长链非编码RNA AC073352.1作为乳腺癌诊断标志物和治疗靶点的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种长链非编码RNA AC073352.1在乳腺癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用。

背景技术

乳腺癌是世界女性中最常见的恶性肿瘤之一，也是导致女性癌症死亡的主要原因，其发病率和死亡率逐年上升。2019年最新数据统计表明，全球每年有160余万人被诊断为乳腺癌且死亡人数超过40万，且每年以2%左右的速度递增，位列全球女性肿瘤发病率第一位，严重威胁女性生命健康。乳腺癌在我国女性恶性肿瘤中，发病率高居榜首且年龄标化率呈现上升的趋势，每年乳腺癌发病人数约为30万，以30-59岁女性为高发，对家庭和社会造成很大的负担，所以对乳腺癌的防治尤为重要。乳腺癌的发生发展是一个多因素高异质性的复杂过程，转移与乳腺癌患者死亡密切相关，90%以上的死亡病例都是转移造成的，也是导致乳腺癌预后不良的重要因素。乳腺癌的早期诊断和及时正确的治疗，直接影响乳腺癌患者的预后。因此，探究一种新型高灵敏度和高特异度的乳腺癌诊断生物标志物和治疗靶点，提高乳腺癌的早期诊出率，是近年来关注的热点和难点。

长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸且编码蛋白的潜力有限的RNA分子。根据在基因组中的相对位置及方向，lncRNA主要被分成以下几种：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因间lncRNA和基因内lncRNA。研究表明，lncRNA具有特定的空间结构和高度保守的序列原件，广泛存在于细胞的各个层面，其在转录、转录后、翻译及翻译后水平等多种层面调控重要的病理生理过程，如在染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA代谢和表观遗传特征的调节。近年研究发现，lncRNA广泛参与各种生物学过程，例如调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭等。文献报道，异常表达的lncRNAs与人类各种疾病尤其是恶性肿瘤（胃癌、乳腺癌、肝癌等）的发生发展、转移及耐药等过程密切相关。这些特征显示lncRNA在生物学过程中发挥着重要作用，并逐渐成为临床肿瘤诊断、治疗及预后的全新靶点。

早期乳腺癌通常缺乏明显的临床体征，主要通过钼靶X线、彩色多普勒超声等影像学检查获得早期诊断，但对于早期乳腺癌的诊断特异性和敏感性并不高。基于lncRNA在乳腺癌中的异常表达及生物学功能，确定新型lncRNA作为乳腺癌诊断生物标志物及治疗靶点并探究lncRNA在乳腺癌中的生物学调节功能，对于乳腺癌的诊断及治疗具有潜在的临床意义。

发明内容

本发明针对传统乳腺癌诊断和治疗中存在的问题提出一种新型的长链非编码RNAAC073352.1在乳腺癌诊断生物标志物及治疗靶点中的应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

lncRNA AC073352.1作为乳腺癌诊断生物标志物及治疗靶点的应用，所述lncRNA的Gene ID为ENSG00000272662.1，来源于人类第3号染色体。

来自可能患有乳腺癌对象的样本中lncRNA AC073352.1的表达量，其中较高表达量的lncRNA AC073352.1与所述对象患有乳腺癌的可能性增加及预后不良相关。

本发明提供乳腺癌诊断生物标志物lncRNA AC073352.1在制备乳腺癌诊断产品中的应用。

本发明提供特异性识别AC073352.1的引物对，其碱基序列为：TGGCAGGTCTTCCTAAGGTG和AGCAGAGGTTGTAGTGACGG。

本发明提供样本总RNA提取、qRT-PCR、实时定量PCR检测AC073352.1的表达水平的试剂在乳腺癌诊断中的应用。

具体步骤包括总RNA提取（飞捷fast2000试剂盒），β-actin（CATGTACGTTGCTATCCAGGC和CTCCTTAATGTCACGCACGAT）用作内部对照，使用SYBR Green PCRMaster Mis进行所有qRT-PCR反应。

AC073352.1作为乳腺癌分子治疗靶点在调控细胞迁移和侵袭中的应用。

本发明的第一个目的是提供一个乳腺癌潜在诊断生物标志物和治疗靶点，其为lncRNA AC073352.1( ENSG00000272662.1|Chromosome 3: 119497678-119498181) 。

本发明的第二个目的是提供特异性识别lncRNA AC073352.1的引物对，包括上游引物和下游引物。上游引物的核苷酸序列为TGGCAGGTCTTCCTAAGGTG；下游引物的核苷酸序列为AGCAGAGGTTGTAGTGACGG。

本发明的第三个目的是公开lncRNA AC073352.1在乳腺癌患者血清中的表达情况，以及评估lncRNA AC073352.1诊断能力的ROC曲线。

本发明的第四个目的是公开lncRNA AC073352.1在乳腺癌细胞中的定位及发挥的生物学功能，探针序列为 CCAGCAGAACTGACAAGGTACAAACGGA。

本发明提供了lncRNA AC073352.1在乳腺癌诊断及治疗方面的应用。本发明公开了lncRNA AC073352.1作为一种新型潜在的乳腺癌诊断生物标志物和治疗靶点。本发明从组织标本库中选取乳腺癌及癌旁组织各6例，质检合格后进行高通量芯片分析，差异表达的lncRNA与TCGA分析数据进行联合分析，筛选出2个在乳腺癌组中显著高表达且与预后相关的候选lncRNA分子。在血清中通过qRT-PCR验证发现lncRNA AC073352.1在乳腺癌中表达显著上调，受试者工作曲线（ROC）显示lncRNA AC073352.1具备良好的诊断乳腺癌的潜能，且高表达的lncRNA AC073352.1与患者的不良预后相关；功能实验结果显示lncRNAAC073352.1可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1.首次发现lncRNA AC073352.1可作为乳腺癌诊断生物标志物和药物治疗靶点。

2.与健康人相比，lncRNA AC073352.1在乳腺癌患者的血清中显著上调。

3.ROC曲线显示lncRNA AC073352.1具备良好的诊断乳腺癌的能力。

4.本发明的结果表明lncRNA AC073352.1在乳腺癌细胞质和胞核中均存在，干扰lncRNA AC073352.1可以抑乳腺癌细胞的迁移和侵袭，表明lncRNA AC073352.1在乳腺癌的发生发展中发挥促癌基因的作用，为临床治疗乳腺癌提供新的靶点。

附图说明

图1为lncRNA芯片与TCGA数据挖掘分析结果的交集热图，显示乳腺癌及癌旁组织中差异表达的lncRNA的分布（fold change＞2或＜0.5, p<0.001）。

图2为TCGA公共数据库中lncRNA AC073352.1在乳腺癌组织中的与患者预后相关情况。Kaplan-Meier 分析lncRNA AC073352.1与乳腺癌患者预后关系图。

图3为使用lncRNA AC073352.1的引物对乳腺癌患者和健康体检者血清中lncRNAAC073352.1的表达量检测的结果图。***代表p值<0.001。

图4为评价lncRNA AC073352.1诊断乳腺癌潜能的ROC曲线图。

图5为使用lncRNA AC073352.1的引物对乳腺癌细胞系及正常乳腺上皮细胞中lncRNA AC073352.1表达量的检测结果图。

图6为RNA荧光原位杂交的结果图，鉴定出lncRNA AC073352.1的位置（原图中的，蓝色为细胞核Dapi，红色为lncRNA AC073352.1标记，调整成黑白图片后，颜色不显示）。

图7为lncRNA AC073352.1小干扰RNA（siRNA）在MDA-MB-468和MCF-7两种细胞系中转染敲减效率的qRT-PCR验证图。siNC代表阴性对照组；si AC073352.1-1，si AC073352.1-2分别代表转染两种靶向lncRNA AC073352.1的siRNA组。***代表p值<0.001。

图8为敲减lncRNA AC073352.1后乳腺癌细胞MDA-MB-468迁移与侵袭能力变化的统计结果图。***代表p值<0.001。

图9为敲减lncRNA AC073352.1后乳腺癌细胞MCF-7迁移与侵袭能力变化的统计结果图。*代表p值<0.05,***代表p值<0.001。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

本实施例提供lncRNA AC073352.1在乳腺癌中的表达、预后及诊断效能的情况验证。

1、实验材料与方法

1.1组织

收集乳腺癌及相应癌旁正常新鲜组织，样本收集标准为： ①病理学检查确诊为乳腺癌； ②未合并其他恶性肿瘤或疾病； ③术前未接受任何药物或放化疗等治疗。将术后组织用预冷的PBS清洗组织表面残余血液，迅速放入液氮速冻，转存于-80℃冰箱。

1.2血清

收集乳腺癌患者均为初次入院接受治疗的患者，术前未曾接受任何治疗，术后经病理检查确认。健康体检者排除其他肿瘤疾病。所有血清样本均在接受任何药物治疗前或术前取得。血清标本通过4℃离心获得，存于-80℃冰箱。

1.3 lncRNA 差异基因表达谱

从组织标本库中选取乳腺癌及癌旁正常组织各6例。经质检合格后进行高通量芯片分析，并结合TCGA数据挖掘分析对乳腺癌及正常组织数据进行比对（设置差异显著基因的默认阈值为：p≤0.001且Fold change≤0.5或≥2.0），得到lncRNA差异基因表达谱，见图1。

1.4 RNA提取及荧光实时定量PCR（qRT-PCR）

采用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA.USA)提取组织总RNA；采用丙型肝炎核酸纯化诊断试剂盒（QIAGEN, 深圳）提取血清总RNA；采用RNA提取试剂盒fast2000（飞捷，上海）提取细胞总RNA。逆转录试剂盒采用PrimeScript

表1 qRT-PCR使用的引物序列

表2 qRT-PCR使用的体系

1.5数据处理与分析

使用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，使用GraphPad Prism 7.0软件做统计图。根据需要采用t检验或Wilcoxon秩和检验比较样本间或组间差异，p<0.05被认为具有统计学差异。实验数据来源于三次独立实验，数据以均数±标准差表示。lncRNA的诊断效能采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析表示。

2、实验结果

2.1在实施例1中，将高通量lncRNAs芯片检测得到的乳腺癌及癌旁正常组织lncRNAs差异基因与TCGA数据分析得到的乳腺癌及正常组织的差异lncRNAs进行比对，得到显著差异表达的lncRNA，见图1。其中，lncRNA AC073352.1在乳腺癌中表达显著上调，且其高表达与患者不良预后显著相关（p=0.027），见图2。

2.2在实施例1中，本发明从血清标本库中选取了乳腺癌患者及健康体检者的血清样本各43例并提取血清总RNA。结果显示，lncRNA AC073352.1在乳腺癌患者血清中显著高表达，见图3。ROC曲线下面积AUC为0.847，表明其对乳腺癌具有较好的诊断价值，见图4。

实施例2

本实施例探讨干扰lncRNA AC073352.1的表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。

1、实验材料与方法

1.1 细胞系及培养

人乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF-7以及人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，均购买于中国科学院上海生命科学研究院。乳腺癌细胞MDA-MB-468和MCF-7培养在含有10%胎牛血清（Gibco）的DMEM（Gibco）培养基中。正常乳腺上皮细胞MCF-10A培养在含有10%马血清的DMEM/F12（迈晨）的培养基中，并添加100ng/ml的霍乱毒素、20ng/ml EGF、0.5μg/ml的氢化可的松和10μg/ml的胰岛素。所有细胞系都培养在37℃和5%CO

1.2 RNA荧光原位杂交

采用谷歌生物科技公司（武汉）设计合成的荧光原位杂交探针及试剂盒，经过细胞固定-预杂交-杂交-封片完成，使用尼康共聚焦显微镜观察荧光位置，原位杂交探针序列SEQID NO.5见表3。

表3 RNA荧光原位杂交探针序列

1.3 细胞转染

靶向lncRNA AC073352.1的特异性小干扰RNA（siRNA）及阴性对照（siNC）由吉玛基因（上海）设计合成；利用Lipofectamine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）将siRNA转染入乳腺癌细胞MDA-MB-468和MCF-7中；siRNA序列见表4。

表4 siRNA序列

1.4 细胞迁移实验

将24孔细胞池放入24孔板中，胰酶消化转染的细胞，以5×10

1.5 细胞侵袭实验

将24孔细胞池放入24孔板中，上室加入60μl基质胶（BD Biosciences），置于细胞培养箱中1h待胶凝固。胰酶消化转染的细胞，以1×10

1.6 RNA提取及荧光实时定量PCR（qRT-PCR）

同实施例1

1.7 数据处理与分析

同实施例1

2.实验结果

2.1在实施例2中，本发明检测人乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞中lncRNAAC073352.1的表达，显示lncRNA AC073352.1在乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF-7中的表达显著高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A，见图5。

2.2 在实施例2中，本发明在人乳腺癌细胞MDA-MB-468中的RNA荧光免疫原位杂交实验结果显示，lncRNA AC073352.1在细胞质和细胞核中均表达，主要定位于细胞质，见图6。

2.3 在实施例2中，本发明在人乳腺癌细胞MDA-MB-468和MCF-7中转染siAC073352.1-1与siAC073352.1-2后，能显著下调乳腺癌细胞中lncRNA AC073352.1的表达水平，见图7。***代表p值<0.001。

2.4 在实施例2中，本发明在人乳腺癌细胞MDA-MB-468和MCF-7中转染siAC073352.1-1与siAC073352.1-2，细胞实验结果显示敲减lncRNA AC073352.1能显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，见图8和图9。*代表p值＜0.05，***代表p值<0.001。

上述结果表明lncRNA AC073352.1在乳腺癌中组织、血清及细胞中高表达且与预后不良相关，ROC曲线显示其有较高的诊断效能；细胞定位显示lncRNA AC073352.1主要表达于细胞质中，体外实验显示lncRNA AC073352.1促进乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力，表明lncRNA AC073352.1在乳腺癌中发挥促癌基因的作用。lncRNA AC073352.1有望成为一种新型乳腺癌诊断生物标志物和治疗靶点。

以上所述的实施例是示例性的，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的而技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均视为本发明的保护范围内。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> 长链非编码RNA AC073352.1作为乳腺癌诊断标志物和治疗靶点的应用

<130> 1

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tggcaggtct tcctaaggtg agcagaggtt gtagtgacgg 40

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<212> DNA

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ggucuuccua agguggauut taauccaccu uaggaagacc ttgcuaacau augcuucgaa 60

gttcuucgaa gcauauguua gctt 84

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccagcagaac tgacaaggta caaacgga 28