乳铁蛋白在促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖中的应用

技术领域

本发明涉及乳铁蛋白在促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖中的应用，属于益生 菌技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是转铁蛋白家族中的一种铁结合糖蛋白，存在 于人体的乳汁和各种分泌液中，以母乳中的含量最高。LF具有抗微生物、促进 肠道发育、促进铁吸收、免疫调节等功能，乳铁蛋白的抗微生物活性对肠道微 生物有有益影响，因为它的抑菌作用不会损害产生乳酸细菌的生长，因为该类 细菌对铁的需要量较低。LF能促进胃肠道中的有益菌，如双歧杆菌、乳酸菌的 增殖，同时保护肠道不被有害细菌损伤，改善肠道微生物菌群，维持肠道菌群 的平衡。

益生菌可以维持健康的胃肠道微生态，促进slgA分泌，增强肠道免疫肠屏 障功能，帮助机体清除致病微生物和潜在过敏性抗原。

将乳铁蛋白与益生菌结合可以提高免疫力，然而在体外实验中，不同浓度 乳铁蛋白对益生菌的增殖作用不同。文献(胡志和，王昌禄，李斌。乳铁蛋白 及乳铁素对嗜酸乳杆菌生长影响的研究[J].食品科学，2007，28(10)：413)公 开了：在恒温37℃培养下，乳铁蛋白浓度在1.0～3.0mg/mL范围内，随着乳铁蛋 白浓度的增加，其对嗜酸乳杆菌的生长促进作用逐渐增强；当乳铁蛋白的添加 量为2.5mg/ml时，对嗜酸乳杆菌的生长促进作用达到最大。文献(Influence of bovine lactoferrin on selected probiotic bacteria andintestinal pathogens,2009)公开 了：在0～40mg/mL浓度下，牛乳铁蛋白噬酸乳杆菌DPC201、植物乳杆菌 DPC206、乳酸片球菌DPC209、罗伊氏乳杆菌DPC16、乳双歧杆菌HN019和鼠 李糖乳杆菌HN001没有抑制作用。文献(Woodman et al.2018：Effects of lactoferrinon neonatal pathogens and Bifidobacterium breve in human breast milk) 公开了：在5mg/mL牛乳铁蛋白的浓度下，短双歧杆菌的生长不受影响；但是， 在50mg/mL的浓度下，短双歧杆菌的生长受到明显的抑制。

可见，50mg/mL浓度的乳铁蛋白对短双歧杆菌的生长有明显抑制作用。现 有科学文献报道：低浓度的乳铁蛋白对双歧杆菌有促进作用，而高浓度 (50mg/mL)对短双歧杆菌有抑制作用。作为一种母乳中天然存在，并促进婴 幼儿生长发育的关键蛋白，乳铁蛋白在与益生菌联合作用，改善婴幼儿免疫功 能，促进婴幼儿健康成长。但现有技术缺乏在高浓度乳铁蛋白作用下，瑞士乳 杆菌、婴儿双歧杆菌的生长情况的研究以及应用。

本发明通过体外实验探究0.05～50mg/mL乳铁蛋白对婴儿双歧杆菌、瑞士乳 杆菌增殖的作用效果，同时通过加入益生元促进益生菌增殖，以实现综合提高 机体免疫。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供乳铁蛋白在促进双 歧杆菌、乳酸杆菌增殖中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：乳铁蛋白在促进双歧杆菌、 乳酸杆菌增殖中的应用，所述双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis BB12)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis R33)、两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidumR71)、乳双歧杆菌(Lactobacillus lactis HN019, Lactobacillus lactis Bi-07)、或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve M-16V)，所述 乳酸杆菌为瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus R52)或鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus LGG,Lactobacillusrhamnosus HN001)。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述乳铁蛋白的浓度为0.05～50 mg/mL。发明人通过试验研究发现，乳铁蛋白的浓度为0.05～50mg/mL时，对 双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖具有促进作用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述乳铁蛋白的浓度为50mg/mL。 发明人通过试验研究发现，乳铁蛋白的浓度为50mg/mL时，对双歧杆菌、乳酸 杆菌增殖的促进作用最强。

第二方面，本发明提供了一种促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖的方法，所述 方法使用的培养液中包含乳铁蛋白，所述双歧杆菌为婴儿双歧杆菌、两歧双歧 杆菌、乳双歧杆菌或短双歧杆菌，所述乳酸杆菌为瑞士乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。

本发明所述的促进双歧杆菌、乳酸杆菌增殖的方法为本领域常规的益生菌 增殖方法。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述乳铁蛋白的浓度为0.05～50 mg/mL。发明人通过试验研究发现，当培养液中乳铁蛋白的浓度为0.05～50 mg/mL时，对双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖具有促进作用。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述乳铁蛋白的浓度为50mg/mL。 发明人通过试验研究发现，当培养液中乳铁蛋白的浓度为50mg/mL时，对双歧 杆菌、乳酸杆菌增殖的促进作用最强。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述方法使用的培养液中，最终菌 量与乳铁蛋白用量之比为1:0.005～1：5。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述方法使用的培养液中还包含低 聚果糖、低聚半乳糖、β-葡聚糖和/或人乳低聚糖。发明人通过试验研究发现， 当培养液中还包含低聚果糖、低聚半乳糖、β-葡聚糖和/或人乳低聚糖时，能进 一步促进双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述人乳低聚糖为2’-岩藻糖基乳 糖(2’-FL)、3’-岩藻糖基乳糖、乳糖-二盐藻四糖、乳糖-N-盐藻基戊糖I、乳 糖-N-盐藻基戊糖II、乳糖-N-盐藻基戊糖III、乳糖-N-四糖、乳酰-N-新四糖、3’- 唾液乳糖、6’-唾液乳糖、唾液酸基乳糖基-N-四糖、二唾液酸基乳糖基-N-四糖 中的至少一种。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述低聚果糖、低聚半乳糖的浓度 为30mg/mL，所述β-葡聚糖和/或人乳低聚糖的浓度为0.1～50mg/mL。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述方法使用的培养基为MRS液体 培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明研究发现0.05～50mg/mL乳 铁蛋白对双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖具有促进作用，在此基础上，低聚果糖、 低聚半乳糖、β-葡聚糖和/或人乳低聚糖的加入能进一步促进双歧杆菌、乳酸杆 菌的增殖。本发明的研究结果为乳铁蛋白与益生菌结合以综合提高机体免疫提 供了研究方向。

附图说明

图1为瑞士乳杆菌R52与乳铁蛋白的吸光值变化图(0-24h)。

图2为瑞士乳杆菌R52、低聚果糖、低聚半乳糖与乳铁蛋白的吸光值变化图 (0-24h)。

图3为瑞士乳杆菌R52、2’-岩藻糖基乳糖与乳铁蛋白的吸光值变化图 (0-24h)。

图4为瑞士乳杆菌R52与乳铁蛋白培养24h后的OD增值统计图。

图5为瑞士乳杆菌R52、低聚果糖、低聚半乳糖与乳铁蛋白培养24h后的 OD增值统计图。

图6为瑞士乳杆菌R52、2’-岩藻糖基乳糖与乳铁蛋白培养24h后的OD增 值统计图。

图7为婴儿双歧杆菌R33与乳铁蛋白的吸光值变化图(0-24h)。

图8为婴儿双歧杆菌R33、低聚果糖、低聚半乳糖与乳铁蛋白的吸光值变化 图(0-24h)。

图9为婴儿双歧杆菌R33与乳铁蛋白培养24h后的培养24h后的OD增值 统计图。

图10为婴儿双歧杆菌R33、低聚果糖、低聚半乳糖与乳铁蛋白培养24h后 的OD增值统计图。

图11为动物双歧杆菌BB12与乳铁蛋白的吸光值变化图(0-24h)。

图12为动物双歧杆菌BB12、低聚果糖、低聚半乳糖与乳铁蛋白的吸光值 变化图(0-24h)。

图13为动物双歧杆菌BB12与乳铁蛋白培养24h后的OD增值统计图。

图14为动物双歧杆菌BB12、低聚果糖、低聚半乳糖与乳铁蛋白培养24h 后的OD增值统计图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对 本发明作进一步说明。

实施例1

1.实验方案

空白组：MRS肉汤，不加任何原料及益生菌；

对照组：瑞士乳杆菌R52菌液，婴儿双歧杆菌R33菌液，动物双歧杆菌BB12 菌液；

实验组：

(1)瑞士乳杆菌R52：R52菌液+0.05mg/ml乳铁蛋白、R52菌液+25mg/ml 乳铁蛋白、R52菌液+50mg/ml乳铁蛋白、R52菌液+50mg/ml乳铁蛋白+30mg/ml 低聚果糖、R52菌液+50mg/ml乳铁蛋白+30mg/ml低聚半乳糖、R52菌液+50mg/ml 乳铁蛋白+0.1mg/ml2’-岩藻糖基乳糖、R52菌液+50mg/ml乳铁蛋白+25mg/ml 2’- 岩藻糖基乳糖、R52菌液+50mg/ml乳铁蛋白+50mg/ml 2’-岩藻糖基乳糖。

(2)婴儿双歧杆菌R33：R33菌液+0.05mg/ml乳铁蛋白、R33菌液+25mg/ml 乳铁蛋白、R33菌液+50mg/ml乳铁蛋白、R33菌液+50mg/ml乳铁蛋白+30mg/ml 低聚果糖、R33菌液+50mg/ml乳铁蛋白+30mg/ml低聚半乳糖。

(3)动物双歧杆菌BB12：BB12菌液+0.05mg/ml乳铁蛋白、BB12菌液+ 25mg/ml乳铁蛋白、BB12菌液+50mg/ml乳铁蛋白、BB12菌液+50mg/ml乳铁蛋 白+30mg/ml低聚果糖、BB12菌液+50mg/ml乳铁蛋白+30mg/ml低聚半乳糖、 BB12菌液+50mg/ml乳铁蛋白+0.1mg/ml 2’-岩藻糖基乳糖、BB12菌液+50mg/ml 乳铁蛋白+25mg/ml 2’-岩藻糖基乳糖、BB12菌液+50mg/ml乳铁蛋白+50mg/ml 2’-岩藻糖基乳糖。

2.实验过程

(1)制备低聚果糖(FOS)溶液、低聚半乳糖(GOS)溶液，使得其加到 培养溶液后最终浓度均为30mg/mL；制备2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)溶液，使 得其加到培养溶液后最终浓度均为0.1mg/mL，25mg/mL,50mg/mL.

(2)取婴儿双歧杆菌R33、瑞士乳杆菌R52、动物双歧杆菌BB12三种纯 菌粉配制成三种菌液；

(3)制备乳铁蛋白(LF)溶液，使得其加到培养溶液后最终浓度分别为 0.05mg/mL、25mg/mL、50mg/mL，使得最终菌量与乳铁蛋白添加量的比值分别 为1：0.005、1:2.5、1：5；

(4)无菌操作条件下，取灭菌的8mL MRS液体培养基，分别加入1mL菌 液及1mL乳铁蛋白溶液；取灭菌的7mL MRS液体培养基，分别加入1mL菌液， 1mL乳铁蛋白溶液及1mL低聚果糖溶液或1mL低聚半乳糖溶液；

(5)测定初始的吸光值，然后放进厌氧箱里，37℃恒温培养；培养过程中 测定不同时间的吸光值。每个实验做平行，取测定的平均值为最终结果，结果 如表1所示。瑞士乳杆菌R52的吸光值变化图(0-24h)如图1～3所示，瑞士乳 杆菌R52组培养24h后的OD增值如图4～6所示，婴儿双歧杆菌R33吸光值变 化图(0-24h)如图7～8所示，婴儿双歧杆菌R33组培养24h后的OD增值如图 9～10所示，动物双歧杆菌BB12的吸光值变化图(0-24h)如图11～12所示，动 物双歧杆菌BB12组培养24h后的OD增值如图13～14所示。

表1

由表1和图1～6可知，瑞士乳杆菌R52加入乳铁蛋白后比瑞士乳杆菌R52 单纯培养更有利于瑞士乳杆菌的增殖；并且，当培养液中乳铁蛋白的浓度为50 mg/mL时，对瑞士乳杆菌R52增殖的促进作用最强。由表1和图7～10可知，婴 儿双歧杆菌R33加入乳铁蛋白后比婴儿双歧杆菌R33单纯培养更有利于婴儿双 歧杆菌的增殖；并且，当培养液中乳铁蛋白的浓度为50mg/mL时，对婴儿双歧 杆菌R33增殖的促进作用最强。由表1和图11～14可知，动物双歧杆菌BB12 加入乳铁蛋白后比动物双歧杆菌BB12单纯培养更有利于婴儿双歧杆菌的增殖； 并且，当培养液中乳铁蛋白的浓度为50mg/mL时，对动物双歧杆菌BB12增殖 的促进作用最强。

结合图1～14，说明0.05～50mg/mL乳铁蛋白对瑞士乳杆菌R52、婴儿双歧 杆菌R33、动物双歧杆菌BB12的增殖有促进作用(P＜0.05)。并且从图1～14可 以看出，当培养液中还包含低聚果糖、低聚半乳糖、β-葡聚糖和/或人乳低聚糖 时，能进一步促进双歧杆菌、乳酸杆菌的增殖。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。