一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株及其菌剂生产方法

技术领域

本发明涉及生物高技术领域，特别涉及一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株及其菌剂生产方法。

背景技术

化学农药是世界农业迅速发展和粮食安全的重要保障，在农业生产的现代化进程中起了不可估量的作用。芳氧苯氧丙酸酯(Aryloxyphenoxy propanoate，AOPP)类除草剂是最近四十年发展起来的高活性新型除草剂，因其高效、低毒、广谱、高选择性、对后茬作物安全等优异特点成为我国使用较为广泛的除草剂之一。

精喹禾灵(quizalofop-P-ethyl，QE)，又名精禾草克，为常见、高效的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂，其水溶性小、吸附性强，容易在土壤中沉积。除草剂的残留无论对于土壤生物、水生生物还是对哺乳动物和人都会带来严重的毒害。已有研究表明精喹禾灵可损伤大鼠睾丸生殖细胞，具有雄性生殖毒性。随着人们生活水平的提高和环境保护意识的增强，有关农药残留带来的直接危害和潜在影响目益受到关注，人们迫切需要无农药残留污染的清洁的绿色农产品。

生物降解是农药在环境中的一类重要转化过程。微生物由于大量存在于自然界、并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了重要作用。利用微生物的新陈代谢作用，对易残留的农药进行转化，使其无毒化，也是目前研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于：提供了一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株及其菌剂生产方法，针对环境修复的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留修复菌剂，使用本菌剂可以使精喹禾灵、精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵等芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的残留量降低85％以上，且生产和使用成本较低。

本发明采用的技术方案如下：

一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株，分类命名为Sphingobium sp.，已于2019年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2019847。菌株QE-1的形态学特征为在LB平板上呈橙黄色，菌落凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明。主要生物学特性为G-，菌体为杆状，大小约0.9μm宽，1.7μm长，无鞭毛，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；吲哚反应阴性；不能水解淀粉，氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛乳酸凝固。

使用上述除草剂残留降解菌生产菌剂的工艺为：斜面种-摇瓶种-种子罐-生产罐-产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。

一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株的菌剂生产方法，包括以下步骤：

S1：将精喹禾灵降解菌QE-1的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

S2：将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期；种子罐所用的培养基配方为：7～9g/L的葡萄糖，4～6g/L的酵母膏，0.5～1.5g/L的K

S3：将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与步骤S2所述的种子罐培养基相同；

S4：在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6～1.2，搅拌速度为180～240转/分，培养温度为34～36℃，全流程培养时间为96～108小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

进一步地，所述步骤S2中，种子罐所用的培养基配方为：8g/L的葡萄糖，5g/L的酵母膏，1g/L的K

进一步地，所述步骤S4中培养温度为35℃。

本发明所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株QE-1在降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂中的应用，优选在降解土壤中芳氧苯氧丙酸酯类除草剂中的应用。

其中，所述的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂优选精喹禾灵、精恶唑禾草灵或精吡氟禾草灵，进一步优选精喹禾灵。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明提供一株能够高效、快速降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的细菌QE-1，细菌QE-1为鞘氨醇杆菌；降解菌QE-1具有广泛的降解谱，能降解精喹禾灵、精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵等芳氧苯氧丙酸酯类除草剂，并能在96小时内降解完20mg/L的精喹禾灵，具有广泛的应用潜力和价值。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。

本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义，使用该降解菌剂可以在农作物播种前正常使用化学农药进行杂草防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。

本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1为本发明中菌株QE-1的菌落照片(A)和电镜照片(B)；

图2为本发明中菌株QE-1的16S rRNA基因系统发育分析；

图3为本发明中菌株QE-1对精喹禾灵的降解；

图4为本发明中温度对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响；

图5为本发明中初始pH对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响；

图6为本发明中接种量对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响；

图7为本发明中金属离子对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响；

图8为本发明中菌株QE-1的底物谱液相检测效果图；

本发明所述的生物材料，其分类命名为Sphingobium sp.QE-1，其中QE-1菌株编号，已于2019年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M2019847，保藏地址为中国湖北省武汉市，武汉大学中国典型培养物保藏中心。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

下面结合图1至图8对本发明作详细说明。

实施例1

芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株Sphingobium sp.的分离与鉴定：

本发明提供一种能高效降解芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的菌株及通过其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色阴性菌QE-1，名称为鞘氨醇杆菌，分离自江苏南京某废弃农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：

取土样5.0g加入到100mL含有30mg/L精喹禾灵的液体无机盐培养基(以下简称MSM)，30℃、180rpm摇床培养7d，以5％接种量(v/v)转接至新鲜的同一培养基中，连续富集培养四次。将第五代富集液在含有30mg/L精喹禾灵的无机盐固体培养基上稀释涂布，30℃培养5d，挑取平板上的单菌落于3mL液体LB试管培养基中，然后保存并转接至20mL含有30mg/L精喹禾灵的MSM培养基中，30℃培养5d，用等体积的二氯甲烷萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得精喹禾灵降解菌株。

2019年10月22日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M2019847，经鉴定属于Sphingobium sp.。菌株QE-1的形态学特征为在LB平板上呈橙黄色菌，菌落凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明(图1A)。主要生物学特性为G-，菌体为杆状，大小约0.9μm宽，1.7μm长，无鞭毛(图1B)，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；吲哚反应阴性；不能水解淀粉，氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛乳酸凝固。将菌株QE-1的16S rRNA基因序列在数据库EzBilCloud中比对分析，结果显示菌株QE-1与Sphingobium属亲缘关系最近，其中与Sphingobiumxenophagum NBRC 107872T相似性达99.93％，与Sphingobiumterrigena EO9T相似性达98.02％。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16S rRNA基因比对分析，菌株QE-1初步鉴定为Sphingobium属(图2)。

实施例2

芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株Sphingobium sp.的实验室降解实验：

(1)种子液制备

将菌株QE-1接入100mL LB培养基中，30℃、180rpm摇床培养，48h后6000rpm离心收集菌体，使用MSM洗涤菌体两次，最后用10mLMSM重悬，作为种子液备用。

(2)菌株QE-1对除草剂精喹禾灵的降解

将菌株QE-1按3％的接种量接至含有20mg/L精喹禾灵的100mL MSM中，30℃、180rpm摇床培养，每隔12小时取样3mL，取至第4天。检测精喹禾灵残留量，计算降解率，绘制菌株QE-1对精喹禾灵除草剂的时间-降解曲线。如图2，菌株QE-1能在96h内降解20mg/L的精喹禾灵。

高效液相色谱法检测精喹禾灵：取3mL样品，加入等体积的二氯甲烷进行萃取，漩涡震荡2min后静置，待水相与有机相呈现明显分层，去除上层水相，并向下层有机相中加入适量无水硫酸钠以除去残余水分，吸取2mL处理完毕的有机相到离心管中并将其放置于通风橱，直至二氯甲烷挥发完全，随后向离心管中加入300μL甲醇，震荡混匀，用直径为0.22μm的有机相滤器过滤后在液相色谱仪上检测。液相色谱仪型号为Dionex UltiMate 3000，使用条件为：C18反相柱，柱温为40℃，流速为1mL/min，流动相为甲醇∶水∶乙酸(80∶20∶0.5，v/v/v)，紫外检测波长为230nm和280nm，进样量为20μL。

(3)温度对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响

在添加精喹禾灵终浓度为20mg/L的MSM培养基中，按3％接种量接入菌株QE-1种子液，分别于4、16、25、30、37和45℃条件下，180rpm摇床培养，3d后取样检测精喹禾灵残留量，计算降解率，确定温度对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响。图4所示，菌株QE-1在30℃时对精喹禾灵降解率最高。

(4)初始pH对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响

在初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的MSM培养基中，加入20mg/L的精喹禾灵，按3％接种量接入菌株QE-1的种子液，于30℃、180rpm摇床培养，3d后取样检测精喹禾灵残留量，计算降解率，确定pH对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响。以不接种降解菌株为对照。由图5所示，菌株QE-1在pH 7.0时对精喹禾灵的降解效果最好；在pH 6.0-8.0的范围内均能较好的降解精喹禾灵；而当pH小于5.0和pH大于9.0时，其降解能力明显下降。

(5)接种量对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响

按1％、2％、3％、4％、5％与6％的接种量分别接入含20mg/L精喹禾灵的MSM培养基中，30℃、180rpm摇床培养，48h时测定一次精喹禾灵的含量。由图6所示，接种量的大小对精喹禾灵的降解效率有直接的关系，接种量越大，精喹禾灵的降解效率就越高。

(6)金属离子对菌株QE-1降解精喹禾灵的影响

按3％接种量分别接入含不同金属离子(Mg

(7)菌株QE-1的底物谱

按3％接种至分别含不同底物(精喹禾灵、精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵、氰氟草酯、炔草酯)的MSM培养基中，于30℃、180rpm摇床培养5d后，HPLC检测不同底物的降解情况(图8)。结果显示菌株QE-1可以降解精喹禾灵、精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵、氰氟草酯、炔草酯。

实施例3

芳氧苯氧丙酸酯类除草剂降解菌株Sphingobium sp.的土壤降解实验：

采取菜园土作为供试土样，将土样过2mm筛，分别取一定量的精喹禾灵、精恶唑禾草灵和精吡氟禾草灵粉剂溶于10mL甲醇中，然后浸泡硅藻土，使农药被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中农药的浓度约为2mg/kg。每一种土样各取500g于30℃恒温培养箱中培养，按10％的接种量接入种子液，以不接菌的作为对照，土壤的持水量保持在60％。培养7天后，HPLC测定残留量，测定结果如表1。

从表1可以得出，经过7天培养，菌株QE-1对精喹禾灵、精恶唑禾草灵和精吡氟禾草灵的降解率分别达到88.6％、86.2％和86.8％。以上结果说明，菌株QE-1在施入土壤中后，没有出现不降解或降解效率急剧下降的现象，其降解性能稳定，这就为菌株QE-1对精喹禾灵、精恶唑禾草灵和精吡氟禾草灵污染的土壤修复提供了科学依据。

表1：菌株QE-1在土壤中对相关农药的降解

实施例4

本发明的详细实施步骤为：

将本发明的取代脲类除草剂降解菌QE-1的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基(LB培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1L，pH 7.4)的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50L，投料量40L，培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH

葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K

投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50L一级种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为22转/分，无菌空气通入量为1∶0.8；将到达对数期的种子液按10％的接种量接入二级种子罐；二级种子罐500L，投料量400L，培养基配方和培养条件与一级种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同；生产罐容量5吨，投料量4.5吨；投料后的生产罐1.1kg/cm

以上所述，仅为本发明的优选实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。