氧肾上腺素、肾上腺素、加压素、或其组合。

在一个实施例中，可以向受试者施用解热剂。在一个实施例中，可以向受试者施用镇痛剂。

在一些实施例中，可以向受试者施用防止表达BCMA CAR的细胞向脑中运输的药剂，例如那他珠单抗

在一些实施例中，可以向受试者施用增强表达CAR的细胞活性的药剂。例如，在一些实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂，例如，药剂是检查点抑制剂。在一些实施例中，抑制性分子(例如，程序性死亡受体1(PD1))可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用例如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸(例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)、转录活化子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指内切核酸酶(ZFN)来抑制表达CAR的细胞中抑制性分子的表达。在一个实施例中，抑制剂是shRNA。在一个实施例中，抑制性分子在表达CAR的细胞内被抑制。在这些实施例中，对抑制性分子的表达进行抑制的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如，所有组分)的核酸连接。在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞与抑制性分子的抑制剂组合施用，例如与检查点抑制剂组合施用，例如与PD1和/或PD-L1的抑制剂组合施用。在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞与PD1的抑制剂组合施用。在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞与PD-L1的抑制剂组合施用。

在一个实施例中，将编码抑制调制或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子与启动子(例如，H1-或U6-衍生的启动子)可操作地连接，使得抑制调制或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子表达，例如在表达CAR的细胞内表达。参见例如Tiscornia G.,“Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,”Chapter 3[表达siRNA的慢病毒载体的开发，第3章],载于

以下提供了用于抑制调控或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子的表达的dsRNA分子的实例，其中调控或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子是PD-1。

在一些实施例中，抑制性信号的抑制剂可以是例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，该药剂可以是结合PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如ipilimumab(也称为MDX-010和MDX-101，并且作为

PD-1是还包括CD28、CTLA-4、ICOS、和BTLA的CD28受体家族的抑制性成员。PD-1在激活的B细胞、T细胞和髓系细胞上表达(Agata等人1996 Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75)。已经显示PD-1、PD-L1和PD-L2的两种配体在与PD-1结合后下调T细胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人2003 J Mol Med[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述的本发明的car组合使用。例如，纳武单抗(nivolumab)(也称为BMS-936558或MDX1106；百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))是全人IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PD-1。纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD-1的其他人单克隆抗体在US 8,008,449和WO 2006/121168中披露。匹利珠单抗(Pidilizumab)(CT-011；Cure Tech)是与PD-1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。匹利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体披露在WO 2009/101611中。派姆单抗(以前称为拉姆布罗力珠单抗(lambrolizumab)，并且也称为MK03475；默克公司)是结合PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体在US8,354,509和WO 2009/114335中披露。MEDI4736(医学免疫公司(Medimmune))是结合PDL1的人单克隆抗体，并抑制配体与PD1的相互作用。MDPL3280A(基因泰克公司/罗氏公司(Roche))是结合PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和针对PD-L1的其他人单克隆抗体披露于美国专利号：7,943,743和美国公开号：20120039906。其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重链和轻链可变区显示于WO 2010/077634中的SEQ ID NO 20和21中)和MDX-1 105(也称为BMS-936559，并且例如，WO 2007/005874中披露的抗PD-L1结合剂)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，在WO 2010/027827和WO 2011/066342中披露)是PD-L2 Fc融合可溶性受体，其阻断PD-1与B7-H1之间的相互作用。其他抗PD-1抗体包括AMP 514(Amplimmune)，尤其例如US 8,609,089、US 2010028330、和/或US 20120114649中披露的抗PD-1抗体。

TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)也负调节T细胞功能，特别是在分泌IFN-g的CD4+T辅助细胞1和CD8+T细胞毒性细胞1中，并且在T细胞耗竭中起关键作用。抑制TIM3与其配体(例如，半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1)之间的相互作用可以增强免疫应答。TIM3及其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述的CD19或BCMA CAR组合使用。例如，靶向TIM3的抗体、抗体片段、小分子或肽抑制剂结合TIM3的IgV域以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽披露于WO 2013/006490和US 20100247521中。其他抗TIM3抗体包括人源化形式的RMT3-23(在Ngiow等人,2011,Cancer Res[癌症研究],71:3540-3551中披露)和克隆8B.2C12(在Monney等人,2002,Nature[自然],415:536-541中披露)。在US 20130156774中披露了抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体。

在其他实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂是CEACAM抑制剂(例如，CEACAM-1、CEACAM-3、和/或CEACAM-5抑制剂)。在一些实施例中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251、和WO 2014/022332中，例如，单克隆抗体34B1、26H7、和5F4；或其重组形式，如例如US 2004/0047858、US 7,132,255和WO 99/052552中所述。在其他实施例中，抗CEACAM抗体结合CEACAM-5，如例如描述于Zheng等人PLoS One.[公共科学图书馆综合]2010年9月2日；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)，或与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应，如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述。

不希望受理论的束缚，癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM)(如，CEACAM-1和CEACAM-5)被认为至少部分地介导制抗肿瘤免疫应答的抑制(参见例如Markel等人,J Immunol.[免疫学杂志],2002年3月15日；168(6):2803-10；Markel等人J Immunol.[免疫学杂志]2006年11月1日；177(9):6062-71；Markel等人Immunology.[免疫学]2009年2月；126(2):186-200；Markel等人Cancer Immunol Immunother.[癌症免疫学免疫疗法]2010年2月；59(2):215-30；Ortenberg等人Mol Cancer Ther.[分子癌症治疗学]2012年6月；11(6):1300-10；Stern等人J Immunol.[免疫学杂志]2005年6月1日；174(11):6692-701；Zheng等人PLoS One.[公共科学图书馆综合]2010年9月2日；5(9).pii:e12529)。例如，CEACAM-1已被描述为TIM-3的嗜异性配体，并且在TIM-3介导的T细胞耐受性和耗竭中起作用(参见例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014)Nature[自然]doi:10.1038/nature13848)。在实施例中，已显示CEACAM-1和TIM-3的共同阻断增强异种移植结肠直肠癌模型中的抗肿瘤免疫应答(参见例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014),出处同上)。在其他实施例中，如例如WO 2014/059251中所述，共阻断CEACAM-1和PD-1降低了T细胞耐受性。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其他免疫调制剂(例如抗PD-1和/或抗TIM-3抑制剂)一起使用，以增强针对癌症(例如黑素瘤、肺癌(例如NSCLC)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、和如本文所述的其他癌症)的免疫响应。

LAG3(淋巴细胞激活基因-3或CD223)是在激活的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，已显示该细胞表面分子在CD8+T细胞耗竭中起作用。LAG3及其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述的CD19或BCMA CAR组合使用。例如，BMS-986016(百时美施贵宝公司)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(伊缪泰普公司(Immutep))是拮抗性LAG3抗体，并且IMP731(伊缪泰普公司和葛兰素史克(GlaxoSmithKline))是耗减性LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包含IMP321(伊缪泰普公司)，它是LAG3的可溶性部分和Ig的重组融合蛋白，结合MHC II类分子并激活抗原呈递细胞(APC)。其他抗体披露于例如WO 2010/019570中。

在一些实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，并且第二结构域是与正信号相关的多肽，例如包含如本文所述的细胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施例中，与阳性信号相关的多肽可以包括CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域(例如，CD28、CD27和/或ICOS的细胞内信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，如本文所述的CD3ζ的初级信号传导结构域)。在一些实施例中，融合蛋白由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施例中，融合蛋白由细胞(例如，不表达抗BCMA CAR的T细胞或NK细胞)表达。

在一些实施例中，增强本文所述的表达CAR的细胞活性的药剂是miR-17-92。

在一些实施例中，增强本文所述CAR的活性的药剂是细胞因子。细胞因子具有与T细胞扩增、分化、存活、和稳态相关的重要功能。可以向接受本文所述的表达CAR的细胞的受试者施用的细胞因子包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、和IL-21、或其组合。在优选的实施例中，所施用的细胞因子是IL-7、IL-15、或IL-21、或其组合。可以一天一次或一天多于一次(例如一天两次、一天三次、或一天四次)施用该细胞因子。可以施用细胞因子持续多于一天，例如施用细胞因子持续2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、或4周。例如，一天一次施用细胞因子持续7天。

在实施例中，将细胞因子与表达CAR的T细胞组合施用。细胞因子可以与表达CAR的T细胞同时或并行地施用，例如，在同一天施用。细胞因子可以在与表达CAR的T细胞相同的药物组合物中制备、或者可以在分开的药物组合物中制备。替代性地，细胞因子可以在施用表达CAR的T细胞后不久(例如，在施用表达CAR的T细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天)施用。在其中以超过一天发生的施用细胞因子的给药方案的实施例中，细胞因子给药方案的第一天可以与施用表达CAR的T细胞在同一天，或者细胞因子给药方案的第一天可以是施用表达CAR的T细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天。在一些实施例中，在第一天，将表达CAR的T细胞施用于受试者，并且在第二天，在接下来的7天内每天施用细胞因子一次。在优选的实施例中，与表达CAR的T细胞组合施用的细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21。

在其他实施例中，在施用表达CAR的细胞后施用细胞因子一段时间，例如在施用表达CAR的细胞后至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更久。在一些实施例中，在评估受试者对表达CAR的细胞的响应后施用细胞因子。例如，根据本文所述的剂量和方案将表达CAR的细胞施用于受试者。使用本文所述的任何方法(包括抑制肿瘤生长、减少循环肿瘤细胞、或肿瘤消退)，在施用表达CAR的细胞后2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更长时间评估受试者对表达CAR的细胞疗法的应答。对表达CAR的细胞疗法未表现出足够响应的受试者可以施用细胞因子。向对表达CAR的细胞疗法具有次优应答的受试者施用细胞因子改善了表达CAR的细胞的功效或抗癌活性。在优选的实施例中，在施用表达CAR的细胞后施用的细胞因子是IL-7。

在一些实施例中，本文所述的BCMA CAR T细胞可以与低免疫增强剂量的mTOR抑制剂组合使用。本文所述的方法使用低免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如变构mTOR抑制剂(包括雷帕霉素类似物(如RAD001))。在受试者中施用低免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如，不足以完全抑制免疫系统但足以改善免疫功能的剂量)可以优化免疫效应细胞(例如，T细胞或表达CAR的细胞)的性能。用于测量mTOR抑制的方法、剂量、治疗方案、和合适的药物组合物描述于美国专利申请号2015/01240036中，该专利据此通过援引并入。对于将BCMA CAR T细胞与mTOR抑制剂组合的方法，参见例如US 20160046724的第[0826]-[0861]段，该专利通过援引以其全文并入本文。

用于评估CAR有效性或样品适合性的方法和生物标记

在另一个方面，本发明的特征在于评估或监测表达CAR的细胞疗法(例如，BCMACAR疗法)在受试者(例如，患有癌症(例如血液癌)的受试者)中的有效性，或用于CAR疗法(例如，BCMACAR疗法)的样品(例如，单采血液成分样品)的适合性的方法。该方法包括获得CAR疗法有效性或样品适合性的值，其中所述值指示表达CAR的细胞疗法的有效性或适合性。

在实施例中，CAR疗法的有效性或样品适合性的值包括以下一者、二者、三者、四者、五者、六者或更多者(全部)的测量值：

(i)样品(例如，单采血液成分样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中静息T

(ii)样品(例如，单采血液成分样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中活化的T

(iii)样品(例如，单采血液成分样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中免疫细胞耗竭标记物，例如免疫检查点抑制剂(例如，PD-1、PD-L1、TIM-3和/或LAG-3)中的一者、两者或更多者的水平或活性。在一些实施例中，免疫细胞具有耗竭的表型，例如共表达至少两个耗竭标记物，例如共表达PD-1和TIM-3。在其他实施例中，免疫细胞具有耗竭的表型，例如共表达至少两个耗竭标记物，例如共表达PD-1和LAG-3；

(iv)样品(例如，单采血液成分样品或制造的表达CAR的细胞产物样品)中CD27和/或CD45RO-(例如，CD27+CD45RO-)免疫效应细胞，例如CD4+或CD8+T细胞群中的水平或活性；

(v)选自CCL20、IL-17a和/或IL-6、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、CD57、CD27、CD122、CD62L、KLRG1的生物标志物中的一者、二者、三者、四者、五者、十者、二十者或更多者的水平或活性；

(vi)表达CAR的细胞产物样品，例如表达BCMA的细胞产物样品中的细胞因子水平或活性(例如，细胞因子谱系的质量)；或

(vii)制造的表达CAR的细胞产物样品中表达CAR的细胞的转导效率。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，表达CAR的细胞疗法包括多个(例如，一群)表达CAR的免疫效应细胞，例如多个(例如，一群)T细胞或NK细胞或它们的组合。在一些实施例中，表达CAR的细胞疗法是BCMACAR疗法。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，(i)-(vii)中的一项或多项的测量值从得自受试者的单采血液成分样品获得。可以在输注或再输注之前评估单采血液成分样品。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，(i)-(vii)中的一项或多项的测量值从制造的表达CAR的细胞产物样品(例如，表达BCMACAR的细胞产物样品)获得。可以在输注或再输注之前评估制造的表达CAR的细胞产物。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在接受表达CAR的细胞疗法之前、期间或之后评估受试者。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，(i)-(vii)中的一项或多项的测量值评估基因表达、流式细胞术或蛋白质表达中的一者或多者的特征。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，该方法还包括根据(i)-(vii)中的一项或多项的测量值，将受试者鉴定为反应者、无反应者、复发者或无复发者。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与无反应者相比，反应者(例如，完全反应者)具有或被鉴定为具有更高水平或活性的GZMK、PPF1BP2或初始T细胞中的一者、两者或更多者(全部)。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与反应者相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高水平或活性的IL22、IL-2RA、IL-21、IRF8、IL8、CCL17、CCL22、效应T细胞或调节T细胞中的一者、两者、三者、四者、五者、六者、七者或更多者(例如，全部)。

在一个实施例中，复发者是具有或被鉴定为具有与无复发者相比表达水平增加的以下基因中的一者或多者(例如，2者、3者、4者或全部)：MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C和HLA-DQB1和/或与无复发者相比表达水平减少的以下基因中的一者或多者(例如，2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者或全部)：PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1和EIF1AY的患者。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如，无反应者CD8+T细胞百分比)相比，完全反应者具有或被鉴定为具有更高的(例如，统计学上显著更高的)CD8+T细胞百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如，无反应者数量的CD27+CD45RO-免疫效应细胞)相比，完全反应者具有或被鉴定为具有更高的CD27+CD45RO-免疫效应细胞百分比，例如在CD8+群体中。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如，无反应者CD4+T细胞百分比)相比，完全反应者或部分反应者具有或被鉴定为具有更高的(例如，统计学上显著更高的)CD4+T细胞百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如，无反应者数量的静息T

在本文披露的任何方法的一些实施例中，与参考值(例如，反应者数量的活化的T

在本文披露的任何方法的一些实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的免疫细胞耗竭标记物(例如，一种、两种或更多种免疫检查点抑制剂(例如，PD-1、PD-L1、TIM-3和/或LAG-3))的百分比。在一些实施例中，与来自反应者的PD-1或LAG-3表达免疫效应细胞的百分比相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1、PD-L1或LAG-3表达免疫效应细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)(例如，表达CAR的CD4+细胞和/或CD8+T细胞)的百分比。

在一些实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如，共表达至少两种耗竭标志物(例如，共表达PD-1、PD-L1和/或TIM-3)的免疫细胞)的百分比。在其他实施例中，无反应者具有或被鉴定为具有更高的具有耗竭表型的免疫细胞(例如，共表达至少两种耗竭标记物(例如，共表达PD-1和LAG-3)的免疫细胞)的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，与表达CAR的细胞疗法的反应者(例如，完全反应者)相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，部分反应者具有或被鉴定为具有比反应者更高的PD-1/PD-L1+/LAG-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，无反应者具有或被鉴定为具有PD1/PD-L1+CAR+的耗竭表型和LAG3的共表达。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，与反应者(例如，完全反应者)相比，无反应者具有或被鉴定为具有更高的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，在表达CAR的细胞群(例如，BCMACAR+细胞群)中，部分反应者具有或被鉴定为具有比反应者更高的PD-1/PD-L1+/TIM-3+细胞的百分比。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，单采血液成分样品中CD8+CD27+CD45RO-T细胞的存在是受试者对表达CAR的细胞疗法(例如，BCMACAR疗法)的反应的阳性预测因子。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，单采血液成分样品中PD1+CAR+和LAG3+或TIM3+T细胞的高百分比是受试者对表达CAR的细胞疗法(例如，BCMACAR疗法)的反应的不良预后预测因子。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，反应者(例如，完整或部分反应者)具有以下特征中的一者、两者、三者或更多者(或全部)：

(i)与参考值(例如，无反应者数量的CD27+免疫效应细胞)相比，具有更多数量的CD27+免疫效应细胞；

(ii)(i)与参考值(例如，无反应者数量的CD8+T细胞)相比，具有更多数量的CD8+T细胞；

(iii)与参考值(例如，无反应者数量的表达一种或多种检查点抑制剂的细胞)相比，具有更少数量的表达一种或多种检查点抑制剂(例如选自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或KLRG-1的检查点抑制剂或组合)的免疫细胞；或

(iv)与参考值(例如，无反应者数量的静息T

在本文披露的任何方法的一些实施例中，(vi)的细胞因子水平或活性选自细胞因子CCL20/MIP3a、IL17A、IL6、GM-CSF、IFNγ、IL10、IL13、IL2、IL21、IL4、IL5、IL9或TNFα中的一者、二者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或更多者(或全部)或它们的组合。细胞因子可以选自IL-17a、CCL20、IL2、IL6或TNFα中的一者、二者、三者、四者或更多者(全部)。在一些实施例中，细胞因子的增加水平或活性选自IL-17a和CCL20中的一者或二者，这表明反应增加或复发减少。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，(vii)中的15％或更高的转导效率表明反应增加或复发减少。

在本文披露的任何方法的一些实施例中，(vii)中的小于15％的转导效率表明反应减少或复发增加。

在实施例中，可以根据临床标准进一步评估由本文的方法鉴定的反应者、无反应者、复发者或无复发者。例如，完全反应者具有或被鉴定为具有疾病(例如，癌症)的受试者，该受试者表现出对治疗的完全反应，例如完全缓解。如本文所述，可以例如使用NCCN

替代性地，或与本文披露的方法组合，响应于所述值，执行以下一者、二者、三者或更多者：

例如，将表达CAR的细胞疗法施用于反应者或无复发者；

施用改变剂量的表达CAR的细胞疗法；

改变表达CAR的细胞疗法的排程或时程；

例如，将另外的药剂与表达CAR的细胞疗法(例如检查点抑制剂，例如本文所述的检查点抑制剂)组合施用于无反应者或部分反应者；

在用表达CAR的细胞疗法治疗之前，将增加受试者中的较年轻的T细胞的数量的疗法施用于无反应者或部分反应者；

修改表达CAR的细胞疗法的制造方法，例如在引入编码CAR的核酸之前富集较年轻的T细胞，或例如针对被鉴定为无反应者或部分反应者的受试者而言，增加转导效率；

例如针对无反应者或部分反应者或复发者，施用替代疗法；或

如果受试者为或被鉴定为无反应者或复发者，则例如通过CD25耗减、施用环磷酰胺、抗GITR抗体中的一者或多者或它们的组合来减少T

在某些实施例中，用抗GITR抗体预治疗受试者。在某些实施例中，在输注或再输注之前用抗GITR抗体治疗受试者。

生物聚合物递送方法

在一些实施例中，如本文所披露的一种或多种表达CAR的细胞可以经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在的或合成的生物相容的(例如，基本上不诱导炎性或免疫应答)和/或可生物降解的聚合物。

合适的生物聚合物的实例包括但不限于琼脂、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐/磷酸钙水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-戊乙酰基a-D-半乳糖)、纤维素、几丁质、壳聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原、羟基磷灰石、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基-己酸酯)(PHBHHx)、聚(丙交酯)、聚(己内酯)(PCL)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚环氧丙烷(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、丝、大豆蛋白、和大豆蛋白分离物，单独地或以任何浓度和任何比率与任何其他聚合物组合物组合。生物聚合物可以用粘附或迁移促进分子(例如，与淋巴细胞的胶原受体结合的胶原模拟肽、和/或刺激性分子)强化或修饰以增强待递送细胞的递送、扩增或功能(例如，抗癌活性)。生物聚合物支架可以是可注射的，例如凝胶或半固体、或固体组合物。

在一些实施例中，在递送至受试者之前，将本文所述的表达CAR的细胞接种到生物聚合物支架上。在实施例中，生物聚合物支架进一步包含一种或多种本文所述的另外的治疗剂(例如，另一种表达CAR的细胞、抗体、或小分子)或例如并入或缀合到支架的生物聚合物的增强表达CAR的细胞活性的药剂。在实施例中，生物聚合物支架被注射(例如，瘤内、或通过外科手术植入)到肿瘤处或足以介导抗肿瘤作用的肿瘤附近。生物聚合物组合物及其递送方法的另外的实例描述于Stephan等人,Nature Biotechnology[自然生物技术],2015,33:97-101；和WO 2014/110591中。

药物组合物和治疗

本发明的药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如如本文描述的多种表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的总量和频率将由如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。

在一些实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一些实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。

当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的个体差异来确定待施用的本发明组合物的精确量。通常可以说，可以将包含本文所述T细胞的药物组合物按以下剂量施用：10

在某些方面，可能需要将激活的T细胞施用于受试者，然后随后重新抽取血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明激活来自血液的T细胞，并用这些激活和扩增的T细胞重新输注入患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以将来自10cc至400cc抽血的T细胞激活。在某些方面，将来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc抽血的T细胞激活。

能以任何常规方式施用主题组合物，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文描述的组合物。在一个方面，通过真皮内或皮下注射向患者施用本发明的T细胞组合物。在一个方面，本发明的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)组合物通过静脉内注射来施用。可以将表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位。

在具体的示例性方面，受试者可经历白细胞析离法，其中离体收集、富集或耗减白细胞以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。这些免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)分离物可以通过本领域已知的方法来扩增，并进行处理，使得可以引入本发明的一种或多种CAR构建体，从而产生本发明的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞或表达CAR的NK细胞)。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或与移植同时，受试者接受本发明的扩增的表达CAR的细胞(例如，CAR T细胞或NK细胞)的输注。在另外的方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

在实施例中，例如在施用表达本文所述的CAR(例如，本文所述的BCMA结合CAR)的一种或多种细胞之前，对受试者进行淋巴细胞耗减。在实施例中，淋巴细胞清除包括施用美法仑、cytoxan、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。

有待向患者施用的以上治疗的剂量将随着所治疗病症的确切性质和该治疗的受者而变化。可以根据本领域接受的做法来进行人类施用的剂量的缩放。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量通常将在1至约100mg的范围内，通常每天施用持续1至30天的时间。优选的每天剂量是每天1至10mg，但在一些情况下，可以使用每天最多40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。

在一些实施例中，例如使用体外转录将CAR引入免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并且受试者(例如，人)接受本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的初始施用，以及本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前一次施用后的小于15天(例如在14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天)施用。在一些实施例中，每周将本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用于受试者(例如，人)超过一次，例如每周施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)2次、3次或4次。在一些实施例中，受试者(例如，人受试者)每周接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的超过一次施用(例如，每周2次、3次或4次施用)(本文也称为周期)，然后不施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)一周，然后给受试者施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的一次或多次另外施用(例如，每周施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)超过一次)。在另一个实施例中，受试者(例如，人受试者)接受CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)超过一个周期，并且每个周期之间的时间小于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一些实施例中，每隔一天施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，每周施用3次。在一些实施例中，施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。

在一个方面，使用慢病毒病毒载体(如慢病毒)来产生表达BCMA CAR的细胞(例如，BCMA CART或表达BCMA CAR的NK细胞)。以这种方式产生的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)将具有稳定的CAR表达。

在一个方面，使用病毒载体如γ逆转录病毒载体(例如本文描述的γ逆转录病毒载体)产生表达CAR的细胞，例如CART。使用这些载体产生的CART可以具有稳定的CAR表达。

在一个方面，表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)在转导后瞬时表达CAR载体4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。CAR的瞬时表达可能受RNA CAR载体递送的影响。在一个方面，通过电穿孔将CAR RNA转导进细胞(例如，T细胞或NK细胞)。

使用瞬时表达的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)(特别是与携带鼠scFv的表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)一起)治疗的患者可能产生的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。

不受该理论的束缚，据信这种过敏反应可能是由患者发展体液抗CAR反应，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体引起的。认为当存在暴露于抗原的10至14天中断时，患者的抗体产生细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。

如果患者在瞬时CAR治疗过程中具有产生抗CAR抗体反应的高风险(如由RNA转导产生的那些)，则表达CAR的细胞(例如，CART或表达CAR的NK细胞)输注中断不应持续超过十至十四天。

实例

通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。提供这些实例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不应旨在是限制性的。因此，本发明决不应被解释为限于以下实例，而是应该被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。

无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实例制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。以下工作实例具体指出了本发明的不同方面，并且不应被解释为以任何方式限制本披露内容的其余部分。

实例1：人BCMA CAR的体外表征

将一组完全人单链可变片段(scFv)克隆至具有CD3ζ链和4-1BB刺激分子的下列慢病毒CAR表达载体中：R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-10、B61-02、Hy03和Hy52。最初使用自动化细胞报告测定法来筛选构建体，然后根据原代T细胞上的表达以及响应于BCMA表达(“BCMA+”或“BCMA阳性”)靶标的效应T细胞(“BCMA CART”或“BCMA CAR T细胞”)的数量和质量来进行最佳克隆选择。效应T细胞应答包括但不限于细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生和靶细胞杀伤或细胞溶解活性(脱粒)。

BCMA CAR慢病毒的产生

使用所有上述编码scFv的慢病毒转移载体来产生包装在VSVg假型慢病毒颗粒中的基因组物质。将编码CAR的慢病毒转移载体DNA与三种包装组分VSVg、gag/pol和rev混合，并与lipofectamine试剂组合，以转染Lenti-X 293T细胞(克罗泰克公司(Clontech))，然后在12-18h后更换培养基。在培养基更换后30小时，收集培养基，过滤并储存在-80℃下。

使用自动化系统进行BCMA CAR JNL和JNL筛选报告测定法

对于报告测定法，在96孔板中以自动化小规模方式在HEK293细胞中以两种不同的细胞密度(40,000个细胞(1×H293)或80,000个细胞(2×H293))产生编码BCMA CAR的慢病毒，其中在转染后48小时收获含病毒上清液，无需冷冻即可使用新鲜的上清液来转导Jurkat T细胞报告细胞系。Jurkat NFAT荧光素酶(JNL)报告细胞系是基于急性T细胞白血病系Jurkat。修饰该系以在激活T细胞核因子(NFAT)响应元件的控制下表达荧光素酶。对于用BCMA CAR转导，用50μl新鲜的45μm过滤的含病毒上清液转导10,000个JNL细胞/孔的96孔板。培养平板5天，然后与靶细胞一起共培养。

为了评估BCMA CAR活化JNL细胞的功能性能力，将它们与靶癌细胞一起以不同的效应物与靶细胞的比率(E:T比率)共培养，以通过定量荧光素酶表达来读出它们的活化。对于基于scFv的CAR R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-10、B61-02、Hy03和Hy52进行评估。CD19 JNLCAR细胞用作靶标特异性对照，并且单独的不含靶细胞的培养基用作阴性对照。

将上述五天转导的JNL CAR细胞与BCMA阳性多发性骨髓瘤(MM)细胞系KMS11或NALM6(急性淋巴细胞白血病细胞系)一起共培养，用作BCMA阴性对照。通过流式细胞术评估其余的JNL CAR T细胞的BCMA CAR表达。在384孔板中以4:1、2:1、1:1和0.5:1的效应物与靶标(E:T)比率建立共培养物，并孵育24小时，其后通过Bright-Glo

BCMA CAR T细胞的产生

选择以下8个CAR进行原代T细胞中的CAR表达、稳定性和效果的分析：R1B6、R1F2、R1G5、PI61、B61-10、B61-02、Hy03和Hy52。BCMA CAR T细胞从健康的单采血液成分供体的血液开始产生，这些供体的T细胞(CD4+和CD8+淋巴细胞)通过针对CD3+T细胞的阴性选择获得。通过在T细胞培养基(RPMI1640，10％热灭活的胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素、100μM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mM Hepes和55μM 2-巯基乙醇)中以1:3(T细胞与珠)的比率加入CD3/CD28珠(

通过使用rBCMA_Fc-AF647染色的细胞的流式细胞分析测量第5天和第9天的CAR％和MFI(平均荧光强度)来评估BCMA-CAR表面表达及其稳定性(图2和表17)。第9天最终产物中的BCMA CAR表达在构建体之间各不相同，范围为18％至42.4％，MFI为672至5238。来自PALLAS衍生的克隆R1F2、R1B6和R1G5的构建体以及杂交瘤克隆Hy03，从第5天至第9天显示出CAR减少～30％至50％，而PI61、B61-10和-02以及Hy52就CAR表达的百分比而言相对稳定，但是所有CAR构建体从第5天到第9天显示出MFI减小，这可能是由于第9天静息期T细胞的尺寸较小。CAR T细胞培养物的细胞计数表明，与未转导的T细胞(“UTD”)相比，未检测到携带人scFv的BCMA CAR对细胞正常扩增的能力具有负面影响。

表17.CAR表达分析

评估BCMA CAR重定向T细胞的功能

为了评估BCMA CAR-T细胞的功能性能力，建立了具有BCMA阳性和阴性癌症系的共培养物。将CAR-T细胞解冻，计数，并与靶细胞共培养，以读出它们的杀伤能力和细胞因子分泌。测试BCMA CAR克隆R1B6、R1F2、R1G5、B61-02、B61-10、PI61、Hy03和Hy52。将未转导的T细胞(UTD)用作非靶向T细胞对照。

通过将CART细胞与KMS11-Luc和NALM6-Luc靶细胞以不同的E:T比率共培养20小时来进行CART细胞杀伤。在接种前，将CAR T细胞群标准化为CAR阳性细胞的等价百分比。使用Meso Scale Discovery(MSD；马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD))测量CAR-T细胞与靶细胞的20小时共培养物(效应物与靶标的比率为2.5:1)的上清液中细胞因子IFNγ，并使用已知的标准计算每种细胞因子的结果(单位为pg/ml)。所有测定均从单一来源的供体细胞一式两份进行。杀伤数据显示，所有BCMA CAR克隆均有效杀伤KMS11癌细胞(图3A)。对照靶细胞NALM6未被任何这些BCMA特异性CAR杀伤(图3B)。还测试了这些CAR与KMS11一起培养时产生IFN-γ的能力(图3C)。BCMA CAR R1F2、R1G5和PI61导致产生最高量的IFN-γ。在暴露于对照NALM6细胞后，BCMA CART产生的细胞因子的水平低(图3C)，表明BCMA CAR未导致非特异性活化。

结论

在CAR T细胞的背景下测试新的BCMA结合scFv。在JNL报告测定以及原代T细胞中测定8种CAR：R1B6、R1F2、R1G5、B61-02、B61-10、PI61、Hy03和Hy52。所有八种CAR-T细胞均显示出靶标特异性杀伤。表达R1F2、R1G5或PI61的T细胞在存在靶细胞的情况下产生最高量的IFN-γ。总之，BCMA CAR转移至原代T细胞诱导了抗BCMA CAR反应性，但没有脱靶功能。

等效物

本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容据此通过援引以其全文并入本文。虽然已经参照具体方面披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等效变化。