一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法

技术领域

本发明属于长茎葡萄蕨藻多糖提取技术领域，具体涉及一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法。

背景技术

长茎葡萄蕨藻为绿藻的一属, 俗称海葡萄（学名：Caulerpa lentillifera）原生于琉球，它的直立枝外形类似葡萄，其藻体可分为匍匐茎、直立枝和丝状假根三部分，球形小枝布满整个直立枝主轴。整个藻体为一个多核细胞，虽然有多数细胞核存在但彼此之间没有细胞壁相隔。长茎葡萄蕨藻是一种营养丰富的食用绿藻，含人体所需的多种氨基酸、多糖与维生素，ω-6脂肪酸如油酸，花生四烯酸等，长茎葡萄蕨藻中的必需氨基酸/非必需氨基酸（EAA/NEAA）为54.36%～69.75%，必需氨基酸/总氨基酸（EAA/TAA）为35.22%～48.19%，总酚含量2.04mg/g，黄酮类化合物含量4.93mg/g，维生素E0.22mg/kg～0.31mg/kg，维生素C3.47mg/kg～5.03mg/kg，粗纤维1.91%～12.98%，粗脂肪0.81%～4.40%，蛋白9.22%～19.38%，灰分含量24.00%～56.08%；长茎葡萄蕨藻多糖主要为硫酸多糖，其含量为34.00%～64.97%，单糖组成中，甘露糖、半乳糖和木糖的含量最高，分别为28.38%～48.26%、28.47%～49.93%和13.32%～59.8%。研究表明，长茎葡萄蕨藻多糖具有α-葡萄糖苷酶抑制作用和抗氧化作用，还具有免疫调节作用，长茎葡萄蕨藻对巨噬细胞有免疫刺激活性，具有广泛的应用价值和前景。然而，目前分离提取长茎葡萄蕨藻多糖时，采用水提醇沉法和碱提法的提取方法，其存在多糖得率低、成本高、制备流程复杂等问题，以至于生产效率低、产品品质差，阻碍了长茎葡萄蕨藻多糖的应用和推广。

发明内容

针对上述不足，本发明公开了一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，提高长茎葡萄蕨藻多糖的提取率，具有易制备、低成本、无污染、高得率等优点。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，其包括以下步骤：

（1）用海水清洗长茎葡萄蕨藻，然后再用蒸馏水洗涤3次，接着置于烘箱中在50℃下干燥，然后粉碎过50目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末，将长茎葡萄蕨藻粉末干燥保存备用；

（2）取长茎葡萄蕨藻粉末加入超纯水均匀混合得到混合液A，所述长茎葡萄蕨藻粉末的质量与超纯水的体积的比为1g:（40～50）ml，然后调节混合液A的pH为6，并且加入木瓜蛋白酶，再在40～60℃下提取2～4h得到混合液B，所述木瓜蛋白酶的加入量为混合液A质量的1～2.5%；

（3）将经过步骤（2）得到的混合液B在沸水水浴的条件下灭酶5min，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后分离得到上清液和藻渣；将上清液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下负压浓缩至浓度为1g/ml，得到浓缩提取液，浓缩提取液自然冷却至室温后加入体积分数为95%的乙醇得到混合液C，所述乙醇的加入体积为浓缩提取液体积的5倍；将混合液C置于4℃下醇沉12h，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后弃去上层乙醇，收集得到沉淀A；

（4）将步骤（3）中得到的藻渣依次按照步骤（2）和步骤（3）进行提取得到沉淀B，将沉淀A和沉淀B合并后完全溶解在超纯水中得到混合液D，将混合液D冷冻干燥36h后，即得到长茎葡萄蕨藻多糖。

进一步的，在步骤（2）中，通过向所述混合液A中加入质量浓度为10%的盐酸或质量浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH至6。

进一步的，在步骤（2）所述的提取过程中，每隔30min搅拌一次混合液A，每次搅拌2min。

本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：

本发明针对长茎葡萄蕨藻的生理结构和营养组成，采用添加木瓜蛋白酶进行酶解，科学控制提取过程中影响提取率的料液比、提取温度、提取时间、木瓜蛋白酶的加入量，总提取次数等各个因素参数，再结合优化的醇沉工艺，形成一整套完善的长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，提高长茎葡萄蕨藻多糖的提取率，使得长茎葡萄蕨藻多糖的提取率达到40%以上，而且还具有易制备、低成本、无污染、高得率的优点，并且本发明方法工艺简单、操作方便，容易控制，适合长茎葡萄蕨藻多糖的规模化、自动化生产。

附图说明

图1是实验例1单因素试验中步骤（2）得到的结果图。

图2是实验例1单因素试验中步骤（3）得到的结果图。

图3是实验例1单因素试验中步骤（4）得到的结果图。

图4是实验例1单因素试验中步骤（5）得到的结果图。

图5是实验例1单因素试验中步骤（6）得到的结果图。

图6是实验例2中长茎葡萄蕨藻多糖提取 Box-Behnken 试验设计及结果。

图7是实验例2中响应面二次模型多糖得率的方差和回归系数分析的结果。

图8是实验例2中料液比与提取时间对长茎葡萄蕨藻多糖提取率的影响分析图。

图9是实验例2中料液比与提取温度对长茎葡萄蕨藻多糖提取率的影响分析图。

图10 是实验例2中提取时间与提取温度对长茎葡萄蕨藻多糖提取率的影响分析图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，其包括以下步骤：

（1）用海水清洗长茎葡萄蕨藻，然后再用蒸馏水洗涤3次，接着置于烘箱中在50℃下干燥，然后粉碎过50目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末，将长茎葡萄蕨藻粉末干燥保存备用；

（2）取长茎葡萄蕨藻粉末加入超纯水均匀混合得到混合液A，所述长茎葡萄蕨藻粉末的质量与超纯水的体积的比为1g:45ml，然后通过向所述混合液A中加入质量浓度为10%的盐酸或质量浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH至6，并且加入木瓜蛋白酶，再在60℃下提取3h，其中每隔30min搅拌一次混合液A，每次搅拌2min，得到混合液B，所述木瓜蛋白酶的加入量为混合液A质量的2%；

（3）将经过步骤（2）得到的混合液B在沸水水浴的条件下灭酶5min，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后分离得到上清液和藻渣；将上清液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下负压浓缩至浓度为1g/ml，得到浓缩提取液，浓缩提取液自然冷却至室温后加入体积分数为95%的乙醇得到混合液C，所述乙醇的加入体积为浓缩提取液体积的5倍；将混合液C置于4℃下醇沉12h，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后弃去上层乙醇，收集得到沉淀A；

（4）将步骤（3）中得到的藻渣依次按照步骤（2）和步骤（3）进行提取得到沉淀B，将沉淀A和沉淀B合并后完全溶解在超纯水中得到混合液D，将混合液D冷冻干燥36h后，即得到长茎葡萄蕨藻多糖。

实施例2：

一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，其包括以下步骤：

（1）用海水清洗长茎葡萄蕨藻，然后再用蒸馏水洗涤3次，接着置于烘箱中在50℃下干燥，然后粉碎过50目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末，将长茎葡萄蕨藻粉末干燥保存备用；

（2）取长茎葡萄蕨藻粉末加入超纯水均匀混合得到混合液A，所述长茎葡萄蕨藻粉末的质量与超纯水的体积的比为1g:50ml，然后通过向所述混合液A中加入质量浓度为10%的盐酸或质量浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH至6，并且加入木瓜蛋白酶，再在60℃下提取4h，其中每隔30min搅拌一次混合液A，每次搅拌2min，得到混合液B，所述木瓜蛋白酶的加入量为混合液A质量的2.5%；

（3）将经过步骤（2）得到的混合液B在沸水水浴的条件下灭酶5min，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后分离得到上清液和藻渣；将上清液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下负压浓缩至浓度为1g/ml，得到浓缩提取液，浓缩提取液自然冷却至室温后加入体积分数为95%的乙醇得到混合液C，所述乙醇的加入体积为浓缩提取液体积的5倍；将混合液C置于4℃下醇沉12h，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后弃去上层乙醇，收集得到沉淀A；

（4）将步骤（3）中得到的藻渣依次按照步骤（2）和步骤（3）进行提取得到沉淀B，将沉淀A和沉淀B合并后完全溶解在超纯水中得到混合液D，将混合液D冷冻干燥36h后，即得到长茎葡萄蕨藻多糖。

实施例3：

一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，其包括以下步骤：

（1）用海水清洗长茎葡萄蕨藻，然后再用蒸馏水洗涤3次，接着置于烘箱中在50℃下干燥，然后粉碎过50目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末，将长茎葡萄蕨藻粉末干燥保存备用；

（2）取长茎葡萄蕨藻粉末加入超纯水均匀混合得到混合液A，所述长茎葡萄蕨藻粉末的质量与超纯水的体积的比为1g:40ml，然后通过向所述混合液A中加入质量浓度为10%的盐酸或质量浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH至6，并且加入木瓜蛋白酶，再在50℃下提取3h，其中每隔30min搅拌一次混合液A，每次搅拌2min，得到混合液B，所述木瓜蛋白酶的加入量为混合液A质量的2%；

（3）将经过步骤（2）得到的混合液B在沸水水浴的条件下沸水灭酶5min，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后分离得到上清液和藻渣；将上清液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下负压浓缩至浓度为1g/ml，得到浓缩提取液，浓缩提取液自然冷却至室温后加入体积分数为95%的乙醇得到混合液C，所述乙醇的加入体积为浓缩提取液体积的5倍；将混合液C置于4℃下醇沉12h，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后弃去上层乙醇，收集得到沉淀A；

（4）将步骤（3）中得到的藻渣依次按照步骤（2）和步骤（3）进行提取得到沉淀B，将沉淀A和沉淀B合并后完全溶解在超纯水中得到混合液D，将混合液D冷冻干燥36h后，即得到长茎葡萄蕨藻多糖。

实施例4：

一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，其包括以下步骤：

（1）用海水清洗长茎葡萄蕨藻，然后再用蒸馏水洗涤3次，接着置于烘箱中在50℃下干燥，然后粉碎过50目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末，将长茎葡萄蕨藻粉末干燥保存备用；

（2）取长茎葡萄蕨藻粉末加入超纯水均匀混合得到混合液A，所述长茎葡萄蕨藻粉末的质量与超纯水的体积的比为1g:40ml，然后通过向所述混合液A中加入质量浓度为10%的盐酸或质量浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH至6，并且加入木瓜蛋白酶，再在40℃下提取2h，其中每隔30min搅拌一次混合液A，每次搅拌2min，得到混合液B，所述木瓜蛋白酶的加入量为混合液A质量的1%；

（3）将经过步骤（2）得到的混合液B在沸水水浴的条件下灭酶5min，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后分离得到上清液和藻渣；将上清液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下负压浓缩至浓度为1g/ml，得到浓缩提取液，浓缩提取液自然冷却至室温后加入体积分数为95%的乙醇得到混合液C，所述乙醇的加入体积为浓缩提取液体积的5倍；将混合液C置于4℃下醇沉12h，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后弃去上层乙醇，收集得到沉淀A；

（4）将步骤（3）中得到的藻渣依次按照步骤（2）和步骤（3）进行提取得到沉淀B，将沉淀A和沉淀B合并后完全溶解在超纯水中得到混合液D，将混合液D冷冻干燥36h后，即得到长茎葡萄蕨藻多糖。

实施例5：

一种长茎葡萄蕨藻多糖的提取方法，其包括以下步骤：

（1）用海水清洗长茎葡萄蕨藻，然后再用蒸馏水洗涤3次，接着置于烘箱中在50℃下干燥，然后粉碎过50目筛得到长茎葡萄蕨藻粉末，将长茎葡萄蕨藻粉末干燥保存备用；

（2）取长茎葡萄蕨藻粉末加入超纯水均匀混合得到混合液A，所述长茎葡萄蕨藻粉末的质量与超纯水的体积的比为1g:45ml，然后通过向所述混合液A中加入质量浓度为10%的盐酸或质量浓度为5%的氢氧化钠溶液调节pH至6，并且加入木瓜蛋白酶，再在50℃下提取4h，其中每隔30min搅拌一次混合液A，每次搅拌2min，得到混合液B，所述木瓜蛋白酶的加入量为混合液A质量的2.5%；

（3）将经过步骤（2）得到的混合液B在沸水水浴的条件下灭酶5min，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后分离得到上清液和藻渣；将上清液置于旋转蒸发器中，在50℃条件下负压浓缩至浓度为1g/ml，得到浓缩提取液，浓缩提取液自然冷却至室温后加入体积分数为95%的乙醇得到混合液C，所述乙醇的加入体积为浓缩提取液体积的5倍；将混合液C置于4℃下醇沉12h，然后在离心力为3500xg的条件下离心15min后弃去上层乙醇，收集得到沉淀A；

（4）将步骤（3）中得到的藻渣依次按照步骤（2）和步骤（3）进行提取得到沉淀B，将沉淀A和沉淀B合并后完全溶解在超纯水中得到混合液D，将混合液D冷冻干燥36h后，即得到长茎葡萄蕨藻多糖。

实验例1：

多糖标准曲线的绘制：

精确称量10mg标准葡萄糖置于100ml容量瓶中定容；取7支具塞玻璃试管，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml及1.0m的葡萄糖溶液，并用超纯水补足体积至1.0ml，充分混匀后迅速置于冰浴中冷却5min，取出后加入现配的0.2%蒽酮硫酸溶液，摇匀，立即置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温，在492nm波长下测定OD值；以标准葡萄糖含量（微克）为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为：Y=0.0034x+0.0841，R2=0.9992。

长茎葡萄蕨藻多糖提取率的测定：

将长茎葡萄蕨藻多糖溶解于超纯水中，接着加入超纯水进行稀释，再精确吸取1ml置于具塞玻璃试管中（每个样品设置三个重复），然后迅速置于冰浴中冷却5min，取出后加入现配的0.2%蒽酮硫酸溶液，摇匀，立即置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温，在492nm波长下测定OD值；根据标准曲线计算多糖浓度，再按照下列公式计算长茎葡萄蕨藻样品中的多糖提取率：

长茎葡萄蕨藻多糖提取率=（多糖浓度×待测体积×稀释倍数/多糖样品的质量）×多糖得率×100%

单因素试验：

（1）取10g长茎葡萄蕨藻粉末加入200ml超纯水得到混合液A，加入质量为混合液A质量的2.5%的木瓜蛋白酶，在60℃下提取2h，pH为6，其中每隔30min搅拌一次混合液A，每次搅拌2min；提取结束后在沸水水浴的条件下灭酶5min，接着再离心力为3500xg的条件下离心15min，收集上清液和藻渣；将上清液置于旋转蒸发仪中，在50℃下负压浓缩，得到10ml浓缩提取液，接着加入50ml的体积分数为95%的乙醇，然后在4℃下醇沉12h，接着在离心力为3500xg的条件下离心15min后弃去上层酒精，收集沉淀溶解在50ml超纯水中，冷冻干燥36h后收集得到长茎葡萄蕨藻多糖并称重。

（2）按照步骤（1）所述方法，分别取10g长茎葡萄蕨藻粉末加入100ml、200ml、300ml、400ml、500ml的超纯水得到混合液A，制备得到长茎葡萄蕨藻多糖并称重，然后按照上述方法计算多糖浓度，再按照上述公式计算长茎葡萄蕨藻样品中的多糖提取率，具体结果见图1。

由图1可见，料液比过低时，长茎葡萄蕨藻粉末加入水中使溶液呈米糊状，溶液接近饱和，多糖可溶出的空间变小，因而多糖提取率较低，当料液比为1:40时，长茎葡萄蕨藻多糖提取率达到最大，之后随着料液比的増高而降低，因为当过高的料液比会使杂质含量增高，从而降低多糖提取率。

（3）按照步骤（1）所述方法，取10g长茎葡萄蕨藻粉末加入200ml超纯得到混合液A，加入质量为混合液A质量的2.5%的木瓜蛋白酶，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的温度下进行提取2h，制备得到长茎葡萄蕨藻多糖并称重，然后按照上述方法计算多糖浓度，再按照上述公式计算长茎葡萄蕨藻样品中的多糖提取率，具体结果见图2。

因为温度能影响木瓜蛋白酶的活性，从而影响多糖的提取率。从图2可见，当温度小于50℃时，长茎葡萄蕨藻多糖提取率随着温度的升高而提高，这是由于温度升高会加剧酶与底物的碰撞，酶与底物接触的几率增加，从而提高了多糖提取率。当温度达到50℃时，木瓜蛋白酶活性最大，多糖提取率达到顶峰。温度大于50℃后，酶结构在高温下被破坏，酶活性随着温度的升高而降低，多糖提取率也随之逐渐降低。

（4）按照步骤（1）所述方法，取10g长茎葡萄蕨藻粉末加入200ml超纯水得到混合液A，加入质量为混合液A质量的2.5%的木瓜蛋白酶，分别在60℃下进行提取，提取时间分别为1h、2h、3h、4h、5h，制备得到长茎葡萄蕨藻多糖并称重，然后按照上述方法计算多糖浓度，再按照上述公式计算长茎葡萄蕨藻样品中的多糖提取率，具体结果见图3。

由图3可见，随着提取时间的延长，长茎葡萄蕨藻多糖提取率增加，但提取时间超过3h后，多糖提取率降低，这是由于提取时间过长会导致多糖结构的改变或者糖苷键的裂解。

（5）按照步骤（1）所述方法，取10g长茎葡萄蕨藻粉末加入200ml超纯水得到混合液A，分别加入质量为混合液A质量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的木瓜蛋白酶，制备得到长茎葡萄蕨藻多糖并称重，然后按照上述方法计算多糖浓度，再按照上述公式计算长茎葡萄蕨藻样品中的多糖提取率，具体结果见图4。

由图4可见，随着木瓜蛋白酶添加量的增多，长茎葡萄蕨藻多糖提取率呈上升趋势，在添加量达到2%之后，多糖提取率趋于平稳，这是因为当酶的用量上升到一定浓度之后达到饱和，此时没有多余的底物再有机会与酶反应。因此，为了节省成本，确定最佳的木瓜蛋白酶添加量为2%。

（6）按照步骤（1）所述方法提取得到长茎葡萄蕨藻多糖后，再按照相同的方法对收集的藻渣重复多次提取长茎葡萄蕨藻多糖，提取的次数分别为0次、1次、2次、3次，总提取次数分别为1次、2次、3次，4次，合并全部提取得到的长茎葡萄蕨藻多糖，然后按照上述方法计算多糖浓度，再按照上述公式计算长茎葡萄蕨藻样品中的多糖提取率，具体结果见图5。

由图5可见，总提取次数提升至2次时，长茎葡萄蕨藻多糖提取率明显增高。当总提取次数大于2次后，多糖提取率略有降低且基本保持不变。因此，为了节约成本，提高效率，提取次数确定为2次。

实验例2：

响应面试验：

（1）根据单因素试验结果，按照实施例1中所述方法，固定木瓜蛋白酶添加量为混合液A质量的2%，总提取次数为2次。随后应用Design-Eepert.V8.0.6软件考察料液比（长茎葡萄蕨藻粉末和超纯水的比）、提取温度和提取时间对长茎葡萄蕨藻多糖提取率的影响，试验设计及结果见图6。

（2）建立回归方程及方差分析：

利用Design-Expert 8.0.6软件对图6中的数据进行多元回归拟合，得到二次项回归方程：Y=+41.63+4.97*A+0.15*B+0.74*C+0.27*A*B+0.77*A*C+0.32*B*C-6.02*A

为了检验长茎葡萄蕨藻多糖提取工艺回归模型的有效性，对该模型进行方差分析，结果见图7。回归模型

该回归模型中的自变量一次项A和二次项A

（3）各因素之间的交互作用

根据回归方程，使用Design-Expert 8.0.6软件绘制3D响应面图和等高线图，并分析各因素之间的相互作用对长茎葡萄蕨藻多糖提取率之间的关系，结果见图8～10。响应面图的陡缓程度可以反映提取体系中单个因素对多糖提取率的影响程度，响应面图越陡峭，说明该因素对多糖提取率的影响越大，反之则越小。等高线之间的间距也是判断某因素对多糖提取率影响是否显著的重要依据，等高线越密集，表明该因素对多糖提取率的影响程度就越大，反之则越小。此外，等高线越接近于圆形，则表明两因素之间的交互作用不显著，反之接近椭圆形则显著。

由此可见，本次实验中，AB、AC、BC三组等高线图均接近于圆形，表明料液比与提取时间、料液比与提取温度、提取时间与提取温度中的两因素间均没有显著影响，这与方差分析的结果相符。根据图8和图9，可知料液比的响应面图弯曲较大，料液比轴的等高线也更密集，表明料液比对长茎葡萄蕨藻多糖提取率的影响较大，符合方差分析的结果。

（4）响应面试验方案优化及结果验证

利用Design-Expert 8.0.6软件对回归模型方程进行偏导数分析，结果表明长茎葡萄蕨藻多糖的最佳提取工艺为：料液比1:44.77，提取温度60℃，提取时间3.08h，固定木瓜蛋白酶添加量为混合液A质量的2%，总提取次数为2次，此条件下长茎葡萄蕨藻多糖最大理论提取率为41.4068%。考虑到实验和生产的可操作性，将优化条件调整为：料液比1：45，提取温度60℃，提取时间3h，固定木瓜蛋白酶添加量为混合液A质量的2%，总提取次数为2次。在此条件下按照实施例1所述方法进行3次平行试验，长茎葡萄蕨藻多糖的实际提取率为（40.2253+0.89）%，与预测值仅相差1.18，表明该模型可以较好地模拟长茎葡萄蕨藻多糖的提取工艺并预测提取率。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。