一种快速分析环境样品中15种酚类化合物的分析方法

技术领域

本发明属于环境物质检测技术领域，涉及一种快速分析环境样品中15种酚类化合物的分析方法。

背景技术

随着工农业的发展，酚类化合物被广泛应用于染料、医药、杀菌剂、防腐剂、除草剂、炸药及有机合成等方面。酚类化合物通过各种途径进入环境后，很难降解，会经呼吸、接触、食物链富集等途径进入人体。而酚类物质对生物的DNA、生殖、血液、神经等系统均有一定的毒性，严重的可致畸、致突变、致癌。苯酚的口服致死量为530mg/kg（体重）左右，属于高毒物；硝基酚类还能直接作用于能量代谢过程，可使细胞氧化过程增强，磷酰化过程抑制；甲酚、氯酚毒性较大,其中2,4-二氯酚与2,4,6-三氯酚均为致癌物。美国EPA颁布的129项优先控制污染物中就有11项是酚类化合物(苯酚、2-氯苯酚、2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、五氯酚、对硝基酚、邻硝基酚、2,4-二硝基苯酚、2,4-二甲基苯酚、对-氯-间甲苯酚、4,6-二硝基-对-甲苯酚)；欧盟指令2455/2001/ECC也将酚类化合物列入其中；我国颁布的68项优先控制污染物黑名单中有6项为酚类化合物（苯酚、间甲酚、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、4-硝基酚和五氯酚）；我国《地表水环境质量标准》（GB 3838-2002）中明确规定了地表水中苦味酸（2,4,6-三硝基苯酚）的标准限值。因此，寻求一种简单、准确度及灵敏度高、可同时快速分离多种酚类化合物的分析方法显得尤为重要。

目前，酚类化合物检测最常用的方法为气相色谱法，由于酚类化合物沸点较高难挥发、高温下不稳定易分解，为提高分析方法的灵敏度通常需要对其进行衍生化。由于衍生化反应存在操作烦琐、影响因素多、通用型衍生化试剂较少等局限性，苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚的衍生化效率受衍生化条件影响较大，此类方法的应用受到较大限制。而液相色谱法分离不需要对待测组分进行汽化、适用于沸点较高组分的分析，且可以通过选择正相、反相等分离模式，实现对不同极性化合物的分离，用于测定酚类化合物、尤其是硝基酚这种极性较强的化合物非常适合。

现行《环境空气 酚类化合物的测定 高效液相色谱法》（HJ 638-2012）虽15min内可同时测定12种酚类化合物，但存在一定应用局限。一是该方法仅可测定2,4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚，不能同时测定4-硝基苯酚、以及在环境中含量与2,4,6-三硝基苯酚含量直接相关的2,6-二硝基苯酚，而这四种硝基酚类化合物近来一直得到广泛关注；二是在HJ 638-2012 的色谱体系下，2,4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚保留时间均接近溶剂前沿、峰型不对称，造成分析复杂基质样品时易受到杂质干扰，极大地影响到这两种组分的定性及定量准确性。

发明内容

本发明针对传统酚类化合物检测中存在的问题提出一种新型的快速分析环境样品中15种酚类化合物的分析方法。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

为改善2，4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚的分离、提高其选择性，并实现同时测定包括4-硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚等我国优先控制酚类化合物在内的15种酚类化合物，本发明选用超高效液相色谱，通过对色谱柱、检测波长等关键检测条件的反复筛选，以及对流动相体系的不断优化，大大改善了2，4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚的色谱行为及选择性，最终建立了于λ=225nm采集紫外吸收色谱图、在6.5min内实现15种酚类化合物同时测定的方法；通过同步采集硝基酚类化合物于λ=435nm的特征紫外吸收信号，可实现在4.5min内对4种硝基酚类化合物的单独分离测定，进一步提高了4种硝基酚类化合物的选择性，达到了上述发明目的。

15种酚类化合物为4-硝基酚、2，4-二硝基酚、2,6-二硝基酚、2,4,6-三硝基酚、1,3-苯二酚、苯酚、3-甲基苯酚、4-甲基苯酚、2-甲基苯酚、4-氯苯酚、2,6-二甲基苯酚、2-萘酚、1-萘酚、2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯酚；所述通道一采集15种酚类化合物紫外吸收色谱图，通道二采集4种硝基苯酚类化合物的紫外吸收色谱图。

样品经前处理后、以流动相定容，采用具有二极管阵列紫外检测器的超高效液相色谱仪分离检测。以乙腈和水（5mmol/L乙酸铵）为流动相，在Waters ACQUITY UPLC® BEHC18（1.7μm 2.1×100mm）色谱柱或其他性能相近的色谱柱上进行梯度洗脱。

色谱条件为：紫外检测波长分别为225 nm、435nm，同步采集紫外吸收光谱图；流动相洗脱速率0.5 ml/min：色谱柱温度40 ℃：样品进样量：2.0 ul

梯度洗脱如下表1：

表1 梯度洗脱表

作为优选，可以同步采集15种酚类化合物的紫外吸收光谱图，建立15种酚类化合物的紫外吸收光谱库，在保留时间定性之外，可实现紫外吸收光谱图辅助定性，进一步提高本方法的选择性。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1.本发明通过采集λ=225nm的紫外吸收信号，实现在6.5min内15种酚类化合物的有效分离，各组分之间可基线分离、同时定量，具有较高的灵敏度，各组分检出限均低于标准HJ 638-2012，方法有效、可靠，详见说明书附图2。

2.通过同步采集15中酚类化合物的紫外吸收光谱图，建立15种酚类化合物的紫外吸收光谱库，可在保留时间定性之外，实现紫外吸收光谱图辅助定性，进一步提高了本方法的选择性。

3.本发明另一个亮点是，利用酚类化合物的pKa理化特性、通过调节流动相pH，改变了酚类化合物在流动相中的存在形式，大大增强了4种硝基苯酚类化合物在色谱柱的保留，从而降低了不保留杂质对其的干扰；利用只有硝基苯酚类化合物在435nm处有较强吸收的特点，通过同步采集硝基苯酚类化合物于λ=423nm的特征紫外吸收信号，可实现在4.5min内对4种硝基苯酚类化合物的单独分离测定，避免了温度、流动相比例等稍许变化对其出峰的影响，从而大大提高对该类化合物的选择性，详见说明书附图2、图3。

附图说明

图1是HJ 638-2012标准中分离的12种酚类化合物色谱图。图1中，1. 2,4-二硝基苯酚；2. 2,4,6-三硝基苯酚；3. 1,3-苯二酚；4. 苯酚；5. 3-甲基苯酚；6. 4-甲基苯酚；7.2-甲基苯酚；8. 4-氯苯酚；9. 2,6-二甲基苯酚；10. 2-萘酚；11. 1-萘酚；12. 2,4-二氯苯酚。

图2是本发明分离的15种酚类化合物的高效液相色谱紫外吸收色谱图（λ=225nm）。图2中，1. 1,3-苯二酚；2. 2,4,6-三硝基苯酚；3. 2,6-二硝基苯酚；4. 苯酚；5. 4-硝基苯酚；6. 2,4-二硝基苯酚；7. 3-甲基苯酚；8. 4-甲基苯酚；9. 2-甲基苯酚；10. 4-氯苯酚；11. 2,6-二甲基苯酚；12. 2-萘酚；13. 1-萘酚；14. 2,4,6-二氯苯酚；15. 2,4-二氯苯酚。

图3是本发明分离的4种硝基酚类化合物的高效液相色谱紫外吸收色谱图（λ=435nm）。图3中2. 2,4,6-三硝基苯酚；3. 2,6-二硝基苯酚；5. 4-硝基苯酚；6. 2,4-二硝基苯酚。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

本实施例提供15种酚类化合物的超高效液相色谱分析的条件。

仪器与色谱分析条件-Waters ACQUITY UPLC ⅠClass，配PDA检测器、自动进样器、柱温箱，EMPOWER色谱工作站。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC® BEH C18（1.7μm 2.1×100mm），紫外检测波长为225 nm、435nm，流速为0.5 ml/min，柱温为40 ℃，有机相是乙腈，水相为水（5mmol/L乙酸铵），梯度洗脱方式见表1。

实验步骤：

将15种酚类化合物混合标准储备液采用乙腈水溶液（体积比1：1）进行逐级稀释，配成3.0 ug/ml的标准溶液。按上述条件进行超高效液相分析，进样2.0 ul，紫外吸收色谱图详见说明书附图2、附图3。

结果显示，在6.5min内15种酚类化合物在紫外色谱条件下能够达到基线分离；利用酚类化合物的理化特性、通过条件优化在水相添加5mmol/L乙酸铵调节流动相pH值显弱酸性，大大增强了4种硝基苯酚类化合物在色谱柱的保留，且1.3-苯二酚、2，4-二硝基苯酚、2,4,6-三硝基苯酚的k’ 较标准HJ 638-2012 有了很大提升及优化，分别调整至1.55、3.20及3.39，大大降低了不保留杂质对测定的干扰。

利用硝基苯酚类化合物在其特征吸收波长435nm处有较强吸收的特点，同步采集4种硝基苯酚类化合物于λ=423nm的紫外吸收信号，实现了在4.5min内对4种硝基苯酚类化合物的单独分离测定，进一步提高了对硝基酚类化合物的选择性。

实施例2

本实施例提供本发明分析方法的方法学考察。

线性考察：取15种酚类化合物标准储备液稀释配制为0.00 ug/ml，0.15ug/ml，0.30 ug/ml，1.5ug/ml，3.0 ug/ml，5.0 ug/ml，10.0 ug/ml的系列标准溶液，进行超高效液相色谱分析，考察15种酚类化合物的线性关系。经实验，15种酚类化合物呈现良好的线性关系。以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，进行线性回归，分别得回归方程；以MDL=t(n-1,0.99)S计算标准物质的检出限。15种酚类化合物的线性方程、相关系数、检出限如表2、表3所示。

表2 15种酚类化合物分离方法λ=225nm线性曲线及检出限

表3 4种硝基苯酚类化合物分离方法λ=435nm线性曲线及检出限

由表2、表3可知，各组分在0.15 ug/ml--10.0ug/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系；该色谱方法具有较低的检出限，能对环境样品中15种酚类化合物进行有效的定性、定量分析。

色谱系统精密度考察：取上述线性关系试验项下浓度为1.5 ug/ml的15种酚类化合物混和标准溶液连续进六针，考察方法的精密度，精密度结果如表4所示。由表4数据可知，15种酚类化合物的RSD均在10%以内，本方法精密度良好。

表4 15种酚类化合物精密度试验结果

注：表中含量数据经四舍五入保留小数点后两位，而RSD（%）则由未经取舍的真实值计算得出。

分析方法室间精密度考察：室间精密度采用与色谱系统精密度考察同样操作方法，由不同人员重复上述试验，结果如表5所示。由表5数据可知，15种酚类化合物的RSD均在10%以内，本方法室间精密度良好。

表5 15种酚类化合物室间精密度试验结果

注：表中含量数据经四舍五入保留小数点后两位，而RSD（%）则由未经取舍的真实值计算得出。

分析方法准确度考察：取上述线性关系试验项下15种酚类化合物混和标准溶液分别加入0.31 ug、1.50 ug、3.10ug于空白样品中，采用外标法定量分析，分别计算各组分的回收率，结果见表6、表7。

由表6、表7可知，三种浓度下九个样品的平均回收率都在97.4 %～104 %之间，且9个样品回收率RSD在2.04 %～8.52%之间，均小于20 %，满足质控要求，故该色谱方法的准确度符合要求。

表6 15种酚类化合物λ=435nm回收率试验结果

注：表中回收率数据经四舍五入保留小数点后一位。

表7 15种酚类化合物λ=225nm回收率试验结果

综上所述，本发明方法能够有效的分离15种酚类化合物组分，能够准确、快速测定15种酚类化合物的组分，该方法简单、快速、准确、有效，精密度高，是测定环境样品中15种酚类化合物含量的理想色谱方法。

实施例3

本实施例给出具体检测实例。需要说明的是，在实际检测中，样品的预处理方法可以按照现行标准或文献中公开的常规处理方式进行，本发明对样品预处理步骤不做改进和限制。以空气样品为例说明：环境空气样品采样点的位置、采样频次、采样器的放置以及采样记录等参照HJ/T 55和HJ/T 194的相关规定执行，采集方法参照HJ 638-2012规定，选用填装有经预处理的XAD-7采样管或商品化XAD-7采样管采样，控制采样流量在0.2～0.5L/min、采样总体积一般应不少于25L，样品采集完成应于4℃以下避光保存、14天内测定。

样品预处理采用乙腈淋洗采样管，使乙腈逆采样方向缓慢通过采样管洗脱目标化合物，收集淋洗液至2ml棕色容量瓶中，采用初始流动相定容待测。

本发明对某区域环境空气实际样品进行了分析。采集方法参照HJ 638-2012规定，选用商品化XAD-7采样管采样，控制采样流量在0.3L/min、采样总体积50L。采用乙腈逆样品采集方向缓慢淋洗采样管，收集淋洗液至2ml棕色容量瓶中，用初始流动相定容，按照实施例1所述色谱检测条件进行分析，结果显示采集的环境空气样品中15种酚类化合物含量均低于方法检出限。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。