一种耐热植酸酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种耐热植酸酶突变体及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

植酸又称肌醇六磷酸，广泛存在于农作物的种子中，是谷物中磷的主要储存形式，约占60％-80％。在单胃动物中，植酸和植酸盐不能被直接吸收利用，只能随着动物的粪便排出，然而过量磷排放则会导致水体富营养化，对环境影响十分严重。并且由于动物对磷的需求无法得到满足，必须额外添加无机磷，这样无形之中造成磷资源的极度浪费。另外植酸具有强鳌合能力，可以与铁、镁、锌、钙等金属离子以及胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶结合，在植物性饲料中成为一种抗营养因子，影响单胃动物对矿物质的利用。

植酸酶又称肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸或植酸盐水解成肌醇和磷酸或磷酸盐的一类酶的总称，属于正磷酸单酯水解酶家族，广泛存在于植物、动物和微生物中。大量研究表明，在猪、禽类饲料中添加适量的植酸酶可使磷利用率提高60％左右，动物粪便的磷排放减少30—50％。这不仅降低了饲料的生产成本，而且还减少了环境污染。

然而，植酸酶在饲料生产过程的短暂高温处理中需要足够的耐热性。大肠杆菌来源的植酸酶活性良好，发酵活力较高，适用于高水平表达系统。但其耐热性较低，相比黑曲霉来源的植酸酶相差较大。因此，进一步提高大肠杆菌来源的植酸酶的耐热性，成为饲用植酸酶的研究热点之一。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种耐热植酸酶突变体及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种植酸酶突变体，所述突变体含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述植酸酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶的第120位氨基酸由丝氨酸(Ser)变为天冬酰胺(Asn)，第137位氨基酸由天冬酰胺(Asn)变为天冬氨酸(Asp)，第219位氨基酸由谷氨酸(Glu)变为苏氨酸(Thr)。

本发明的第二个目的是提供编码上述植酸酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明的第三个目的是提供含有核苷酸序列为SEQ ID NO:4的重组载体。

本发明的第四个目的是提供表达上述植酸酶突变体的基因工程菌，以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一个实施方式中，所述质粒是pET22b(+)。

在本发明的一个实施方式中，所述宿主大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供含有上述植酸酶突变体或表达植酸酶突变体的基因工程菌在猪禽饲料中的应用。

有益效果：

本发明获得的植酸酶突变体appA-M最适pH为4.5，在pH3.0-6.0有50％以上活性，最适温度为65℃，比野生酶提高5℃，在90℃处理10min后保留30.3％的酶活，热稳定性较野生酶提高27.7％。所述耐热植酸酶突变体可广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过程中酶活力的损失，降低饲料成本，同时还能降低磷排放对环境的污染。

附图说明

图1为易错PCR随机突变PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图2为pET22b(+)载体片段琼脂糖凝胶电泳图。

图3为植酸酶野生型appA和突变体appA-M的最适pH曲线。

图4为植酸酶野生型appA和突变体appA-M的pH稳定性曲线。

图5为植酸酶野生型appA和突变体appA-M的最适温度曲线。

图6为植酸酶野生型appA和突变体appA-M的热稳定性曲线。

具体实施方式

LB培养基成分：1％NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，固体培养基加2％琼脂粉。

高保真酶PCR反应体系：高保真混合酶(2×)25μL，上、下游引物各2μL，DNA模板100ng，灭菌蒸馏水不足50μL。反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min，30个循环；72℃充分延伸10min；4℃保温。

植酸酶的酶活检测(钼蓝法)：

乙酸缓冲液B(0.25mol/L)：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。

植酸钠溶液(6.25mmol/L)：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。

终止液：5％三氯乙酸(5％TCA)。

1.5％钼酸铵(试剂A)：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。

2.7％硫酸亚铁(试剂B)：冰箱储存，有效期1个月。

显色剂：移取4份试剂A(2.5)，1份试剂B(2.6)混合后使用，现用现配。

磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液(2.2)配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液(2.2)，冰箱储存。

将4.0mmol/L磷酸二氢钾标准溶液用乙酸缓冲液(2.2)稀释成0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mmol/L的溶液，按表1的操作步骤一起反应。以无机磷含量为纵坐标(0.2ml以上稀释液无机磷含量分别为：0.00、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80μmol)，以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程。

表1钼蓝法检测酶活操作步骤

反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计700nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，A-A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品的无机磷含量，并求出植酸酶活性。

酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷所需的酶含量为1U。

实施例1：易错PCR随机突变植酸酶基因

使用上海生工公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取大肠杆菌BL21的基因组，根据公共基因数据库NCBI(GenBank:AMH85921.1)得到大肠杆菌来源植酸酶基因序列(序列为SEQ ID NO:2)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，合成以下引物：

引物F1：

引物R1：

以大肠杆菌基因组为模板，使用北京天恩泽公司的可调式易错PCR试剂盒进行随机突变。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；4℃保温。

以大肠杆菌基因组为模板，使用高保真PCR酶扩增野生型植酸酶基因。

琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，PCR产物大小为1200bp左右，条带大小正确，使用上海捷瑞公司的胶回收试剂盒进行回收。

实施例2：植酸酶突变体文库的构建

使用高保真PCR酶，使用引物F2和R2扩增pET22b(+)载体片段。

引物F2：gagctccgtcgacaagc；

引物R2：gaattcggatccgaattaattccg；

琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，PCR产物大小为5500bp左右，条带大小正确，使用胶回收试剂盒进行回收。

使用商品化一步克隆试剂盒连接pET22b(+)载体片段和实施例1中获得的植酸酶突变基因或野生型植酸酶基因，16℃反应30min。将连接产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含50mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃倒置过夜培养，LB平板上获得单菌落约1500个。用牙签从LB平板挑选单菌落接种于30mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37℃、220r/min振荡培养12h，使用商品化的质粒抽提试剂盒获得野生型表达质粒。

实施例3：耐热植酸酶突变体的筛选

步骤1：用牙签从LB平板挑选单菌落接种于96孔板，每个孔中加入150μL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基。37℃、220r/min振荡培养4h后加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，12h后70℃高温处理5min，5000r/min离心5min吸取上清采用钼蓝法测定酶活。

筛选得到酶活相对较高的8株突变体菌株，最高残留酶活为4.257U/mL，野生型对照菌株的残留酶活为1.734U/mL。将8个突变体扩增培养后提质粒测序。测序结果显示，突变位点为：D31P、S120N、N137D、P173W、K180N、E219T、A138S/S189D、D185E/K363T。结果如下表所示：

表2.植酸酶热处理后残留酶活

步骤2：根据步骤1中的突变位点以及测序结果，使用定点突变的方法构建包含两个或两个以上随机组合突变位点的突变体。以实施例2中野生型表达质粒为模板，使用高保真PCR酶进行全质粒扩增，各个突变位点对应的引物如下：

表3.定点突变引物

当邻近突变位点组合时，需重新设计引物合成。

表4.定点突变引物

实施例4：组合突变体的筛选

将实施例3中构建好的重组质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含50mg/L氨苄青霉素的LB平板。37℃倒置过夜培养，用牙签从LB平板挑选单菌落接种于30mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37℃、220r/min振荡培养12h，使用商品化的质粒抽提试剂盒获得质粒，并测序验证，获得构建成功的突变体，与40％甘油1:1混合保存于-80℃。

将甘油菌划线于50mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置过夜培养，用牙签从LB平板挑选单菌落接种于含50mg/L氨苄青霉素的30mL LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养4h后加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导12h，将发酵液5000r/min离心5min获得粗酶液。

80℃高温处理上述粗酶液5min后测定酶活，以未处理粗酶液酶活为100％计算酶活残留，筛选出酶活残留最高的突变体。本实施例中野生酶经热处理后酶活为1.652U/mL，酶活残留为32.5％，而突变位点组合为S120N/N137D/E219T的植酸酶经热处理后酶活为3.895U/mL酶活残留为67.9％，较野生酶提高了52％。将突变位点组合为S120N/N137D/E219T的植酸酶命名为appA-M，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

实施例5：植酸酶的纯化

将appA-M粗酶液使用20mM的乙酸钠-乙酸缓冲液(pH 6.0)4℃透析24h，每隔4h更换新鲜缓冲液。使用阴离子交换层析柱(Hi Trap Q HP，1mL)进一步纯化，用含1M NaCl的20mM乙酸钠-乙酸缓冲液(pH 6.0)洗脱目的蛋白，纯化后的产物用于植酸酶性质研究。

(1)最适pH：在温度37℃，将野生酶appA与突变体appA-M分别在pH 1.0～3.5的0.25mol/L Glycine-HCl缓冲液、pH 4.0～6.0的0.25mol/L NaAc-Hac缓冲液、pH 6.5～7.0的0.25mol/LTris-HCl缓冲液中测定酶活，以本实施过程中检测到的最高酶活力为100％，确定酶的最适pH。由图3可知，野生酶appA与突变体appA-M的最适pH均为4.5，无明显差异。且本申请提供的植酸酶突变体在pH3.0-6.0均有50％以上酶活，具有广泛的pH适应范围。

(2)pH稳定性：将野生酶appA与突变体appA-M分别置于不同pH(1.0～7.0)缓冲液(与(1)相同的缓冲液)中，37℃保温1h后，5000r/min离心5min吸取上清测定酶活，以未经处理的酶活为100％，测试酶的pH稳定性。结果如图4所示。植酸酶突变体appA-M，在pH4.0处理1h后残余酶活为80.8％，较野生酶提高17.7％。

(3)最适温度：在pH值5.0，将野生酶appA与突变体appA-M分别在30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80℃测定酶活，以本实施过程中检测到的最高酶活力为100％，确定酶的最适温度。结果如图5所示，突变体appA-M的最适温度为65℃，相比于野生酶appA提升了5℃。

(4)热稳定性：将野生酶appA与突变体appA-M分别置于不同温度(50～90℃)处理10min，冰浴20min后测定残余酶活，以未经处理的酶活力为100％，测试酶的热稳定性。由图6可知，突变体appA-M在90℃处理10min后仍能保持30.3％的酶活，较野生酶appA提高27.7％，热稳定性得到很大提升。

实施例6植酸酶突变体appa-M在制备饲料中的应用

将appa-M制成1万酶活酶粉，按照100g/t添加到猪禽饲料中，通过制粒机加工生产成颗粒饲料，加工条件是制粒温度85℃、湿度16～18％、蒸汽压力0.28MPa、调质时间30秒、环膜压缩比7:1。

综上，与野生型植酸酶appA相比，本发明筛选得到的植酸酶突变体appA-M的耐热性得到显著提高，在90℃处理10min后仍能保持30.3％的酶活，较野生酶appA提高27.7％。pH适应范围较野生酶更为广泛，在pH3.0-6.0均有50％以上酶活。所述植酸酶突变体可广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过程中酶活力的损失，降低饲料成本，同时还能降低磷排放对环境的污染。

对比例：

取实施例4中构建成功的其他突变体与最终筛选得到的appA-M(S120N/N137D/E219T)进行比较，实施方式与实施例4一致。

如下表所示appA-M未处理的初始酶活为5.736U/mL，明显高于S120N/N137D、S120N/E219T；80℃处理5min后，植酸酶酶活都相应降低，其中appA-M热处理后酶活为3.895U/mL、酶活残留为67.9％，比S120N/N137D、S120N/E219T和N137D/E219T热处理后酶活高了45％、42％和25％，酶活残留高了32％、27％和22％。appA-M具有初始酶活最高，热处理后酶活最高，酶活残留最高等优势，可广泛应用于猪禽饲料中，从而有利于减少饲料制粒过程中酶活力的损失。

表5.突变体植酸酶酶活及酶活残留

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种耐热植酸酶突变体及其应用

<130> BAA201455A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Ser

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn

165 170 175

Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 2

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagagtgagc cggagctgaa gctggaaagt gtggtgattg tcagtcgtca tggtgtgcgt 60

gctccaacca aggccacgca actgatgcag gatgtcaccc cagacgcatg gccaacctgg 120

ccggtaaaac tgggttggct gacaccgcgc ggtggtgagc taatcgccta tctcggacat 180

taccaacgcc agcgtctggt agccgacgga ttgctggcga aaaagggctg cccgcagtct 240

ggtcaggtcg cgattattgc tgatgtcgac gagcgtaccc gtaaaacagg cgaagccttc 300

gccgccgggc tggcacctga ctgtgcaata accgtacata cccaggcaga tacgtccagt 360

cccgatccgt tatttaatcc tctaaaaact ggcgtttgcc aactggataa cgcgaacgtg 420

actgacgcga tcctcagcag ggcaggaggg tcaattgctg actttaccgg gcatcggcaa 480

acggcgtttc gcgaactgga acgggtgctt aattttccgc aatcaaactt gtgccttaaa 540

cgtgagaaac aggacgaaag ctgttcatta acgcaggcat taccatcgga actcaaggtg 600

agcgccgaca atgtctcatt aaccggtgcg gtaagcctcg catcaatgct gacggagata 660

tttctcctgc aacaagcaca gggaatgccg gagccggggt ggggaaggat caccgattca 720

caccagtgga acaccttgct aagtttgcat aacgcgcaat tttatttgct acaacgcacg 780

ccagaggttg cccgcagccg cgccaccccg ttattggatt tgatcatggc agcgttgacg 840

ccccatccac cgcaaaaaca ggcgtatggt gtgacattac ccacttcagt actgtttatt 900

gccggacacg atactaatct ggcaaatctc ggcggcgcac tggagctcaa ctggacgctt 960

cccggtcagc cggataacac gccgccaggt ggtgaactgg tgtttgaacg ctggcgtcgg 1020

ctaagcgata acagccagtg gattcaggtt tcgctggtct tccagacttt acagcagatg 1080

cgtgataaaa cgccgctgtc attaaatacg ccgcccggag aggtgaaact gaccctggca 1140

ggatgtgaag agcgaaatgc gcagggcatg tgttcgttgg caggttttac gcaaatcgtg 1200

aatgaagcac gcataccggc gtgcagtttg taa 1233

<210> 3

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Ser

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Asn Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asp Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn

165 170 175

Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Thr Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

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Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu

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Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

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Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

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Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 4

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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gctccaacca aggccacgca actgatgcag gatgtcaccc cagacgcatg gccaacctgg 120

ccggtaaaac tgggttggct gacaccgcgc ggtggtgagc taatcgccta tctcggacat 180

taccaacgcc agcgtctggt agccgacgga ttgctggcga aaaagggctg cccgcagtct 240

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acggcgtttc gcgaactgga acgggtgctt aattttccgc aatcaaactt gtgccttaaa 540

cgtgagaaac aggacgaaag ctgttcatta acgcaggcat taccatcgga actcaaggtg 600

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caccagtgga acaccttgct aagtttgcat aacgcgcaat tttatttgct acaacgcacg 780

ccagaggttg cccgcagccg cgccaccccg ttattggatt tgatcatggc agcgttgacg 840

ccccatccac cgcaaaaaca ggcgtatggt gtgacattac ccacttcagt actgtttatt 900

gccggacacg atactaatct ggcaaatctc ggcggcgcac tggagctcaa ctggacgctt 960

cccggtcagc cggataacac gccgccaggt ggtgaactgg tgtttgaacg ctggcgtcgg 1020

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