感光细胞退化作为阿尔茨海默病诊断靶点的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及感光细胞退化作为阿尔茨海默病诊断靶点的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性的神经退行性疾病，也是最主要的痴呆疾病之一。随着病理的发展，AD患者会出现记忆认知功能、语言功能、视觉功能以及执行功能障碍。在我国，随着社会老龄化的发展，AD患病比率急剧增加。然而，目前临床上缺乏对该病的有效诊断和治疗手段，且AD病人的治疗及日常生活给病人家庭和社会带来了极大的负担。

前期对AD病人以及AD动物模型的病理研究表明，该病主要的病理特征包括β-淀粉样斑块(β-amyloid plaque)沉积、神经纤维缠结以及神经突触丢失和神经元死亡。在AD脑内，淀粉样斑块沉积和神经纤维缠结能够引起神经元功能以及结构异常，进而导致神经突触损伤和神经元丢失。神经突触丢失以及神经元死亡被认为是导致AD认知记忆功能异常的重要原因。在一项前期研究中，相较于正常对照组，AD病人以及轻度认知障碍病人海马齿状回以及CA1区域神经突触数目显著降低，并且病人神经突触数目的减少与他们的简易智力状态检查量表分数密切相关。除了神经突触损伤，海马区、皮层以及基底前脑核等脑区的神经元数量在AD病人中也显著降低，而在具有AD病理但无认知障碍的对照组中，相应区域的神经元数量无变化，这一结果提示神经元数目减少是导致认知记忆功能障碍的重要原因。

目前AD的临床诊断是根据患者与家属提供的详细病史，结合神经科记忆力和认知功能量表而做出，同时利用核磁共振扫描(MRI)、正电子断层扫描(PET)以及血液、脑脊液相关物质测定对神经元死亡、淀粉样斑块沉积以及神经纤维缠结等相应的标记物进行检测，进一步做出准确诊断。值得注意的是，这些检测方法仍具有一定的局限性：1)MRI及PET技术相应仪器价格昂贵，检测费用高，普适性低；2)PET技术检测淀粉样斑块沉积、tau蛋白磷酸化依赖于蛋白影像剂，对影像剂的灵敏度与特异性要求高，影像剂的合成成本高，相应也会提高后续的检测费用，目前并未实际应用到病人的临床诊断中；3)利用脑脊液、血液生物标记物的检测来进行疾病诊断依赖于检测技术的灵敏度和准确性，现有的生物标记物检测结果需要结合其他检测结果才能进行AD的临床诊断和病理评估，而新的生物标记物的确认需要大量临床样品的前期基础验证，对时间成本和经济成本需求大。此外，临床上AD病人得到确诊时，疾病已发展至中晚期，极大地影响了病人的有效治疗。基于这种现状，寻找AD早期有效的诊断标记物和诊断方法，对该病进行早期诊断，能够有效延缓AD病理发展。

视觉作为重要的感觉之一，是人和动物感知外界并获取外界信息的重要途径，对机体生存具有重要意义。在视觉系统中，视网膜作为唯一的感光器官，是形成视觉的重要结构基础。视网膜中包含有不同类型的神经元，他们的胞体和细胞末梢整齐分布，依次形成视网膜的色素上皮细胞层、感光细胞层、外核层、外网状层、内核层、内网状层、神经节细胞层以及神经节细胞神经纤维层。在视网膜中，感光细胞包括视杆细胞(rods)、视锥细胞(cones)，二者分别负责暗视觉和明视觉，共同构成我们的成像视觉。视杆细胞和视锥细胞均由感光外段、内段、胞体以及终足构成。感光外段是感光细胞重要的感光部位，其中分布着细胞特异的感光蛋白：视杆细胞的感光蛋白为视紫红质，而视锥细胞对应三种不同的感光蛋白。当感光细胞接受光信号后，感光蛋白激活并通过下游的信号转导通路，将光信号转化成化学信号，并将化学信号通过突触传递给下游分布于内核层的双极细胞，双极细胞进而将信号传递给下游的神经节细胞，最后通过视神经将信号传递给相应的视觉中枢。

随着AD病理研究的深入，视网膜病理改变受到了领域的广泛关注。与大脑的病理改变一致，视网膜中也存在淀粉样斑块沉积、tau蛋白的过度磷酸化以及神经突触损伤和神经元死亡。在AD病人及AD转基因小鼠中，视网膜淀粉样斑块在外核层以及神经节细胞层之间均有分布，且在感光细胞外段及内段也能检测到。同时，AD视网膜中存在色素上皮层细胞以及神经节细胞损伤。值得注意的是，在AD病人以及AD转基因小鼠中，视网膜病理改变如淀粉样斑块沉积等是早于脑内的。不同于大脑组织，视网膜由于眼球特殊的光透明结构，可以通过现有的临床成像技术包括眼底自发荧光检查、光学相干断层扫描以及荧光成像检眼镜进行无侵入性观测。目前，在AD病人以及AD模型小鼠中，利用天然植物色素姜黄素对视网膜中淀粉样斑块进行标记，进一步利用视网膜成像技术可以对视网膜中的阳性信号进行在体观测。同时，AD视网膜的结构异常如视网膜神经纤维层异常可以利用光学相干断层扫描技术进行成像及相关的参数测量。这些研究提示了AD视网膜病理及其诊断对于AD基础研究及临床诊断的重要意义。

在视网膜疾病如色素视网膜炎、老年黄斑变性中，视杆细胞和视锥细胞的退化是导致视网膜功能缺失乃至失明的重要原因。然而，感光细胞包括视杆细胞以及视锥细胞的病理改变在AD视网膜中尚不清楚。基于感光细胞的重要生理功能，我们认为探究其在AD疾病进程中的病理改变能够深入我们对AD的认识。同时利用视网膜在体无侵入性方法检测视杆细胞以及视锥细胞的病理改变，对于AD的临床诊断具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供以下技术方案。

一方面，本发明提供了用于诊断受试者患有阿尔兹海默症或受试者具有患阿尔兹海默症风险的系统或试剂盒，其包括检测感光细胞退化的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述检测感光细胞退化的系统或试剂盒包括检测视杆细胞退化的系统或试剂盒和/或检测视锥细胞退化的系统或试剂盒，优选检测视杆细胞退化的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述检测感光细胞退化的系统或试剂盒包括蛋白免疫印迹检测系统或试剂盒和/或荧光定量RT-PCR检测系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述检测感光细胞退化的系统或试剂盒包括检测视杆细胞外段结构的系统或试剂盒和/检测视杆细胞感光功能的系统或试剂盒，优选包括检测视杆细胞感光功能的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，其中所述检测视杆细胞感光功能的系统或试剂盒包括检测视杆细胞感光蛋白的蛋白表达水平和基因转录水平的系统或试剂盒和/或检测视杆细胞光信号转导蛋白的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述感光蛋白为视紫红质。

在一个实施方式中，所述视杆细胞光信号转导蛋白包括转导蛋白GNAT1和恢复蛋白。

在一个实施方式中，所述蛋白免疫印迹检测系统或试剂盒包括：

一抗，其包括鼠抗视紫红质抗体和鼠抗GAPDH抗体；和

二抗，其包括HRP抗鼠IgG抗体。

在一个实施方式中，所述蛋白免疫印迹检测系统或试剂盒还包括：

SDS凝胶，优选所述SDS凝胶的浓度为12％；

固定膜，优选PVDF膜；

封闭液，优选为用TBST缓冲液配制的5％脱脂牛奶；

稀释液，优选TBST溶液，用于稀释一抗和二抗；

清洗缓冲液，优选TBST缓冲液；和

显色试剂，优选ECL显影试剂盒。

在一个实施方式中，所述蛋白免疫印迹检测系统或试剂盒包括：

一抗，其包括兔抗GNAT1抗体，兔抗恢复蛋白抗体，和鼠抗GAPDH抗体；和

二抗，其包括HRP抗兔IgG抗体，和HRP抗鼠IgG抗体。

在一个实施方式中，所述检测视杆细胞外段结构的系统或试剂盒包括检测视杆细胞外段结构的免疫荧光染色系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述检测视杆细胞外段结构的免疫荧光染色系统或试剂盒包括用于特异性标记视杆细胞感光外段的视杆细胞视紫红质，和用于标记视杆细胞细胞核所在外核层的细胞核染料DAPI。

在一个实施方式中，所述检测视杆细胞外段结构的免疫荧光染色系统或试剂盒包括：

一抗，其包括鼠抗视紫红质抗体；和

二抗，其包括包括Alexa Fluor 555抗鼠IgG(H+L)。

在一个实施方式中，所述检测视杆细胞外段结构的免疫荧光染色系统或试剂盒包括：

清洗缓冲液，优选PBS缓冲液，去除切片周围残留的包埋剂；

封闭液，优选1％Triton X-100和5％山羊血清稀释于PBS缓冲液中，用于封闭样品；

稀释液，优选PBS缓冲液，用于稀释一抗和二抗；

清洗缓冲液，优选PBS缓冲液；和

染色液，优选DAPI染色液，用于细胞核染色。

在一个实施方式中，所述检测感光细胞退化的系统或试剂盒还包括检测感光细胞衰老的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述检测感光细胞衰老的系统或试剂盒包括检测衰老特异性的细胞周期素抑制蛋白p16ink4a的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述检测衰老特异性的细胞周期素抑制蛋白p16ink4a的系统或试剂盒包括用于检测衰老特异性的细胞周期素抑制蛋白p16ink4a的免疫荧光染色系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述检测衰老特异性的细胞周期素抑制蛋白p16ink4a的免疫荧光染色系统或试剂盒包括：

一抗，其包括兔抗p16ink4a抗体；和

二抗，其包括Alexa Fluor 488抗兔IgG(H+L)。

在一个实施方式中，所述检测衰老特异性的细胞周期素抑制蛋白p16ink4a的免疫荧光染色系统包括用于标记细胞核的DAPI。

在一个实施方式中，其中所述检测感光细胞退化的系统包括记录视网膜电图的装置。

在一个实施方式中，其中所述检测感光细胞退化的系统包括用于在记录视网膜电图之前对受试者进行暗适应的装置。

在一个实施方式中，其中所述检测感光细胞退化的系统还包括：

扩瞳液，优选阿托品溶液；和

麻醉剂。

在一个实施方式中，其中所述感光细胞退化表现为视网膜电图的a波幅度显著低于健康群体，以差异分析p值小于0.05为标准。

在一个实施方式中，所述检测视锥细胞退化的系统或试剂盒包括检测视锥细胞感光蛋白表达水平的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述视锥细胞感光蛋白为M-opsin和S-opsin。

在一个实施方式中，所述蛋白免疫印迹检测系统或试剂盒包括：

一抗，其包括兔抗M-opsin抗体，兔抗S-opsin，和鼠抗GAPDH抗体；和

二抗，其包括HRP抗兔IgG抗体，HRP抗鼠IgG抗体。

在一个实施方式中，所述检测视锥细胞退化的系统或试剂盒包括检测视锥细胞的密度的系统或试剂盒。

在一个实施方式中，所述用于检测视锥细胞的密度的免疫荧光染色系统或试剂盒包括用于特异性标记视锥细胞感光外段的视锥细胞感光蛋白M-opsin和S-opsin，和用于细胞核的细胞核染料DAPI。

在一个实施方式中，所述用于检测视锥细胞的密度的免疫荧光染色系统或试剂盒包括：

一抗，其包括兔抗M-opsin抗体，兔抗S-opsin；和

二抗，其包括Alexa Fluor 555抗兔IgG(H+L)。

在一个实施方式中，用于检测视锥细胞的形态及分布的免疫荧光染色系统还包括：

清洗缓冲液，优选PBS缓冲液，用于去除切片周围残留的包埋剂；

封闭液，优选所述封闭液为1％Triton X-100和5％山羊血清稀释于PBS缓冲液中，用于封闭样品；

稀释缓冲液，优选PBS缓冲液，用于稀释一抗和二抗；和

染色液，优选DAPI染色液，用于细胞核染色。

在一个实施方式中，用于检测视锥细胞的密度的系统包括荧光基团结合的花生凝集素(PNA)，用于对视锥细胞进行标记。

在一个实施方式中，所述用于检测视锥细胞的密度的免疫荧光染色系统还包括：

固定液，优选PFA固定液，用于固定视网膜组织；

清洗缓冲液，优选PBS缓冲溶液，用于清洗固定后的组织；

破膜液，优选包含1％Triton X-100的PBS缓冲液，用于处理视网膜染色液，优选PNA溶液，用于视锥细胞荧光染色。

在一个实施方式中，所述检测视网膜淀粉样斑块沉积的系统或试剂盒包括用于淀粉样斑块沉积的标记，优选地所述用于淀粉样斑块沉积的标记为姜黄素，优选地，所述用于淀粉样斑块沉积的标记为姜黄素溶液，优选地所述姜黄素溶液包括姜黄素、NaOH溶液和PBS溶液。

另一方面，本发明提供上述系统或试剂盒用于诊断受试者患有阿尔兹海默症或受试者具有患阿尔兹海默症风险的用途。

另一方面，本发明提供用于诊断受试者患有阿尔兹海默症或受试者具有患阿尔兹海默症风险的方法，所述方法采用如上所述的系统或试剂盒进行。

本发明的有益效果在于：

视觉是人和动物感知外界并获取外界信息的重要途径，对机体生存具有重要意义。在视觉系统中，视网膜作为唯一的感光器官，是形成视觉的重要部分。与大脑组织不同，视网膜可以通过成熟的临床成像技术如眼底自发荧光检查、光学相干断层扫描以及荧光成像检眼镜进行无侵入性观测，同时视网膜中不同类型的神经元的功能可以通过视网膜电图进行在体无侵入性检测。本发明基于AD视网膜病理的早发性以及视网膜病理在体检测的可行性，对视网膜病理改变进行了探究，为AD临床诊断提供早期病理靶点及有效诊断方法，解决现有研究的不足。

感光细胞包括视杆细胞、视锥细胞，其作为视网膜重要的结构基础，能够将外界的光信号转化成化学信号，并将化学信号通过突触传递给下游的双极细胞，双极细胞进而将信号传递给下游的神经节细胞，最后通过视神经将信号传递给相应的视觉中枢。视杆细胞和视锥细胞的退化是导致视网膜功能缺失乃至失明的重要原因。基于感光细胞的重要性，本发明聚焦于视杆细胞和视锥细胞的病理改变，以不同月龄AD模型小鼠为研究对象，在AD模型小鼠中发现并确认了感光细胞包括视杆细胞以及视锥细胞退化：9月龄AD小鼠中开始出现视杆细胞退化，随后18月龄AD小鼠中才开始出现视锥细胞退化。在本发明中，所使用的AD模型小鼠脑组织中12月龄开始出现淀粉样斑块沉积，相较于此，确认了视杆细胞退化在AD病理进程中的早发性。更进一步，在本发明中，利用暗适应视网膜电图记录，在体检测到视杆细胞感光功能减弱，建立了视杆细胞退化的在体检测方法，结合视杆细胞退化的早发性，为AD临床早期诊断提供了有效的诊断靶点和诊断方法。

附图说明

以下将结合附图具体说明本发明。

图1示出3月龄、6月龄及9月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜组织中视杆细胞感光蛋白视紫红质(Rhodopsin)的western blot结果图以及半定量分析图；

图2示出12月龄及18月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜组织中视杆细胞感光蛋白视紫红质(Rhodopsin)的western blot结果图及半定量分析图；

图3示出12月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜组织中视杆细胞视蛋白基因的半定量分析图；

图4示出3月龄、6月龄及9月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜组织中视杆细胞信号转导蛋白(GNAT1)、恢复蛋白(recoverin)的western blot结果图及半定量分析图；

图5示出12月龄及18月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜组织中视杆细胞信号转导蛋白(GNAT1)、恢复蛋白(recoverin)的western blot结果图和半定量分析图；

图6示出3月龄、6月龄及9月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜免疫荧光图像(rhodopsin标记视杆细胞感光外段)，其中OS、IS、ONL分别表示视网膜感光细胞感光外段、内段以及细胞核分布所在的外核层；

图7示出12月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜免疫荧光图像及荧光强度分析图(rhodopsin标记视杆细胞感光外段)，其中OS、IS、ONL分别表示视网膜感光细胞感光外段、内段以及细胞核分布所在的外核层；

图8示出12月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜视杆细胞感光外段、内段以及细胞核分布的外核层厚度分析图，其中OS、IS、ONL分别表示视网膜感光细胞感光外段、内段以及细胞核分布所在的外核层；

图9示出18月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜免疫荧光图像及荧光强度分析图(rhodopsin标记视杆细胞感光外段)；

图10示出12月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠单个视杆细胞不同光刺激条件下的波形图；

图11示出12月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视杆细胞光反应与光刺激强度曲线；

图12示出12月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠在弱光刺激条件下视杆细胞光反应分析图；

图13示出3月龄、9月龄以及12月龄APP23小鼠及对照WT小鼠视网膜感光细胞衰老免疫荧光染色结果图(衰老细胞特异性标记物p16ink4a)；

图14示出3月龄、6月龄以及9月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜视锥细胞感光蛋白(M-opsin,S-opsin)的western blot结果图及半定量分析图；

图15示出12月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜视锥细胞感光蛋白(M-opsin，S-opsin)的western blot结果图及半定量分析图；

图16示出18月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜视锥细胞感光蛋白(M-opsin，S-opsin)的western blot结果图及半定量分析图；

图17示出3月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜免疫荧光染色图像(M-opsin标记M-视锥细胞，S-opsin标记S-视锥细胞)；

图18示出3月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜M-视锥细胞，S-视锥细胞密度分析图；

图19示出18月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜免疫荧光染色图像(M-opsin标记M-视锥细胞，S-opsin标记S-视锥细胞)；

图20示出18月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜M-视锥细胞，S-视锥细胞密度分析图；

图21示出18月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜免疫荧光染色图像(PNA标记所有类型视锥细胞，且使用视网膜组织为完整平铺视网膜组织)；

图22示出18月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜视锥细胞密度分析图；

图23示出9月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜及脑组织淀粉样斑块沉积免疫荧光染色图像；

图24示出12月龄APP23小鼠及对照组WT小鼠视网膜及脑组织淀粉样斑块沉积免疫荧光染色图像

图25示出9月龄APP23小鼠及对照WT小鼠在特定光强刺激下的暗适应视网膜电图示意图；

图26示出9月龄APP23小鼠及WT小鼠暗适应视网膜电图a波幅度与光刺激强度曲线；

图27示出9月龄APP23小鼠及WT小鼠在特定光强刺激下视网膜电图a波定量分析图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例说明本发明的技术方案。这些实施例仅用于举例说明目的，而并不意味着本发明的范围限于此。

下述实施例中使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明的实施例中，我们采用APP23小鼠作为AD模型小鼠。该小鼠模型是将携带有瑞典突变的人源淀粉样前体蛋白异构体(APP751)过表达至C57BL/6小鼠中。在此模型小鼠中，APP751是在神经元特异性的启动子Thy1的控制下表达，且APP的表达量是对照小鼠的七倍。随着年龄增长，该转基因小鼠会表现出AD的典型病理包括淀粉样斑块沉积、神经元丢失、神经突触损伤、小胶质细胞以及星形胶质细胞过度活化，同时也存在学习记忆能力损伤。基于其与AD临床病理改变一致的表现，该小鼠在AD研究领域内得到广泛应用。

实施例1：AD模型小鼠视杆细胞感光蛋白表达降低

1.实验过程

为探索AD模型小鼠视杆细胞的病理改变，我们首先分离出不同年龄段APP23小鼠以及年龄匹配对照组的WT小鼠视网膜，并进行全组织蛋白提取，然后利用蛋白免疫印迹(western blot)的方法分析视网膜样品中视杆细胞感光蛋白视紫红质(rhodopsin)的表达情况，并比较APP23小鼠与对照组WT小鼠的差异(参见图1，2)。此外，我们还对12月龄小鼠视杆细胞感光蛋白的基因转录水平进行分析，即提取相应视网膜组织的RNA，进而分析该样品中视杆细胞感光蛋白的转录水平，并比较APP23小鼠与对照组WT小鼠的差异(参见图3)。

2.实验材料

APP23小鼠为本实验室自有(也可从Jackson实验室购买，小鼠货号#030504)。本实施例中采用的APP23小鼠均为杂合子，相应的对照WT小鼠选择同窝小鼠，无特定性别要求。

本实施例中使用抗体，一抗包括鼠抗视紫红质(mouse-anti-rhodopsin)抗体(Santa Cruz,sc57432，1:2000)，鼠抗GAPDH(mouse-anti-GAPDH)抗体(Millipore，MAB374，1:1000)；二抗包括HRP抗鼠IgG抗体(Jackson Research，1:5000)。

3.具体操作

首先进行视网膜样品的裂解和蛋白提取：

1)3月龄、6月龄、9月龄、12月龄以及18月龄的APP23小鼠及WT小鼠用水合氯醛麻醉后，用1xPBS溶液进行心脏灌流，后取出眼球组织；

2)眼球组织置于新鲜PBS溶液中，在体视镜下，迅速分离角膜，去除晶状体和残留的玻璃体，进一步将视网膜与脉络膜、巩膜分开，取出视网膜。取出的视网膜组织迅速转入细胞裂解液(磷酸盐缓冲液，1％Nonidet P-40(Invitrogen,FNN0021)，0.5％去氧胆酸钠，150mM NaCl，蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific，A32965)，在冰上用组织匀浆器研磨，超声处理2分钟，4℃下12000g离心20分钟；

3)离心完成的组织样品，取上清液，用BCA试剂盒(Thermo Scientific，A53225)测定蛋白浓度，然后用细胞裂解液调整各样品浓度至相同，加入等体积2xSDS电泳上样缓冲液，混匀后待用。

用蛋白免疫印迹(western blot)技术检测APP23及WT视网膜样品中视杆细胞感光蛋白的变化情况：

1)SDS-PAGE电泳：根据视紫红质蛋白的大小我们选择12％浓度的SDS电泳凝胶，将同年龄组的APP23及WT视网膜样品等量上样后进行电泳分离(上层浓缩胶使用恒压90伏特，下层分离胶使用恒压120伏特)；

2)转膜：SDS-PAGE电泳完成后，将SDS电泳凝胶上的样品条带转膜至PVDF膜上，全程使用恒流240安培转膜100分钟，于冰水浴中进行；

3)封闭：转膜完成，将载有蛋白的膜置于封闭液(5％脱脂牛奶，用TBST缓冲液配制(Tris 24.2g/L，NaCl 80g/L溶于1L超纯水中，并用浓盐酸调节PH至7.6，配置10倍TBST缓冲液；10倍TBST缓冲液用超纯水稀释至1倍TBST留用)，室温摇床封闭1小时；

4)孵育一抗：按照抗体使用说明书，将鼠抗视紫红质，鼠抗GAPDH一抗稀释于TBST溶液中，而后于4℃分别孵育样品膜过夜；

5)清洗一抗：将样品膜置于TBST缓冲液中，室温摇床清洗三次，每次10分钟；

6)孵育二抗：清洗完成，HRP抗鼠二抗稀释于TBST，于室温孵育样品膜90分钟；

7)清洗二抗：将样品膜置于TBST缓冲液中，室温摇床清洗三次，每次10分钟；

8)显色检验：样品膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒(Thermo Scientific，34095)进行显色检测。

蛋白含量半定量分析：

用Image J软件分析目的蛋白视紫红质及内参蛋白GAPDH的灰度，并用目的蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值，得到的数值即为内参校正后的目的蛋白相对含量。然后利用此相对含量数值，分析同年龄段内AD模型小鼠与对照组WT小鼠的目的蛋白含量的变化情况。

感光蛋白基因转录水平分析：

1)视网膜RNA提取：12月龄APP23小鼠及WT小鼠视网膜组织转入500ul Trizol(Invitrogen，15596026)中，室温静置5分钟，然后用移液器吹打，直至看不到明显的组织块；后加入200ul氯仿，颠倒混匀后室温静置5min，4℃下12000g离心15分钟；离心完成取上层水相，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后，室温静置10分钟；静置完成，4℃下12000g离心10分钟；离心完成，弃上清，75％乙醇清洗沉淀；4℃下7500g离心5分钟；离心完成，弃上清，晾干沉淀；加入10ul DEPC(焦碳酸二乙酯)水，溶解沉淀。

2)视杆细胞感光蛋白RNA定量扩增检测：利用反转录试剂盒(购自Takara公司)，取0.5ug总RNA将其反转成cDNA；将cDNA稀释20倍后，利用荧光定量试剂盒(购自Takara公司)及视杆细胞感光蛋白基因特异的扩增引物(正向引物5'-GAGGGCTTCTTTGCCACACTTG-3'；反向引物5'-AGCGGAAGTTGCTCATCGGCTT-3')，进行荧光定量扩增实验。

3)分析感光蛋白基因的相对含量：根据荧光定量扩增实验的结果，分析目的基因相较于内参基因的表达水平，比较AD模型小鼠与对照组小鼠视杆细胞感光蛋白转录水平的差异。

4.结果分析

由图1结果可知，在较为年轻的3月龄、6月龄以及9月龄小鼠中，视网膜组织中视杆细胞感光蛋白的表达量在AD模型小鼠与对照WT小鼠之间无差异；

由图2结果可知，在12月龄小鼠中，相较于对照组WT小鼠，AD模型小鼠中视网膜组织中视杆细胞感光蛋白的表达量显著降低，差异显著性P值为0.0001；且随着病理发展，在更老年的18月龄小鼠中，这一蛋白表达量降低幅度增大，差异显著性P值为0.001；

由图3结果可知，在12月龄小鼠中，相较于对照组WT小鼠，AD模型小鼠中视网膜组织中视杆细胞感光蛋白的RNA表达量显著降低，差异显著性P值为0.0107。

实施例2：AD模型小鼠视杆细胞信号转导相关蛋白表达降低

1.实验过程

为探索AD模型小鼠视杆细胞的病理改变，我们首先分离出不同年龄段APP23小鼠以及年龄匹配对照组的WT小鼠视网膜，并进行全组织蛋白提取，然后利用蛋白免疫印迹(western blot)的方法分析视网膜样品中视杆细胞光信号转导蛋白包括转导蛋白GNAT1、恢复蛋白recoverin的表达情况，并比较APP23小鼠与对照组WT小鼠的差异(参见图4、5)。

2.实验材料

与实施例1相同，使用APP23小鼠作为AD模型小鼠。本实施例中采用的APP23小鼠均为杂合子，相应的对照WT小鼠选择同窝小鼠，无特定性别要求。

本实施例中使用抗体，一抗包括兔抗GNAT1抗体(Proteintech,55167-1-AP，1:500)，兔抗恢复蛋白抗体(rabbit-anti-recoverin)(Proteintech，10073-1-AP，1:500)，鼠抗GAPDH抗体(Millipore，MAB374，1:1000)；二抗包括HRP抗兔IgG抗体，HRP抗鼠IgG抗体(Jackson Research，1:5000)。

3.具体操作

首先，按照实施例1的方法，进行视网膜样品的裂解和蛋白提取。

用蛋白免疫印迹(western blot)技术检测APP23及WT视网膜样品中视杆细胞信号转导相关蛋白(转导蛋白GNAT1，恢复蛋白recoverin)的变化情况。

蛋白含量半定量分析：

用Image J软件分析目的蛋白GNAT1，recoverin及内参蛋白GAPDH的灰度，并用目的蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值，得到的数值即为内参校正后的目的蛋白相对含量。然后利用此相对含量数值，分析同年龄段内AD模型小鼠与对照组WT小鼠的目的蛋白含量的变化情况。

4.结果分析

由图4结果可知，在较为年轻的3月龄、6月龄以及9月龄小鼠中，视网膜组织中视杆细胞信号转导蛋白包括转导蛋白、恢复蛋白的表达量在AD模型小鼠与对照WT小鼠之间无差异；

由图5结果可知，在12月龄，18月龄中，相较于对照组WT小鼠，AD模型小鼠中视网膜组织中视杆细胞信号转导蛋白包括转导蛋白、恢复蛋白的表达量降低，其中12月龄差异显著性P值分别为0.0241、0.0197。

实施例3：AD模型小鼠视杆细胞感光外段结构异常

1.实验过程

由于视杆细胞感光蛋白分布于感光外段，且其细胞核整齐分布于视网膜的外核层，利用视杆细胞感光蛋白rhodopsin特异性标记视杆细胞感光外段，用细胞核染料DAPI标记视杆细胞细胞核所在外核层，通过免疫荧光染色的技术手段，得到不同年龄段AD模型小鼠及对照组WT小鼠的视杆细胞形态(参见图6、7、9)。进一步通过荧光图像，观察形态并分析包括荧光强度，感光外段、感光内段以及外核层的厚度(参见图7、8、9)，对视杆细胞的结构进行定性和定量分析，以确认AD模型小鼠中视杆细胞的病理改变。

2.实验材料

与实施例1相同，使用APP23小鼠作为AD模型小鼠，本实施例中采用的APP23小鼠均为杂合子，相应的对照WT小鼠选择同窝小鼠，无特定性别要求；

本实施例中一抗包括鼠抗视紫红质(mouse-anti-rhodopsin)抗体(Santa Cruz，sc57432，1:500)，二抗包括Alexa Fluor 555抗鼠IgG(H+L)(CST，1:500)，细胞核利用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Invitrogen,D1306，1:1000)进行标记。

3.具体操作

AD模型小鼠及对照WT小鼠视网膜组织冰冻切片准备：

1)3月龄、6月龄、9月龄、12月龄以及18月龄的APP23小鼠及WT小鼠用水合氯醛麻醉后，用1xPBS溶液进行心脏灌流，后取出眼球组织；

2)将眼球组织迅速置于4％PFA(多聚甲醛)固定液中，4℃固定过夜；

3)将固定过夜的眼球，在体视镜下，迅速分离角膜，去除晶状体和残留的玻璃体，余下即为eye-cup组织置于新鲜4％PFA固定液中，室温后固定3小时；

4)固定完成的eye-cup组织转至30％蔗糖溶液中脱水24小时；

5)脱水完成后，OCT(SAKURA,4583)包埋组织，速冻于冰冻切片机中，后切成10um的冰冻切片，-20℃保存。

视网膜组织冰冻切片免疫荧光染色：

1)视网膜组织冰冻切片，用PBS缓冲液清洗，去除切片周围残留的包埋剂；

2)清洗完成后，室温封闭样品(封闭液为1％Triton X-100，5％山羊血清稀释于PBS缓冲液中)1小时；

3)封闭完成，孵育一抗：鼠抗视紫红质一抗稀释于封闭液(同步骤2)配制方法)中，4℃孵育样品过夜；

4)清洗一抗：移除一抗稀释液，PBS缓冲液清洗视网膜切片；

5)孵育二抗：将荧光二抗稀释于PBS缓冲液中，室温孵育视网膜切片2小时30分钟；

6)清洗二抗：二抗孵育完成，移除二抗稀释液，PBS缓冲液清洗视网膜切片；

7)清洗完成，按照说明书配制DAPI工作液，室温孵育视网膜切片10分钟；

8)孵育完成，清洗切片，滴加甘油封片；

9)用激光共聚焦Confocal显微镜观察并拍摄荧光染色图像。

荧光图像分析：

首先利用Image J软件对荧光图像的视紫红质阳性信号进行灰度分析，然后利用灰度除以荧光信号所在位置面积，得到的数值可代表相对荧光强度，进一步比较同年龄段内AD模型小鼠及对照WT小鼠的视紫红质荧光强度的差异；根据图片的比例尺，利用Image J软件分析视杆细胞感光外段、内段以及细胞核所在内核层的厚度，进一步比较AD模型小鼠与WT小鼠之间的差异；根据免疫荧光图像，着重观察视杆细胞外段形态，主要观察视杆细胞外段结构是否整齐以及视紫红质荧光信号是否主要分布于视杆细胞感光外段。

4.结果分析

由图6可知，3月龄、6月龄以及9月龄小鼠中，AD模型小鼠与对照组WT小鼠视网膜视杆细胞视紫红质荧光强度无明显差异，得出感光蛋白表达量无明显差异；

由图7可知，12月龄小鼠中，相较于WT小鼠，AD模型小鼠视网膜视杆细胞感光外段荧光强度显著降低，差异显著性P值为0.0002，提示感光蛋白表达量降低，外段形态无明显异常；

由图8可知，12月龄小鼠中，相较于WT小鼠，AD模型小鼠视网膜感光外段(OS)、内段(IS)以及感光细胞细胞核所在内核层(ONL)厚度均无明显改变。由于视杆细胞数量占总感光细胞的90％，内核层的厚度无明显改变，说明视杆细胞的细胞数目无变化，即12月龄的AD模型小鼠中无视杆细胞丢失。

由图9可知，随着病理进展，在18月龄小鼠中，相较于WT小鼠，AD模型小鼠视网膜视杆细胞感光外段荧光强度显著降低，差异显著性P值为0.017，提示感光蛋白表达量降低。另外，AD模型小鼠视杆细胞感光外段形态异常，且感光蛋白荧光信号在内段及内核层均有异常分布。

实施例4：AD模型小鼠视杆细胞功能异常

1.实验过程

实施例1、2、3中，在分子水平上分别通过感光蛋白、信号转导蛋白表达降低以及结构异常证实了AD模型小鼠中视杆细胞的病理改变，进一步利用视杆细胞光电流记录方法，在12月龄AD模型小鼠及对照WT小鼠离体视网膜组织中，记录单个视杆细胞在不同强度的光刺激下所产生的电流(参见图10)，以评估视杆细胞的感光功能，进一步比较AD模型小鼠于对照组WT小鼠的差异(参见图11、12)，确认视杆细胞功能水平的病理改变。

2.实验材料

与实施例1相同，使用APP23小鼠作为AD模型小鼠，相应的对照WT小鼠选择同窝小鼠，无特定性别要求。

离体视网膜组织光电流记录用其细胞外液和细胞内液。

3.具体操作

1)给准备用于记录视杆细胞光电流的12月龄AD模型小鼠和对照组WT小鼠称量体重，然后将小鼠提前放置于暗室中暗适应过夜；

2)在黑暗无光的电生理间中，用水合氯醛麻醉小鼠，待小鼠麻醉后，小心取出小鼠眼球；

3)在体视镜下，辅助红外照明，在细胞外液中小心分离出小鼠视网膜，然后将视网膜平铺至操作孔中，在分离视网膜过程中，细胞外液使用5％CO

4)保持细胞外液灌流速度为每分钟5ml，在显微镜下找到视杆细胞的外段，用直径1μm的玻璃电极将其外段吸入，同时给予不同光照强度的535nm白光，记录单个视杆细胞的光电流；

5)重复步骤4中操作，尽可能多的记录同一组织上不同视杆细胞的光反应；

6)利用光功率计测定光刺激的强度，同时利用电生理软件(clamp fit)分析不同光刺激强度下对应的光电流大小，保存数据用于后续的数据分析。

4.结果分析

由图10可知，12月龄AD模型小鼠及WT小鼠离体视网膜组织中，给予光刺激后，可记录到单个视杆细胞所产生的光电流，且在光刺激强度较弱如0.096photons/μm

由图11可知，12月龄AD模型小鼠及WT小鼠单个视杆细胞的光电流-光强度曲线存在明显差异，其中在弱光条件下，AD模型小鼠产生的光电流幅度小于对照组WT小鼠；

由图12可知，通过分析，在光刺激强度为0.096photons/μm

实施例5：AD模型小鼠中视杆细胞-细胞衰老信号增加

1.实验过程

细胞衰老是机体在退化时期细胞生理功能下降和紊乱的综合表现。在正常衰老及神经退行性疾病如AD中，大脑内许多细胞都会出现衰老信号的增加，基于此，本发明的实施例通过衰老特异性的细胞周期素抑制蛋白p16ink4a的免疫荧光染色对3月龄、9月龄以及12月龄AD模型小鼠和对照WT小鼠视网膜组织中感光细胞的状态进行探究(参见图13)，以确定AD模型小鼠中感光细胞的病理改变。

2.实验材料

本实施例中一抗包括兔抗p16ink4a抗体(Proteintech，10883-1-AP，1:100)，二抗包括Alexa Fluor 488抗兔IgG(H+L)(CST，1:200)，细胞核利用DAPI(Invitrogen，D1306，1:1000)进行标记。

3.具体操作

首先按照实施例3相同的方法，准备AD模型小鼠及对照WT小鼠视网膜组织冰冻切片；

视网膜组织冰冻切片免疫荧光染色：

1)视网膜组织冰冻切片，用PBS缓冲液清洗，去除切片周围残留的包埋剂；

2)清洗完成后，室温封闭样品(封闭液为1％Triton X-100，5％山羊血清稀释于PBS缓冲液中)1小时；

3)封闭完成，孵育一抗稀释液：将兔抗p16ink4a一抗稀释于封闭液(同步骤2)配制方法)中，4℃孵育样品48小时；

4)清洗一抗：移除一抗稀释液，PBS缓冲液清洗视网膜切片；

5)孵育二抗：将荧光二抗稀释于PBS缓冲液中，4℃孵育视网膜切片过夜；

6)清洗二抗：二抗孵育完成，移除二抗稀释液，PBS缓冲液清洗视网膜切片；

7)清洗完成，按照说明书配制DAPI工作液，室温孵育视网膜切片10分钟；

8)孵育完成，清洗切片，滴加甘油封片；

9)Confocal观察并拍摄荧光染色图像。

4.结果分析

由图13结果可知，在9月龄和12月龄，AD模型小鼠感光细胞中存在细胞衰老阳性信号，且相较于WT小鼠信号荧光强度明显增加，提示AD模型小鼠中存在感光细胞衰老，且衰老水平高于正常衰老过程。衰老阳性信号的荧光强度定量分析结果发现，9月龄、12月龄显著性差异P值均小于0.05。此外，作为对照，在年轻的3月龄，AD模型小鼠和WT小鼠感光细胞中均未检测到衰老信号存在。

实施例6：AD模型小鼠视锥细胞感光蛋白减少

1.实验过程

为探索AD模型小鼠视锥细胞的病理改变，我们首先分离出不同年龄段APP23小鼠以及年龄匹配对照组的WT小鼠视网膜，并进行全组织蛋白提取，然后利用蛋白免疫印迹(western blot)的方法分析视网膜样品中视锥细胞感光蛋白M-opsin和S-opsin的表达情况，并比较APP23小鼠与对照组WT小鼠的差异(参见图14、15、16)。

2.实验材料

与实施例1相同，使用APP23小鼠作为AD模型小鼠。本实施例中采用的APP23小鼠均为杂合子，相应的对照WT小鼠选择同窝小鼠，无特定性别要求。

本实施例中使用抗体，一抗包括兔抗M-opsin抗体(Millipore，AB5405，1:500)，兔抗S-opsin(Millipore，AB5407，1:500)，鼠抗GAPDH抗体(Millipore，MAB374，1:1000)；二抗包括HRP抗兔IgG抗体，HRP抗鼠IgG抗体(Jackson Research，1:5000)。

3.具体操作

用与实施例1相似的方法，进行视网膜样品的裂解和蛋白提取：

用与实施例1相似的方法，用蛋白免疫印迹(western blot)技术检测APP23及WT视网膜样品中视锥细胞感光蛋白M-opsin、S-opsin的变化情况。

蛋白含量半定量分析：

用Image J软件分析目的蛋白M-opsin，S-opsin及内参蛋白GAPDH的灰度，并用目的蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值，得到的数值即为内参校正后的目的蛋白相对含量。然后利用此相对含量数值，分析同年龄段内AD模型小鼠与对照组WT小鼠的目的蛋白含量的变化情况。

4.结果分析

由图14结果可知，在较为年轻的3月龄、6月龄以及9月龄小鼠中，视网膜组织中视锥细胞感光蛋白M-opsin，S-opsin的表达量在AD模型小鼠与对照WT小鼠之间无差异；

由图15结果可知，在12月龄小鼠中，相较于对照组WT小鼠，AD模型小鼠中视网膜组织中视锥细胞感光蛋白的表达量与对照组WT小鼠无差异；

由图16结果可知，随着病理发展，在18月龄小鼠中，AD模型小鼠视网膜组织中视锥细胞感光蛋白表达量相较于对照组WT小鼠是显著降低的，其中S-opsin显著性差异P值为0.0175，M-opsin显著性差异P值为0.0017。

实施例7：AD模型小鼠视锥细胞数量减少

1.实验过程

根据视锥细胞感光蛋白表达量的结果，我们在18月龄AD模型小鼠及对照组WT小鼠的视网膜组织冰冻切片中，利用视锥细胞感光蛋白M-opsin、S-opsin特异性标记视锥细胞感光外段，用细胞核染料DAPI标记细胞核，通过免疫荧光染色的技术手段，得到视网膜中视锥细胞的形态及分布(参见图19)，同时3月龄AD模型小鼠及对照组WT小鼠视网膜组织冰冻切片的染色结果(参见图17)作为年轻对照。进一步通过荧光图像，观察形态并统计视锥细胞的密度(参见图18、20)，以确认AD模型小鼠中视锥细胞的病理改变。进一步，在18月龄的小鼠中，我们利用有荧光基团结合的花生凝集素(Alexa Fluor 488conjugated-PNA)对AD模型小鼠及WT小鼠平铺视网膜组织中的视锥细胞进行标记(参见图21)，进一步统计视锥细胞密度(参见图22)。

2.实验材料

与实施例1相同，使用APP23小鼠作为AD模型小鼠。本实施例中采用的APP23小鼠均为杂合子，相应的对照WT小鼠选择同窝小鼠，无特定性别要求；

本实施例中一抗包括兔抗M-opsin抗体(Millipore，AB5405，1:500)，兔抗S-opsin(Millipore，AB5407，1:500)，二抗包括Alexa Fluor 555抗兔IgG(H+L)(CST，1:200)，细胞核利用DAPI(Invitrogen,D1306，1:1000)进行标记。此外Alexa Fluor 488conjugated-PNA(Invitrogen，L21409，1:100)也用于标记视锥细胞。

3.具体操作

按实施例3的方法，进行AD模型小鼠及对照WT小鼠视网膜组织冰冻切片准备。

视网膜组织冰冻切片免疫荧光染色：

1)视网膜组织冰冻切片，用PBS缓冲液清洗，去除切片周围残留的包埋剂；

2)清洗完成后，室温封闭样品(封闭液为1％Triton X-100，5％山羊血清稀释于PBS缓冲液中)1小时；

3)封闭完成，孵育一抗：将兔抗M-opsin和兔抗S-opsin一抗分别稀释于封闭液中，4℃孵育样品过夜；

4)清洗一抗：移除一抗稀释液，PBS缓冲液清洗视网膜切片；

5)孵育二抗：将荧光二抗稀释于PBS缓冲液中，室温孵育视网膜切片2小时30分钟；

6)清洗二抗：二抗孵育完成，移除二抗稀释液，PBS缓冲液清洗视网膜切片；

7)清洗完成，按照说明书配制DAPI工作液，室温孵育视网膜切片10分钟；

8)孵育完成，清洗切片，滴加甘油封片；

9)Confocal观察并拍摄荧光染色图像。

AD模型小鼠及对照WT小鼠平铺视网膜组织准备：

1)18月龄的APP23小鼠及WT小鼠水合氯醛麻醉后，1xPBS溶液进行心脏灌流，后取出眼球组织；

2)眼球组织迅速置于4％PFA固定液中，4℃固定过夜；

3)固定过夜的眼球，在体视镜下，迅速分离角膜，去除晶状体和残留的玻璃体，将完整视网膜组织与脉络膜和巩膜分离出后置于新鲜4％PFA固定液中，室温后固定3小时；

AD模型小鼠及对照WT小鼠平铺视网膜组织PNA(花生凝集素)染色：

1)固定完成的平铺视网膜组织用PBS缓冲溶液清洗；

2)清洗完成后，破膜液(1％Triton X-100in PBS缓冲液)室温孵育样品1小时；

3)孵育PNA：稀释PNA于PBS缓冲液中，4℃孵育样品过夜；

4)PBS缓冲液清洗样品，将染色完成的视网膜剪开呈花瓣状，平铺在载玻片上，滴加甘油，封片；

5)Confocal观察并保存荧光图像。

荧光图像分析：

首先利用Image J软件对视网膜冰冻切片荧光图像的M-opsin、S-opsin阳性信号进行数量统计，进一步根据图片的比例尺，统计阳性信号所在区域的长度，计算单位长度内阳性信号的数量，得出相应的M-视锥细胞，S-视锥细胞的密度，比较AD模型小鼠与WT小鼠之间的差异；根据平铺视网膜组织PNA免疫荧光图像，统计每张图片阳性信号的数量，进一步根据图片比例尺统计该图片对应视网膜区域的面积，计算单位面积内视锥细胞的数量，比较AD模型小鼠与对照组WT小鼠之间的差异。

4.结果分析

由图17、18可知，在3月龄小鼠中，AD模型小鼠与WT小鼠之间M-视锥细胞，S-视锥细胞数量无明显差异；

由图19、20可知，在18月龄小鼠中，相较于WT小鼠，AD模型小鼠的M-视锥细胞，S-视锥细胞细胞数量均显著减少，显著差异性P值均小于0.05；

由图21、22可知，在18月龄小鼠中，相较于WT小鼠，AD模型小鼠的视锥细胞数量显著减少，显著差异性P值为0.0035。

实施例8：AD模型小鼠视杆细胞退化早于脑组织淀粉样斑块沉积

1.实验过程

脑内淀粉样斑块沉积是AD最主要的病理表现之一，也是AD临床诊断及干预的重要靶点。目前临床上结合Aβ影像剂的PET(正电子发射断层扫描)成像，血液和脑脊液的Aβ的检测都是临床上认可的AD诊断手段。为评估感光细胞退化尤其是最早出现的视杆细胞退化是否可以作为AD更早期的诊断靶点，我们探究了AD模型小鼠的脑淀粉样斑块沉积，进一步比较视杆细胞退化与脑淀粉样斑块沉积出现时间的先后。利用天然植物色素姜黄素对9月龄、12月龄的APP23小鼠及WT小鼠视网膜组织及脑组织中淀粉样斑块沉积进行标记(图23、24)，进一步利用confocal显微镜进行成像，以确定AD小鼠中脑组织淀粉样斑块沉积出现时间。

2.实验材料

本实施例中天然色素姜黄素(Sigma-Aldrich，C1386)(2mg姜黄素粉末中滴加两滴0.5M NaOH溶液，后加20ml PBS溶液，配制0.1mg/ml姜黄素溶液)用于淀粉样斑块沉积的标记。

3.具体操作

按实施例7的方法进行9月龄，12月龄AD模型小鼠及对照WT小鼠的视网膜平铺视网膜组织准备；

AD模型小鼠及对照WT小鼠脑组织冰冻切片准备：

1)9月龄以及12月龄的APP23小鼠及WT小鼠用水合氯醛麻醉后，用1xPBS溶液进行心脏灌流，后取出脑组织；

2)将脑组织迅速置于4％PFA(多聚甲醛)固定液中，4℃固定过夜；

3)固定完成的脑组织转至30％蔗糖溶液中脱水48小时；

5)脱水完成后，OCT(SAKURA,4583)包埋组织，速冻于冰冻切片机中，后切成30um的冰冻切片，-20℃保存。

平铺视网膜组织、脑组织冰冻切片免疫荧光染色：

1)脑组织冰冻切片或视网膜组织，用PBS缓冲液清洗5次，每次10分钟；

2)清洗完成后，用0.1mg/ml姜黄素溶液室温孵育脑组织切片或视网膜组织，10分钟；

3)孵育完成，用PBS缓冲液清洗样品三次，每次15分钟；

4)清洗完成，平铺视网膜组织于载玻片上，滴加甘油至平铺视网膜组织或脑组织冰冻切片上，封片；

5)共聚焦显微镜观察图像，保存图像。

4.结果分析

由图23、24可知，在AD小鼠中，视网膜淀粉样斑块沉积从9月龄开始出现，而脑组织中淀粉样斑块沉积从12月龄开始出现。

实施例9：在体检测AD模型小鼠视杆细胞病理改变-感光功能异常

1.实验过程

视杆细胞的功能可通过无侵入性的方法如视网膜电图进行在体检测。在接受光刺激后，视网膜电图中首先出现的小的负波a波幅度大小可反映感光细胞的感光能力。实施例1-5确认了AD模型鼠中视杆细胞存在病理改变，且在实施例4中确认了AD模型小鼠中视杆细胞感光功能的减弱。基于此，我们希望利用无侵入性地视网膜电图检测方法对AD模型鼠视杆细胞的病理改变进行检测。同时，由于AD视网膜中感光细胞的病理改变之一-细胞衰老最早在9月龄AD小鼠中出现，所以本实施例中的在体视杆细胞功能检测也选择了9月龄小鼠。

视网膜中视杆细胞在黑暗环境中起作用，主导暗视觉，其对弱光的敏感性较高，所以我们在本实施例中使用的方法为暗适应视网膜电图记录，所采用的光刺激强度也较弱(参见图25-27)。将9月龄AD模型小鼠和对照WT小鼠进行暗适应后，给予不同强度光刺激，记录视网膜产生的反应(参见图25)，并分析其中a波的幅度大小(参见图26)，比较某一光刺激强度下，AD小鼠与WT小鼠视网膜电图对应的a波幅度大小差异(参见图27)，进一步评估视杆细胞感光功能，反映视杆细胞病理改变。

2.实验材料

与实施例1相同，使用APP23小鼠作为AD模型小鼠。本实施例中采用的APP23小鼠均为杂合子，相应的对照WT小鼠选择同窝小鼠，无特定性别要求；

小鼠扩瞳液：100ug/ml阿托品(购自sigma公司)溶液；

小鼠麻醉剂：20mg/ml水合氯醛溶液。

3.具体操作

1)给准备用于记录视网膜电图的9月龄小鼠称量体重，提前放置于暗室中暗适应过夜；

2)连接好视网膜电图记录的给光系统以及记录系统，测试给光系统和记录系统保证其正常运行；

3)在暗室中将小鼠抓起，吸取阿托品溶液滴至眼球上，略等待后，小鼠腹腔注射对应体积的水合氯醛溶液(每克体重注射5ul 20mg/ml的水合氯醛溶液)，然后将小鼠放回笼中，待其麻醉；

4)小鼠麻醉后，将其放入法拉第网中，调整好小鼠位置，将接地金属电极插入小鼠尾部，参比金属电极插入小鼠头部皮下位置，同时将记录电极套在一侧眼球上，调整好光源与眼球的相对位置。此过程中在两侧眼球均滴上眼胶溶液，且开启电热毯，防止小鼠白内障；

5)所有准备工作完成后，设置不同给光参数，给小鼠不同光强的光刺激，同时记录视网膜的电位变化；

6)所有小鼠都使用同一系列的光刺激，实验结束后利用光功率计测定光刺激的强度，同时分析视网膜电图的几个典型波的幅度及潜伏期，保存数据进一步后续分析。

4.结果分析

由图25和26可知，在一定强度光刺激下，AD模型小鼠和对照WT小鼠均能产生完整的视网膜电图，其中在光刺激强度达到1.59E+5photons/μm

由图26、27可知，光刺激强度在1.59E+5photons/μm

综上所述，本发明在AD模型小鼠中发现并确认了两类重要的感光细胞-视杆细胞和视锥细胞-的退化，其中视杆细胞的病理改变相较于视锥细胞出现更早。视杆细胞的病理改变随着病理发展逐渐出现，依次为：1、视杆细胞衰老信号增加；2、1)细胞水平：感光蛋白、信号转导蛋白表达降低；2)功能水平：感光功能减弱；3、感光外段结构紊乱及感光蛋白异常分布。更重要的是，我们利用无侵入性视网膜电图实现了在体检测AD模型小鼠的视杆细胞功能减弱，并且相较于AD典型病理-脑内淀粉样斑块沉积，视杆细胞退化时间点更早。基于此，我们认为本发明所发现的感光细胞病理改变在体检测方法具有重要的转化应用前景及意义。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。