与L-抗坏血酸特异性结合的适配体及其用途

技术领域

本发明涉及与L-抗坏血酸特异性结合的适配体及其用途。

背景技术

抗氧化物质中作为代表性成分之一的L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)(维生素C(Vitamin C)，以下称为“AA”)由于通过其自由基的中性化的抗氧化活性而在医药、化妆品及食品和饮料产业上被广泛使用。据报道，当用作食品保健品和/或医药活性成分时，AA的优点在于，在由从产业灾害(轮胎及橡胶工厂、化妆品制备工厂)中产生的ZnONPs的吸入导致的急性肺细胞氧化过程中供给添加有AA的饮用水来抑制。在高达数十兆韩元规模的这些产业中主要解决方案的共同点为使用维生素C。

AA由于其抗氧化能力在本质上可通过氧化而容易被分解。影响AA的氧化的主要因素为温度、pH、氧、金属离子、光及酶等。在将AA用作主要成分的产业中，因为这种氧化分解的特性，在产品的储藏期间及效果上都会受到影响，而这是很久以前就开始面临的问题。因此，在这些产业中，不仅对AA

另一方面，促进老化的原因有很多种，但其中活性氧类(Reactive Oxygen[0004]species：ROS)为相当主要原因之一。这种活性氧在能量代谢、免疫反应等中必不可少地生成，而且这还是由外部的有害环境诱发的不可避免的刺激。活性氧的反应性非常大，因此，在体内诱发DNA变性、过度的信号传递以及蛋白质变性等，从而引起对健康产生有害影响的一系列反应。然而，这种有害反应由生物体内存在的抗氧化物质(尿酸(uric acid)、维生素C(vit.C)、维生素E(vit.E)等)或抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、过氧化氢酶(catalse)等)精巧地维持其稳态。但是，由内因性老化引起的抗氧化系统的衰老和由持续性的有害刺激引起的活性氧的堆积破坏这种平衡而危害健康并促进老化，还诱发皮肤疾病、皮肤癌、动脉硬化及血栓等各种疾病(Laure Rittie et al.，Ageing Research Reviews，1，705-720，2002；Cutler RG，Annals of the New York Academy of Sciences，1055，93-135，2005)。

因此，对抑制活性氧类的形成或者去除所形成的活性氧类的抗氧化物质的关注日益增加。抗氧化物质可分为人体内自然存在的抗氧化物质和从外部投入的抗氧化物质，人体内自然存在的抗氧化物质为超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione)、过氧化物酶(peroxidase)及过氧化氢酶(catalase)等酶，从外部投入的抗氧化物质为山奈酚(kaempferol)、儿茶素(catechin)及染料木素(genistein)等植物营养素(phytochemical)；维生素E、维生素C及β-胡萝卜素；以及硒等矿物质。

细胞由于通过太阳光照射的紫外线A(UVA)和紫外线B(UVB)、公害物质、应激、吸烟、饮酒、脂肪性食物等而产生的自由基(free radical)和活性氧(oxygen free radical)受到攻击，若不能够从这种物质适当保护细胞，则细胞会老化或凋亡。皮肤因这种物质而导致胶原蛋白或弹性蛋白等物质的生成减少或者变形，因此皮肤会失去弹性产生皱纹。为了防止这种现象，将包含维生素(Vitamin)A、维生素C、维生素E等抗氧化物质的制剂涂敷于皮肤来使它们吸收到皮肤内，从而防止由这些有害活性物质引起的氧化对防止皮肤的老化来说很重要。但是，合成维生素C在空气中容易被氧化而失去其抗氧化作用，由于这种问题，在储藏期间长的多种剂型的制备上存在问题。

并且，还原力非常高的维生素C对氧化电位高的物质非常敏感地反应而维生素C被急剧氧化。维生素C被氧化而破坏其功效是公知的事实。氧化电位高的水对维生素C非常敏感地反应而被急剧氧化。

因此，对抑制包含维生素C的抗氧化物质的氧化的新型方法或物质的必要性是长期存在的。

并且，相比于以往的方法，利用适配体防止抗氧化物质的氧化的方法接近于安全且创新的新概念，可将此方法适用于各种产业来产生最大化的效果。尤其，这会成为将以往的以化学(Chemical)为基础的化妆品、营养保健品、食品市场开创性地改变为以DNA(BIO)为基础的市场的导火线。今后，这将会提供DNA市场的爆发性增长和开创性解决方案。

现有专利文献

韩国公开专利第10-2018-0054508号

发明内容

技术问题

本发明根据如上所述的必要性而提出，本发明的目的在于，提供通过与维生素C特异性结合来防止氧化的新型适配体。

本发明的另一目的在于，提供上述新型适配体的用途。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供通过与L-抗坏血酸结合来抑制氧化的单链DNA适配体，其特征在于，上述单链DNA适配体具有一个以上茎环(stem-loop)结构，上述茎环结构中的茎结构的末端具有CG键，环结构的两侧起始部分为G或C且相同的碱基相向。

本发明提供具有二级结构的单链DNA适配体，上述二级结构为在上述茎环结构中的茎结构的末端具有CG键且环结构的起始部分中的一个碱基G或C被T取代的结构。

本发明的一实例中，优选地，上述适配体由序列1至序列29所示的碱基序列中的一个组成，更优选地，上述适配体由序列1、序列4及序列5及序列17至序列29中记载的碱基序列中的一个组成，但并不限定于此。

并且，本发明提供包含上述本发明的适配体作为有效成分的抗氧化用组合物。

并且，本发明提供通过上述本发明的适配体来处理维生素C来抑制上述维生素C的氧化的方法。

发明的效果

通过本发明可知，本发明的适配体具有防止维生素C氧化的效果，利用与维生素C(ascorbic acid)选择性结合的适配体维持维生素C的还原状态来长期维持其抗氧化功能，从而可利用于多种剂型的功能性化妆品和口服用营养保健品(dietary supplements)及食品等，由于利用与维生素C选择性结合的适配体，因此，仅用少量的维生素C也可以期待持续且极大化的抗氧化效果，利用与维生素C(ascorbic acid)选择性结合的适配体维持维生素C等生理活性成分的还原状态来长期维持其抗氧化功能，从而可利用于多种健康饮料、抗氧化饮料及抗氧化食品等。

并且，相比于以往的方法，利用适配体防止抗氧化物质的氧化的方法接近于安全且创新的新概念，可将此方法适用于各种产业来产生效果。尤其，这会成为将以往的以化学(Chemical)为基础的化妆品、营养保健品、食品市场开创性地改变为以DNA(BIO)为基础的市场的导火线。今后，这将会提供DNA市场的爆发性增长和开创性解决方案。

附图说明

图1为利用于单链DNA文库分离的12％的非变性凝胶(native gel)电泳照片。切断由绿色四边形表示的条带并通过碎胶浸泡方法进行纯化；

图2为用于确认单链DNA的抗坏血酸(ascorbic acid)抗氧化效果的OPDA测定曲线图。在序列1、序列4及序列5的单链DNA中观察到抗氧化效果；

图3为筛选出的单链DNA的微量热泳动(Microscale Thermophoresis，MST)测定结果曲线图。通过Kd(结合解离常数)测定结果确认到，在序列1、序列4及序列5的单链DNA中的结合力为纳米摩尔(Nano molarity，nM)水平；

图4为利用M-fold程序的适配体的二级折叠结构。上述二级折叠结构为序列1、序列4及序列5的茎环结构，具有茎结构的末端具有CG键并且环结构的两侧起始部分为G或C且相向的共同特征(红色四边形)；

图5为包含茎环结构的任意13个序列的OPDA测定曲线图。在包含特定茎环结构的13个序列中观察到抗坏血酸的抗氧化效果；

图6为确认到抗氧化效果的序列1与序列4、序列17、序列18的OPDA测定比较曲线图。观察到由任意序列合成的序列17的适配体序列的抗氧化效果最大；

图7为确认到抗氧化效果的序列17和序列18的MST测定结果曲线图。

具体实施方式

以下，通过非限定性实施例详细说明本发明。但是，下述实施例仅用于例示本发明而记载，本发明的范围并不限定于下述实施例来解释。

为了筛选与L-抗坏血酸特异性结合的单链DNA适配体，利用SELEX方法制备单链DNA文库。将单链DNA文库序列设计成在5’和3’分别包含15个特定引物序列并具有30个随机序列来使其由共60个碱基构成。

所设计的上述单链DNA文库如下所示：

5’-ATGCGGATCCCGCGC-N30-GCGCGAAGCTTGCGC-3’(单链DNA文库序列；序列30)。

将所合成的上述序列30碱基序列的单一低聚核苷酸片段利用为模板，通过不对称PCR过程扩增单链DNA文库。为了进行不对称PCR而制备了引物(Primer)1和引物2.

上述引物1和引物2的碱基序列如下所示：

5’-ATGCGGATCCCGCGC-3’(引物1；序列31)，

5’-GCGCAAGCTTCGCGC-3’(引物2；序列32)。

为了大量扩增单链DNA，以10∶1的比例混合引物1和引物2来进行不对称PCR。不对称PCR反应通过在94℃的温度下反应5分钟后在94℃的温度下反应40秒钟、在55℃的温度下反应40秒钟、在72℃的温度下反应30秒钟的条件下反复循环45次后，在72℃的温度下反应10分钟来扩增。在2.5％的琼脂糖凝胶中对所扩增的PCR产物进行电泳来先用肉眼确认条带后，通过碎胶浸泡方法(Crush and Soak)进行分离。在12％的非变性凝胶中对PCR产物进行电泳来切断单链DNA条带后，溶解于碎胶浸泡缓冲液(500mM的NH

为了筛选通过与L-抗坏血酸特异性结合来抑制氧化的单链DNA适配体，适用了利用石黑烯的SELEX(rGO-SELEX)技术(Lee，A.Y.，Ha，N.R.，Jung，I.P.，Kim，S.H.，Kim，A.R.，&Yoon，M.Y.(2017).Development of a ssDNA aptamer for detection of residualbenzylpenicillin.Analytical biochemistry，531，1-7.)。

适用石黑烯的SELEX方法如下所示。

首先，为了去除与石黑烯非特异性结合的单链DNA，在1.5ml的试管中将200pmol的单链DNA文库和4mg/mL的石黑烯与结合缓冲液(Binding buffer)(20mM的Tris，pH 8.0)混合并反应30分钟后，通过进行两次离心分离来去除上清液。对剩余的单链DNA和石黑烯的混合物处理抗坏血酸并反应30分钟，通过不对称PCR过程对与抗坏血酸结合的单链DNA进行扩增。在12％的非变性凝胶中通过碎胶浸泡(Crush and Soak)方法分离单链DNA来获得第一次SELEX产物。反复进行上述过程五次，将反复进行第五次的SELEX产物用作模板来进行对称PCR。通过二代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术对所扩增的双链DNA片段进行序列分析来确认以最多频率分析的序列1至序列16的16个序列。

通过邻苯二胺(O-phenylenediamine，OPDA)分析法分析基于适配体的L-抗坏血酸的抗氧化效果。利用作为L-抗坏血酸的氧化的结构的DHA通过与OPDA结合来产生荧光发色的原理分析基于适配体的抗坏血酸的抗氧化效果(Vislisel，J.M.，Schafer，F.Q.，&Buettner，G.R.(2007).A simple and sensitive assay for ascorbate using a platereader.Analytical biochemistry，365(1)，31-39.)。

OPDA分析过程如下所示。

根据在SELEX产物中通过NGS技术分析的序列的频率和折叠结构合成16个序列。将所而合成的单链DNA在95℃的温度下加热5分钟并在常温下反应10分钟来形成折叠结构后，将1μM的单链DNA和5mM的抗坏血酸混合并反应30分钟。之后，添加双氧水(H

为了确认与L-抗坏血酸结合的适配体的结合力，利用微量热泳动方法测定结合解离常数(Kd)。在单链DNA的5’附着Cy5的荧光并通过对在热梯度条件下根据结合力产生的信号差异进行分析来测定结合的强度(Entzian，C.，&Schubert，T.(2016).Studying smallmolecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis(MST).Methods，97，27-34.)。

将单链DNA适配体的浓度固定在5nM并使抗坏血酸的浓度在50μM以1.53nM的范围形成浓度梯度来插入于16个试管后反应15分钟。使经反应的单链DNA和L-抗坏血酸吸入至扫描毛细管(4μl/试管)后，利用Mnolith NT.11仪器进行测定。通过上述OPDA方法确认到的序列1、序列4及序列5的适配体的Kd值分别为280nM、149nM及685nM，因此，确认到它们具有纳米摩尔水平的结合力(图3)。

利用M-fold程序确认所确认到结合力的序列1、序列4及序列5的单链DNA适配体的二级结构(Scondary structure)。经确认，序列1能够以两种形态形成二级结构，序列4及序列5分别能够以三种、两种形态形成茎环结构。

这三种(序列1、序列4及序列5)的单链DNA适配体具有茎环结构中茎结构的末端具有CG键并且环结构的两侧起始部分为G或C且相向的共同特征(图4，红色四边形)。所确认到的三种适配体的结构形成具有-3.65(kcal/mol)、-1.64(kcal/mol)、-0.86(kcal/mol)的吉布斯自由能值的稳定的结构。

基于通过适配体的折叠结构分析确认的特定结构序列来设计具有32个碱基序列的任意序列，由此合成单链DNA。用茎环结构将10个碱基序列构成为单位体并以在5’和3’两末端各包含1个至2个的方式制备任意单链DNA。通过OPDA测定法确认共制备成13种的序列17至序列29的单链DNA的抗氧化效果(图5)。

13个任意序列均对L-抗坏血酸具有抗氧化效果，在5’和3’两末端具有茎环结构的序列17的单链DNA适配体在共29种序列(与任意序列合成的13个序列和通过SELEX过程筛选的16种序列)中的抗氧化效果最好(图6)。

通过微量热泳动分析对任意序列(序列17至序列29)中被确认为抗氧化效果好的两种序列确认适配体的结合力。通过OPDA方法确认的序列17和序列18的Kd值分别为729nM和289nM(图7)。与通过OPDA方法确认的序列不同地，序列17的Kd值高认为是序列17的适配体的结合力本身低但与-OH官能团更加特异性结合。

表1

表1为示出本发明的适配体序列的表。