一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法。

背景技术

现有技术(T Z,C B,S D,et al.Generation of human induced pluripotentstem cells from urine samples.Nature protocols.2012；7(12):2080-2089.)中获取尿源诱导多能干细胞的主要步骤分为：1.尿液收集及尿液原代细胞的获取；2.逆转录病毒的包装及尿液原代细胞的感染；3.感染后的尿液原代细胞转至小鼠胚胎成纤维细胞上继续诱导。其中，第3步中所要用到的小鼠胚胎成纤维细胞的制备需要取怀孕13.5天的CF-1小鼠的胎鼠的躯干制备成原代细胞后再通过γ射线照射或丝裂霉素C处理，处理过程中需要摸索γ射线照射的强度及时间长度或丝裂霉素C的浓度，条件难以把控，过程较为复杂，同时在诱导过程中引物小鼠来源的细胞，也降低了诱导多能干细胞的安全性。本发明中使用的方案通过改善方案中第3步诱导过程，去除繁琐且不可控的小鼠胚胎成纤维细胞制备，改用商品化的基质胶，减少了工艺环节、降低了实验难度，同时采用小分子两阶段诱导方法，缩短了诱导时间。

发明内容

本发明提供了以下技术方案：

一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法，包括以下步骤；

步骤一、尿液收集及尿液原代细胞的获取；

步骤二、逆转录病毒的包装；

步骤三、尿液细胞的感染；

步骤四、尿液细胞的诱导；

步骤五、克隆细胞挑出；

步骤六、尿源iPSC鉴定。

优选的，步骤三中，包括制备预先基质胶包被，具体步骤为：处理和分装基质胶；使用时拿出分装的基质胶用预冷的杜氏改良伊格尔培养基/汉氏F-12营养培养基按照1：100稀释后均匀铺到培养皿中，100mm培养皿8ml/皿，6孔板1ml/孔，12孔板500ul/孔；室温下孵育至少1小时或37℃孵育至少30分钟，使用前吸出剩余基质胶稀释液。

优选的，步骤三中包括步骤3.1：在6孔板的每个孔内铺60000个尿液细胞；接种24小时后观察尿液细胞汇合度约为30％，移去培养基加2ml新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基；随后每孔加入第二步第4条中第一次收集的四因子的病毒上清共8ml；在37℃，95％CO2坏境中培养。

优选的，步骤三中包括步骤3.2：12-16小时后，移去培养基，每孔加2ml新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基让细胞恢复；8-12小时后，每孔加入第二步第4条中第二次收集的四因子的病毒上清共8ml，第二次感染；在37℃，95％CO2坏境中培养。

优选的，步骤三中包括步骤3.3：二次感染12小时后，移去培养基加2ml新的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基；继续培养，每天更换新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基。

优选的，步骤三中包括步骤3.4：每天显微镜观察被感染的尿液细胞。

优选的，步骤三中包括步骤3.5：当尿液细胞形态改变明显，达到80～90％汇合度时，使用0.25％胰酶消化，10ml的人肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基终止消化后室温200g离心5分钟；弃去上清后用4ml肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基重悬后计数，6孔板每孔铺10万个感染后的尿液细胞，添加人肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基至2ml，此为培养第1天；

优选的，步骤一中，尿液收集及尿液原代细胞的获取包括以下步骤：

步骤1.1：尿液收集；步骤1.2尿液分离；步骤1.3尿液细胞扩增；

优选的，步骤二中，逆转录病毒的包装包括以下步骤：

步骤2.1：按1：3传代铺6孔板的5个孔的人胚肾293T细胞；

步骤2.2：准备感染复合物，按照每孔200ul减血清培养基，4ug包装载体pCL-Ampho，4ug基因表达载体(pMXs-OCT3/4，pMXs-KLF4,pMXs-SOX2,pMXs-cMyc或pMXs-GFP1)，24ul聚乙烯亚胺；混合后静置15分钟。

步骤2.3：静置期间将人胚肾293T细胞培养基更换为提前预热至37℃的杜氏改良伊格尔培养基；15分钟后将混合物逐滴加入后轻轻晃匀；置于37℃，95％CO2坏境中培养；4h后更换为预热的有血清的培养基。

步骤2.4：转染24小时后观察pMXs-GFP孔，确保其转染效率近100％；收集另外4个孔的上清，再次加入2ml预热的人胚肾293T细胞培养基；将收集的上清经0.22μm滤器过滤，随后加入聚凝胺使其终浓度达到8ug/ml，用于第一次感染尿液细胞；24小时后第二次收集上清，经0.22微米滤器过滤后加入聚凝胺使其终浓度达到8ug/ml，用于第二次感染尿液细胞。

优选的，步骤四中，逆转录病毒的包装包括以下步骤：

步骤4.1：采用两阶段诱导法对感染后的尿液细胞进行诱导，第一阶段在肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基中添加五种小分子，包括A-83-01，CHIR99021，thiazovivin，cyclic pifithrin-α，sodium butyrate(ACTPN)；第二阶段在mTeSR

步骤4.2：培养第2天不用换液，培养第3天至第10天采用肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基+ACTPN，隔天换液；培养第11天至第18天采用mTeSR

步骤4.3：培养第19天开始用mTeSR

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明中使用的方案通过改善现有技术中第3步诱导过程，去除繁琐且不可控的小鼠胚胎成纤维细胞制备，改用商品化的基质胶，减少了工艺环节、降低了实验难度，同时采用小分子两阶段诱导方法，缩短了诱导时间。

附图说明：

图1为当尿液原代细胞可传代时示意图；

图2为步骤3.4感染后第三天(4倍镜)的尿液细胞形态示意图；

图3为步骤3.4感染后第四天(4倍镜)的尿液细胞形态示意图；

图4为步骤3.4感染后第四天(10倍镜)的尿液细胞形态示意图；

图5为步骤3.4感染后第四天(20倍镜)的尿液细胞形态示意图；

图6为步骤3.4未感染尿液原代细胞第四天对照组(4倍镜)的尿液细胞形态示意图；

图7为步骤3.5感染后第六天感染后第6天，汇合度约90％的尿液细胞形态示意图；

图8为步骤4.2中两阶段诱导第七天可见克隆样生长的细胞团块示意图；

图9为步骤4.2中两阶段诱导第九天细胞团块变得更为紧密示意图；

图10为步骤4.3采用现有技术部分重编程的克隆(出现后第7天)示意图；

图11为步骤4.3中采用现有技术培养第19天出现完全重编程的克隆的示意图；

图12为步骤4.3中采用现有技术培养图11中克隆在培养第26天的示意图；

图13为步骤4.3中采用现有技术培养将图12克隆挑出后第2天的示意图；

图14为步骤4.3中采用现有技术图12中克隆挑出后第6天的示意图；

图15为步骤4.3中采用本发明的技术方案培养第6天时完全重编程的克隆(4倍镜)的示意图；

图16为步骤4.3中采用本发明的技术方案将图15中克隆挑出后第7天(10倍镜)的示意图；

图17为步骤4.3中采用本发明的技术方案得到的克隆的人胚胎干细胞表面标志物的鉴定；

图18为步骤4.3中采用本发明的技术方案得到的克隆的人胚胎干细胞多能基因的鉴定；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的部分实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征和技术方案可以相互组合。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法，包括以下步骤；

步骤一、尿液收集及尿液原代细胞的获取；

步骤二、逆转录病毒的包装；

步骤三、尿液细胞的感染；

步骤四、尿液细胞的诱导；

步骤五、克隆细胞挑出及培养；

步骤六、尿源iPSC鉴定。

实施例一：

步骤一中，尿液收集及尿液原代细胞的获取包括以下步骤：

步骤1.1尿液收集：用容量合适的无菌容器收集尿液。收集前让捐献者尽可能多饮水，若收集后不能马上处理，可预先于生物安全柜中向无菌容器中加入1ml青霉素/链霉素溶液预防细菌污染。收集前，用湿巾擦拭尿道区域，弃去前段尿，收集中段尿，收集过程中应尽量避免污染容器内壁。提高尿液量能提高产量。收集后需尽快处理，若收集后不能立即处理，需4℃保存，4小时内处理。

步骤1.2尿液分离：从尿液分离步骤开始，所有操作都应在符合细胞培养的环境中进行而避免污染。将尿液转移至50ml离心管中，如尿量多可用多个离心管。室温400g离心10分钟，小心弃去上清，管中剩约1ml，重悬后转移至新的50ml离心管中，如有多管转移至同一离心管中。加入10ml冲洗缓冲液，室温200g离心10分钟，小心弃上清，管中剩约0.2ml细胞团。加入1ml初始培养基重悬细胞团，转移细胞悬液至12孔板的1个孔中(预先包被0.1％的明胶)。再加入1毫升初始培养基，37℃培养24小时。

步骤1.3尿液细胞扩增：

材料制备：

冲洗缓冲液：冲洗缓冲液是杜氏磷酸盐缓冲液加100ug/ml原代细胞抗生素(primocin，InvivoGen,cat.no.ant-pm-1)。制备500ml缓冲液，原代细胞抗生素1ml，杜氏磷酸盐缓冲液499ml。(4℃保存，2周内用完)

0.1％明胶包被培养皿：加入适当体积的0.1％明胶到培养皿中，确保整个培养皿底面有液体覆盖，37℃孵育约30分钟后可使用。使用前吸走明胶，用磷酸盐缓冲液冲洗一次后即可使用。

初始培养基：初始培养基是杜氏改良伊格尔培养基/汉氏F-12营养培养基加10％的胎牛血清，100ug/ml原代细胞抗生素和肾上皮细胞生长培养基添加剂(Lonza,cat.no.CC-4127)。制备500ml，加胎牛血清50ml，原代细胞抗生素1ml，1套肾上皮细胞生长培养基套装添加剂，用杜氏改良伊格尔培养基/汉氏F-12营养培养基补充至500ml。(用初始培养基仔细冲洗各添加剂管子避免损失)(4℃避光保存，2周内使用)。

肾上皮细胞扩增培养基：配制500ml肾上皮细胞扩增培养基，将整套肾上皮细胞生长培养基添加剂加入500ml肾上皮细胞基础培养基中(Lonza,cat.no.CC-3190)。

间质细胞扩增培养基：间质细胞扩增培养基是高糖杜氏改良伊格尔培养基添加10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸溶液，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，5ng/ml重组人成纤维细胞生长因子,5ng/ml重组人血小板源性生长因子-AB和5ng/ml重组人表皮生长因子。配制500ml间质细胞扩增培养基，50ml胎牛血清，5ml谷氨酰胺，5ml非必需氨基酸溶液，2.5ml青霉素/链霉素溶液，5ng/ml重组人成纤维细胞生长因子,5ng/ml重组人血小板源性生长因子-AB和5ng/ml重组人表皮生长因子。0.22微米滤器过滤后，用高糖杜氏改良伊格尔培养基补充至500ml。

肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基：肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基是肾上皮细胞扩增培养基和间质细胞扩增培养基1:1比例混合，配制500毫升肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基，将250毫升肾上皮细胞扩增培养基和250毫升间质细胞扩增培养基混合(避光4℃保存，2周内使用)。

具体实施过程为：铺板后24小时，48小时，72小时各加1毫升初始培养基。勿移走任何培养基。铺板96小时后，移走大部分培养基，剩余1毫升，加1毫升肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基。每天半量换液肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基。当细胞可传代时如下图1(9～12d后，80～90％汇合度)，消化细胞到12孔板1个新的孔继续扩增(如果细胞密度高，约100000个细胞，可消化至6孔板)，这是第1代。(细胞能耐受0.25％胰酶，不使用含有血清的培养基终止，使用胰酶抑制剂)。隔天换液，当细胞达到80～90％汇合度时，按照1：4消化传代细胞到合适的培养皿继续扩增，或者铺到6孔板感染。这是第2代。(能达到最高的诱导多能干细胞产生效率的尿液细胞为第1代到第3代)为后续使用尿液细胞，用不含血清的细胞冻存液冻存细胞，可-80℃或液氮冻存。

实施例二：

步骤二中，逆转录病毒的包装包括以下步骤：

制备材料：人胚肾293T细胞培养基：杜氏改良伊格尔培养基加10％胎牛血清。

具体实施过程为：

步骤2.1：生长状况良好的人胚肾293T细胞用于逆转录病毒的包装，即其生长速率为1：3传代次日可达80％汇合率。按1：3传代铺6孔板的5个孔的人胚肾293T细胞，24小时后其细胞汇合率为80％(培养中不加抗生素，否则会降低其转染效率)。

步骤2.2：准备感染复合物，按照每孔200ul减血清培养基，4ug包装载体pCL-Ampho，4ug基因表达载体(pMXs-OCT3/4，pMXs-KLF4,pMXs-SOX2,pMXs-cMyc或pMXs-GFP1)，24ul聚乙烯亚胺。混合后静置15分钟。

步骤2.3：静置期间将人胚肾293T细胞培养基更换为提前预热至37℃的杜氏改良伊格尔培养基。15分钟后将混合物逐滴加入后轻轻晃匀。置于37℃，95％CO2坏境中培养。4h后更换为预热的有血清的培养基。

步骤2.4：转染24小时后观察pMXs-GFP孔，确保其转染效率近100％。收集另外4个孔的上清，再次加入2ml预热的人胚肾293T细胞培养基。将收集的上清经0.22μm滤器过滤，随后加入聚凝胺使其终浓度达到8ug/ml，用于第一次感染尿液细胞。24小时后第二次收集上清，经0.22微米滤器过滤后加入聚凝胺使其终浓度达到8ug/ml，用于第二次感染尿液细胞。

实施例三：

步骤三中，尿液细胞的感染包括以下步骤：

制备材料：预先基质胶包被：采用

具体实施过程为：

步骤3.1：在6孔板的每个孔内(0.1％明胶包被)铺60000个尿液细胞(第1代到第3代最佳)。接种24小时后观察尿液细胞汇合度约为30％，移去培养基加2ml新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基。随后每孔加入第二步第4条中第一次收集的四因子的病毒上清共8ml。37℃，95％CO2坏境中培养。

步骤3.2：12-16小时后，移去培养基，每孔加2ml新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基让细胞恢复。8-12小时后，每孔加入第二步第4条中第二次收集的四因子的病毒上清共8ml，第二次感染。37℃，95％CO2坏境中培养。

步骤3.3：二次感染12小时后，移去培养基加2ml新的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基。继续培养，每天更换新鲜的肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基。

步骤3.4：每天显微镜观察被感染的尿液细胞。四因子感染后的尿液细胞形态会发生明显改变(如图2-6，细胞变得更小，更紧密，同时扩增能力会明显增强)。如果感染后细胞形态改变不明显，可能是由于细胞感染后衰老，使用早期代次的尿液细胞这种概率会降低)

对比感染后第3天到第4天可见，细胞增殖能力明显增强。感染后第4天与对照组相比，可见感染后细胞形态的改变，包括细胞变短变小，细胞排列更为紧密。

步骤3.5：当尿液细胞形态改变明显，达到80～90％汇合度时，使用0.25％胰酶消化，10ml的人肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基终止消化后室温200g离心5分钟。弃去上清后用4ml肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基重悬后计数，6孔板每孔(预先基质胶包被)铺10万个感染后的尿液细胞，添加人肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基至2ml，此为培养第1天。此后及诱导过程均为隔天换液。诱导过程及其后的诱导多能干细胞培养过程的换液，均需将培养基提前置于37℃预热。

需要指出的是：现有技术在此步骤中，需要在消化尿液细胞前1～2天用处理后的小鼠胚胎成纤维细胞铺板。而小鼠胚胎成纤维细胞的处理，首先需要取怀孕13.5天的CF-1雌鼠胎鼠的躯干剪碎并用胰酶消化后培养得到原代细胞，随后在原代细胞生长到第三代时，采用丝裂霉素C处理，而丝裂霉素的浓度和处理的时间都需要进行条件优化，使处理后的细胞失去分裂增殖能力，但能分泌多种细胞因子，包括促有丝分裂因子和细胞分化抑制因子。除了丝裂霉素C外还能采用γ射线处理小鼠胚胎成纤维细胞，但是需要额外的设备，即辐射仪，同时也需要对辐射的强度和时间进行条件优化。整个制备过程，难点包括：1、需要准确判断CF-1雌鼠怀孕的时间；2、需要根据各实验室条件摸索丝裂霉素C或者γ射线的最佳处理条件；3、由于处理后的小鼠胚胎成纤维细胞不具备增殖能力，需要不断制备新的小鼠胚胎成纤维细胞。除了制备过程的繁琐外，采用异体来源的小鼠胚胎成纤维细胞来进行人诱导多能干细胞的诱导，存在交叉污染的问题。因此，在这一步，采用商品化的基质胶来进行替代，不仅简化了实验步骤，还避免了鼠源细胞对诱导多能干细胞的污染。

实施例四：

步骤四中，尿液细胞的感染包括以下具体实施步骤：

步骤4.1：采用两阶段诱导法对感染后的尿液细胞进行诱导，第一阶段在肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基中添加五种小分子，包括A-83-01，CHIR99021，thiazovivin，cyclic pifithrin-α，sodium butyrate(ACTPN)；第二阶段在mTeSR

步骤4.2：培养第2天不用换液，培养第3天至第10天采用肾上皮细胞/间质细胞扩增培养基+ACTPN，隔天换液；培养第11天至第18天采用mTeSRTM1+ACTPNPD，隔天换液。在培养过程中，会逐渐出现克隆样生长的细胞团，排列紧密，边界清晰，细胞核质比增大。

步骤4.3：培养第19天开始用mTeSRTM1培养基培养，每天换液。

需要指出的是：现有技术中，从培养第3天起，用添加丙戊酸钠(终浓度1mM)的人胚胎干细胞/胎牛血清培养基培养，每天换液，第10天起，用人胚胎干细胞/胎牛血清培养基培养，每天换液，第17天起，用mTeSR

本发明提出的方法在一次诱导中，同样种植了10万个感染后的尿液细胞，几乎不见部分重编程的克隆，而真正的克隆开始出现的时间早，最早在培养第6天可以开始挑克隆(参见图15-16)，克隆多，共挑到了12个克隆。由此可见，本发明提出的技术方案效率更高，同时更节省时间。

实施例五：

步骤五中，克隆细胞挑出包括以下具体实施步骤：

在第四步培养过程中，当克隆样生长的团块存在排列紧密、边界清晰、细胞核质比增大等特征，且团块面积大于1厘米*1厘米时，可以将克隆挑出(克隆过小时挑出克隆可能引起克隆分化)。可以用灭菌枪头在显微镜下将克隆挑出至预先铺好基质胶的12孔板中，置于细胞培养箱中48h内避免扰动，其后每天更换mTeSR

实施例六：

步骤六中，尿源iPSC表达人胚胎干细胞的表面标志物，包括SSEA4、NANOG、TRA1-60、TRA1-81(参见附图17)。尿源iPSC(uiPSC)表达人胚胎干细胞(hES)表达的多能基因，包括OCT4、SOX2、KLF4、MYC，尿液细胞(urine)作为对照(参见附图18)。

以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但本发明不局限于上述具体实施方式，因此任何对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均涵盖在本发明的权利要求范围当中。